Summary
Este artigo descreve os procedimentos de um ensaio de metástase experimental que é usado para determinar o potencial metastático de linhagens de células humanas de câncer.
Abstract
Metástase é a principal causa de morte em pacientes com câncer. Para entender o mecanismo de metástases, um ensaio de metástase experimental foi estabelecida usando camundongos imunodeficientes. Este artigo delineia os procedimentos envolvidos neste ensaio, incluindo a preparação da amostra, injeção intravenosa, e a cultura de células de metástases pulmonares. Resumidamente, um número pré-determinado de células humanas de câncer foram preparados
Protocol
1. Preparação da Amostra
- Cultivar células confluentes para ~ 70% em seus meios específicos, com fatores de crescimento ou FBS (por exemplo, DMEM com SFB 10% para MC-1 células). Aspirar a mídia da placa e lavar cuidadosamente várias vezes com um x PBS (8 g / L de NaCl, 0,2 g / L de KCl, 1,15 g / L de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 0,2 g / L de KH 2 PO 4, pH 7,3).
- Aspirar PBS e adicionar 2 ml de tripsina 0,05% em versene (0,014 g / L de vermelho de fenol e 0,2 g / L de EDTA-Na em 1 x PBS, pH 7,2). Agite levemente placa para facilitar o desapego célula de prato. Observe as células sob um microscópio. Ele normalmente leva 2-5 minutos para as células de separar.
- Adicionar um volume amplo de mídia contendo FBS (ou inibidor de tripsina de soja) para extinguir a atividade de tripsina e recolher as células em um tubo falcon 50ml. Contagem de células utilizando um hemocitômetro. Carga 10μL de suspensão de células em um hemocitômetro limpo. O número de células por ml é igual ao número médio de células em cada uma das cinco praças multiplicado por 10 4.
- Centrifugar as células a 1000 RPM (ou ~ 200 xg) em uma centrífuga de bancada por 3 minutos.
- Remova cuidadosamente os meios de comunicação, sem perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em um volume adequado de solução tampão de Hanks Balanced (HBSS) para alcançar uma concentração final de ~ 5 x 10 6 células / mL.
- Células do filtro através de um filtro de células Falcon 70 mM para excluir agregados de grandes células. Coloque a ponta da pipeta directamente para o filtro ao longo de um tubo de cultura rotulados 5mL Falcon. Rapidamente ejetar a suspensão através do filtro dentro do tubo de cultura.
- Contagem de células novamente usando um hemocitômetro e diluí-los para uma concentração final de 2,5 x 10 6 / mL. Manter as células no gelo.
- Determinar a viabilidade das células. Mix algumas células com azul de tripano e medir a percentagem de mortos (azul), as células sobre as células totais utilizando um hemocitômetro. A viabilidade das células deve ser ≥ 90% antes da injeção.
2. Injeção intravenosa
- Mudar de luvas. Agarram delicadamente a cauda de um rato imunodeficientes (nude, NOD SCID, ou NSG, Laboratório de Jackson) e puxe-o para o limitador mouse, com suas costas contra a fenda e sua cauda de fora da pequena abertura na parte de trás do limitador .
- Lentamente, deslize o anel para dentro ao longo da fenda e fixá-la no lugar uma vez o anel de trava a boca do mouse. O rato não deve ser capaz de mover-se livremente, mas deve ter ritmo normal da respiração.
- Encontrar as veias da cauda grande. Quatro vasos sanguíneos principais estão presentes em um rabo de rato. Vasos sangüíneos nos lados dorsal e ventral da cauda são artérias. Veias são nas laterais da cauda.
- Desenhe mais de 200 mL das células preparadas para uma seringa de 1ml. Coloque a agulha 30 G1 / 2 polegada e empurrar para fora as bolhas de ar que possam existir. O volume final de células na seringa deve ser de 200 mL (ou seja, 5 x 10 5 células no total).
- Injetar células dentro da veia.
- Começar a partir da extremidade distal da cauda, por isso, se o primeiro teste falhar, uma região mais proximal da cauda poderia ser usado para uma segunda tentativa.
- Limpe o rabo com etanol 70%. Puxar o rabo reto. Segure a ponta da cauda com o polegar e apoiar o ponto de injeção com o dedo indicador.
- Inserir a agulha na veia e injetar células. Certifique-se a agulha ea seringa são paralelas à veia durante a injeção, caso contrário, a agulha vai picar através da parede do vaso e injetar as células nos tecidos adjacentes cauda.
- Retirar a agulha após a injecção. Sangue deve profusa no local da injecção, se a injeção foi com sucesso. Pressione uma parte limpa da toalha de papel ou chumaço de algodão no local da injecção a fim de facilitar a coagulação e apalpar o rabo para cima para empurrar qualquer amostra residual na veia em circulação.
- Solte o mouse do limitador e devolvê-lo para a jaula. Registrar o processo de injeção (por exemplo, quantos ensaios que levou para injetar as células e quanto células foram injetadas), em um caderno de anotações.
- Determinar a viabilidade das células após a injeção, como descrito na Seção de Preparação da Amostra, a Etapa 9. Esta etapa fornece garantia de que as células se manter vivo durante todo o processo de injeção. No final de um experimento de injeção, a viabilidade das células irá diminuir, mas deve ser acima de 80%.
- (Opcional) Gire para baixo as células sobras e lavar as pelotas com PBS uma vez. Congelar a pellets a -80 oC para análises futuras (por exemplo, western blots para confirmar a expressão do gene ou knockdowns).
- Geralmente após um ou dois meses, os ratos serão dissecados e os locais de metástases são grosseiramente determinados. De pulmão é o principal local de metástase, uma vez que contém a primeira cama que as células capilares encontro depois que elesentrar na circulação.
- Após lavagem com PBS, cada lóbulo do pulmão (ou outros tecidos que contêm metástases) é observada sob um microscópio de dissecação (Figura 1). O número de metástases detectáveis em ambos os lados do pulmão é contada e os números de metástases pulmonares em todos os quatro lobos são somados como o número total de metástases pulmonares 1. Metástases de pulmão são mais facilmente detectado se os pulmões estão fixados em formol durante a noite , uma vez que as metástases se como manchas esbranquiçadas apppear em contraste com os tecidos adjacentes pulmão marrom escuro.
3. A cultura de células de metástases pulmonares
- Metástases pulmonares são isolados de camundongos injetados. Cada um deve ser cultivado separadamente.
- Cada metástase é picada até o final de uma ponta de agulha (estéril) em um filtro de células 70 mM.
- Lavar o filtro de células com vários mls de médio e células coletadas que passam através do filtro em um prato de cultura.
- Incubar as células a 37 ° C durante pelo menos quatro dias sem perturbação.
- Lavar sangue ou restos de tecido sobre o prato com PBS.
- Adicionar meio fresco. No início, tanto as células cancerosas e células de fibroblastos crescer nas placas, mas, gradualmente, as células fibroblasto vai morrer e ser substituído por células cancerosas. Se as células cancerosas transportar qualquer genes resistentes aos medicamentos, selecione as células com antibióticos correspondente.
- A pureza das células derivada é avaliada por imunomarcação utilizando anticorpos humanos contra proteínas específicas. Usamos um anti-anticorpo humano vimentina (VIM-NCL-V9, Novocastra). As células que contêm derivados em geral mais de 99% de células humanas, mesmo na ausência de seleção de medicamentos. As células recém-derivados pode ser injetado em camundongos imunodeficientes novamente para testar suas habilidades metastático, como descrito acima.
4. Resultados representante
- No final deste ensaio, uma linhagem de células altamente metastáticas de câncer geralmente dá origem a metástases pulmonares muitos (Figura 1), 1 enquanto metástases pulmonares muito poucos virão de uma linha mal câncer metastático de células.
- As células derivadas usando este método costuma dar origem a metástases mais do que a linha dos pais, quando são testados novamente com este ensaio. 1-3
Figura 1. Imagens representativas dos pulmões do rato após injeções veia da cauda das células cancerosas. 5 x 10 5 da linha celular humana melanoma metastático, as células SM, 4 foram injetados na veia da cauda de camundongos imunodeficientes. Dois meses depois, os pulmões foram isolados e as metástases foram encontrados dispersos entre o tecido pulmonar normal.
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Discussion
Metástase é a principal causa de morte em pacientes com câncer. Trata-se de quatro etapas principais: separação de células de câncer de seus loci primários, sua entrada em circulação (intravasation), sua saída de circulação (extravasamento), e sobrevivência e crescimento em um órgão distante. Metástase em humanos é considerada um processo lento e muitas vezes se manifesta após anos de latência. Para estudar a sua progressão em tempo hábil, o ensaio relativamente rápido acima experimental foi estabelecida em ratos imunodeficientes. 4 Desde a sua criação, tem sido utilizada de forma eficaz para isolar células com diferentes habilidades metastático, identificar genes que estão para cima ou para baixo-regulado durante metástase 1,2,5, e testar o papel causal destes genes durante a metástase. 3
O passo mais desafiador neste ensaio é injetar células dentro da veia. Demora práticas para dominar as habilidades injetáveis. Mesmo para um investigador experiente, várias tentativas antes de conseguir uma injeção de sucesso são muito comuns. Veias em rabos de rato são agulhas extremamente finas e coloque bem no meio deles não é fácil. Aquecimento a cauda brevemente usando uma lâmpada e massageando suavemente a cauda antes de injecções poderia induzir a dilatação dos vasos sanguíneos e facilitar injeções. Um erro comum para a maioria dos pesquisadores é assumir que as veias são profundas na cauda e, portanto, injetar células muito profunda na pele. Veias são realmente muito perto da superfície da pele, portanto deve-se tentar injetar tão superficial quanto possível.
Se a agulha é inserido com sucesso no interior da veia, a injeção deve ir sem problemas, sem resistência. Se a agulha não está inserida na veia, mas nos tecidos adjacentes, amostras injetadas vai criar pressão de fluidos de forma rápida e, em seguida, impedir a entrega do restante das amostras. Cada um de tais ensaios não vai, assim, perder algumas amostras. Para minimizar esta perda, um investigador experiente tenta prever se a agulha está na veia ou não pela injeção de uma quantidade mínima de amostra e avaliar a resistência da pressão do fluido. Se ele sente a resistência, a agulha não deve estar na veia e ele então retire a agulha e tente novamente. Se não sentir resistência, a agulha deve ser na veia e todos os da amostra será injetado uma vez. Neste último caso, pode-se ver muitas vezes a amostra "atira" para cima a veia, deslocando o sangue como ele faz o seu caminho em direção ao corpo.
Quando terminar o ensaio deve ser determinado empiricamente para cada linha de células, uma vez que varia significativamente de acordo com o potencial metastático das células. Ratos serão dissecados em momentos diferentes após as injeções ea extensão da metástase pulmonar é determinado. Um período de tempo que resulta em um número contável de metástases pulmonares detectáveis microscopicamente é normalmente escolhido, uma vez que dá um resultado quantitativo e também deixa espaço para qualquer aumento ou diminuição de metástases causados por perturbação de genes candidatos. Para os pesquisadores que realizam este teste pela primeira vez, usando uma linhagem de células altamente metastáticas (tais como a linhagem humana de células de melanoma, A375, ou seus derivados altamente metastático) como controle positivo é altamente recomendado. Além disso, as idades e sexos de ratos afetar significativamente os resultados, por isso é aconselhável manter as idades e sexo consistente quando as habilidades metastático de linhagens celulares diferentes são comparadas. Devido às variações introduzidas pelos fatores acima mencionados, pelo menos, cinco ratos deve ser injetado para cada linha de células para chegar a qualquer conclusão estatisticamente significativa.
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Acknowledgments
Este protocolo foi testado e otimizado inicialmente no laboratório do Dr. Richard Hynes (MIT). Financiamento é assegurado pelo Prêmio IDEA NYSTEM (para LX) e Ruth L. Kirschstein Prêmio Nacional de Serviço de Investigação (para LX).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
