Summary
Bu makale, insan kanser hücre hatları metastatik potansiyelini belirlemek için kullanılan deneysel bir metastaz testinin prosedürleri açıklamaktadır.
Abstract
Metastaz, kanser hastalarının ölüm önde gelen nedenidir. Metastaz mekanizmasını anlamak için, deneysel bir metastaz tahlil bağışık yetmezliği olan farelere kullanılarak kurulmuştur. Bu makale, numune hazırlama, intravenöz enjeksiyon ve akciğer metastaz hücreleri kültür de dahil olmak üzere, bu testte yer alan usul çizmektedir. Kısaca, insan kanser hücreleri önceden belirlenmiş bir sayı hazırlanmıştır.
Protocol
1. Numune Hazırlama
- ~% 70 büyüme faktörleri veya FBS ile kendi özel medya konfluent (örneğin, MC-1 hücreler için% 10 FBS DMEM) hücreleri büyütün. Plaka medya aspire ve 1 x PBS (8 NaCl Na 2 HPO 4 g / L KCl, 0.2 g / L, 1.15 g / L 0,7 H 2 O, 0.2 g / L KH 2 PO ile hafifçe birkaç kez yıkayın 4, pH 7.3).
- Aspire PBS ve versene% 0.05 tripsin (0.014 g / L fenol kırmızı ve 1 x PBS, pH 7.2 0.2 g / L EDTA-Na) 2 mL ekleyin. Plaka plaka hücre ayrılması kolaylaştırmak için hafifçe sallayın. Hücrelerin mikroskop altında uyun. Genellikle hücreleri ayırmak için 2-5 dakika sürer.
- Tripsin aktivitesi söndürmeye ve 50ml şahin tüp hücreleri toplamak için FBS (veya soya tripsin inhibitörü) içeren medya bol miktarda ekleyin. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Temiz bir hemasitometre üzerine hücre süspansiyonu 10μL yükleyin. Ml başına hücre sayısı, ortalama her 10 4 ile çarpılır beş kare içerisinde hücrelerinin eşittir .
- 1000 hücreleri Santrifüj RPM (ya da ~ 200 xg) 3 dakika için bir masa üstü santrifüj.
- Medya hücre pelletini rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın. Hanks Dengeli Tampon Çözeltisi (HBSS) ~ 5 x 10 6 hücre / ml son bir konsantrasyona ulaşmak için uygun bir hacim hücreleri tekrar
- Falcon 70 mikron hücre süzgecinden Filtre hücreleri büyük hücreli agrega dışlamak için. Etiketli 5ml Falcon kültür tüpünün üzerinde doğrudan filtre üzerine pipet ucu yerleştirin. Hızla kültür tüpünün içine filtre ile süspansiyon çıkarır.
- Hemasitometre kullanarak tekrar hücre sayımı ve son konsantrasyonu 2.5 x 10 6 / mL seyreltik. Hücreleri buz üzerinde tutun.
- Hücrelerin canlılığı belirleyin. Tripan mavisi ile bazı hücreler Mix ve hemasitometre kullanarak toplam hücreleri üzerinde ölü (mavi) hücrelerinin yüzdesini ölçmek. Hücre canlılığı enjeksiyondan önce ≥% 90 olmalıdır.
2. İntravenöz Enjeksiyon
- Eldivenleri değiştirin. Yavaşça bir immünyetmezligi fare (çıplak, NOD SCID veya NSG, Jackson Laboratory) kuyruk kapmak ve süzgeç arkasındaki küçük açıklıktan dışarı yapışmasını yarık ve kuyruğunu karşı onun arkasında, fare süzgeç içine onu çekin .
- Halka fare ağız yakalar kez yarık boyunca içe halka yavaşça kaydırın ve yerine kilitleyin. Fare özgürce hareket edebilmek, ancak normal solunum oranına sahip olmalıdır.
- Büyük kuyruk damarlar bul. Dört büyük kan damarlarının bir fare kuyruğu bulunmaktadır. Kuyruk dorsal ve ventral tarafta kan damarları arterler. Damarlar kuyruk yan tarafta.
- 1 ml şırınganın içine hazırlanan hücreler mcL 200'den fazla çizin. 30 G1 / 2 inç iğne takın ve var olabilecek herhangi bir hava kabarcıkları dışarı itmek. Hücrelerin şırınga son hacim 200 mcL (yani, toplam 5 x 10 5 hücreleri) olmalıdır.
- Hücreleri kuyruk damar içine enjekte edilir.
- Ilk deneme başarısız olursa, kuyruk daha proksimal bölgeye ikinci bir denemek için kullanılan olabilir, kuyruk distal ucundan başlayın.
- % 70 etanol ile kuyruk silin. Düz kuyruk çekin. Başparmak ile kuyruk ucu tutun ve işaret parmağı ile enjeksiyon noktası desteği.
- Ven iğne takın ve hücreleri enjekte. Iğne ve şırınga enjeksiyon sırasında damar paralel emin olun, aksi takdirde iğne damar duvarı ile karıştırmak ve hücreleri, komşu kuyruk dokulara enjekte.
- Enjeksiyondan sonra iğneyi çekin. Kan, enjeksiyon, enjeksiyon başarıyla giderse bol olmalıdır. Pıhtılaşma kolaylaştırmak için kağıt havlu ya da enjeksiyon yerinde pamuklu temiz bir parça basın ve damar dolaşımı içine herhangi bir kalıntı örnek itin kuyruğu yukarı palpe.
- Süzgeç fareyi bırakın ve kafesine geri dönmek. Bir laboratuar dizüstü (örneğin, kaç denemeler hücreleri enjekte aldı ve ne kadar hücreler enjekte edildi) enjeksiyon işlemi kaydedin.
- Numune Hazırlama Bölümünde açıklandığı gibi, enjeksiyondan sonra hücre canlılığı, belirleyin, 9 adım. Bu adım, hücrelerin enjeksiyon işlemi boyunca hayatta kalmasını güvence sağlar. Bir enjeksiyon deney sonunda, hücre canlılığı azalacak, ancak% 80 üzerinde olmalıdır.
- (Isteğe bağlı) artık hücreleri aşağı Spin ve pelet kez PBS ile yıkayın. Gelecekteki analizler (örneğin, gen ekspresyonu veya knockdowns onaylamak için batı lekeler) -80 ° C'de pelet dondurun.
- Genellikle bir veya iki ay sonra, farelerin disseke olacak ve metastaz yerleri kabaca belirlenir. Akciğer, metastaz için birincil site hücreleri sonra ilk karşılaştığınızda bu kapiller yatak içerdiğindendolaşıma girebilir.
- PBS, akciğer (ya da diğer dokular içeren metastaz) her lob ile iyice durulandıktan sonra bir diseksiyon mikroskobu altında (Şekil 1) görülmektedir. Toplam sayısı akciğer metastazları akciğer her iki tarafta saptanabilir metastaz sayısı sayılır ve tüm dört loblar akciğer metastazları sayıları birbirine eklenir. Akciğerlere formalin gecede giderilen eğer 1 akciğer metastazları daha kolay algılanır metastaz bitişik koyu kahverengi akciğer dokusu aksine beyazımsı lekeler olarak apppear beri.
3. Akciğer metastaz Kültürleme Hücreler
- Akciğer metastazı enjekte edilen farelerin izole edilmiştir. Her biri ayrı kültür olmalıdır.
- Her metastaz 70 mikron hücre süzgecinden (steril) bir iğne kapağı sonuna kadar kıyılmış.
- Orta ve toplanan hücreler bir kültür çanak filtre geçmesine birkaç mL ile hücre süzgeç durulayın.
- Hücreler, rahatsız olmadan en az dört gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Kan veya doku artıkları, tabak PBS ile yıkayın.
- Taze orta ekleyin. Başında, hem kanser hücreleri ve fibroblast hücreleri plakalar üzerinde büyüyecek, ancak yavaş yavaş, fibroblast hücreleri ölecek ve kanser hücreleri tarafından değiştirilmelidir. Kanser hücreleri herhangi bir ilaca dirençli genleri taşıyorsanız, ilgili antibiyotikler ile hücreleri seçin.
- Elde edilen hücrelerin saflık insana özgü proteinlere karşı antikorlar kullanılarak immün değerlendirilir. Biz anti-insan vimentin antikor (NCL-VIM-V9, Novocastra) kullanın. Ilaç seçiminin yokluğunda bile, elde edilen hücrelerin% 99 insan hücreleri üzerinde genellikle içerir. Yeni elde edilen hücrelerin, yukarıda açıklandığı gibi, kendi metastatik yeteneklerini test etmek için bağışık yetmezliği olan farelere tekrar enjekte edilebilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar
- Bu testin sonunda, çok az akciğer metastazı kötü metastatik kanser hücre hattı gelecek bir çok metastatik kanser hücre hattı genellikle birçok akciğer metastazı (Şekil 1), 1 yol açmaktadır.
- Bu yöntemi kullanarak elde edilen hücreler genellikle ebeveyn hat, yine bu testte kullanılarak test daha fazla metastaz neden olmaktadır. 1-3
Şekil 1, kanser hücrelerinin kuyruk damar enjeksiyondan sonra fare akciğerlerin Temsilcisi görüntüler . Insan metastatik melanom hücre hattı, SM hücreleri, 4, 5 x 10 5, bağışık yetmezliği olan farelere kuyruk damar içine enjekte edildi. İki ay sonra, akciğerler izole edildi ve metastaz normal akciğer dokusu arasında dağılmış bulundu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metastaz, kanser hastalarının ölüm önde gelen nedenidir. Birincil lokusların, dolaşıma giriş (intravasation), dolaşım (ekstravazasyonu) çıkış, ve uzak bir organ hayatta kalma ve büyüme kanser hücrelerinin ayrılması: Bu dört ana adımdan oluşur. Insan metastaz yavaş bir süreç olarak görülür ve genellikle gecikme yıl sonra tezahür eder. Zamanında ilerlemesi çalışma için, yukarıdaki nispeten hızlı deneysel assay bağışık yetmezliği olan farelere kurulmuştur 4 Kurulduğu günden bu yana, farklı metastatik yetenekleri ile hücreleri izole etmek için etkin olmuştur, yukarı veya aşağı regüle sırasında genleri tanımlamak metastaz 1,2,5 ve 3 metastaz sırasında bu genlerin nedensel rolleri test edin.
Bu testte en zor adım, hücrelerin kuyruk damar içine enjekte edilmesidir. Enjekte becerileri uygulamaları alır. Hatta deneyimli bir araştırmacı için, başarılı bir enjeksiyon ulaşmadan birkaç denemeden çok yaygındır. Fare kuyrukları damarlarının bunların ortasında, son derece ince ve eklemek iğneler kolay değildir. Bir lamba kullanarak kuyruk kısaca Isınma ve enjeksiyonlar önce kuyruk hafifçe masaj, kan damarlarının genişlemesi neden ve enjeksiyonlar kolaylaştırabilir. Çoğu araştırmacılar için ortak bir hata damarlar kuyruk derin ve bu nedenle deri içine çok derin hücreler enjekte varsayalım. Damarlar aslında cilt yüzeyine çok yakın, bu nedenle biri mümkün olduğunca basık enjekte denemelisiniz.
Damar içine iğne başarıyla takılırsa, enjeksiyon, hiçbir direniş ile sorunsuz gitmek gerekir. Ven iğne takılı değil ama komşu dokulara enjekte örnekleri hızlı bir şekilde sıvı basıncı oluşturmak ve daha sonra örneklerin dinlenme teslim edilmesini engellemek. Bu tür başarısız denemelerin her biri, bu nedenle bazı örnekler kaybedersiniz. Bu kaybını en aza indirmek için, tecrübeli bir araştırmacı, örnek bir az miktarda enjekte ve sıvı basınç direnci değerlendirmek ven veya iğne olup olmadığını tahmin etmeye çalışır. O direnci hissederse, iğne ven olmalı ve o iğneyi çekin ve yeniden deneyin. Eğer herhangi bir direnç hissedilir, iğne ven olmalıdır ve tüm örnek bir kerede enjekte edilecektir. İkinci durumda, sık sık vücudun doğru yoldur yerinden kan, damar kadar örnek "sürgünler" görebilirsiniz.
Tahlil önemli ölçüde hücrelerin metastatik potansiyelleri bağlı olarak değişir bu yana, her bir hücre hattı için deneysel olarak belirlenmiş olmalıdır sonlandırmak için. Fare farklı zaman noktalarında enjeksiyondan sonra disseke olacak ve akciğer metastazı kapsamı belirlenir. Nicel bir sonuç verir ve aynı zamanda aday genlerin pertürbasyon neden metastaz herhangi bir artış veya azalış için odayı terk beri mikroskobik saptanabilir akciğer metastazı sayılabilen bir numara sonuçları, genellikle tercih olduğunu bir zaman uzunluğu. Pozitif kontrol olarak bir çok metastatik hücre hattı (insan melanoma hücre hattı, A375, ya da yüksek metastatik türevleri gibi) kullanarak, ilk kez bu testte gerçekleştiren araştırmacılar için şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, farelerin yaş ve cinsiyette sonuçları anlamlı şekilde etkilememiştir, farklı hücre hatları metastatik yetenekleri karşılaştırıldığında tutarlı yaşları ve cinsiyet tutmak için tavsiye edilir. Yukarıda belirtilen faktörler tarafından tanıtılan farklılıklar nedeniyle, istatistiksel olarak anlamlı bir sonuca ulaşmak için en az beş fareler her hücre hattı enjekte edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu protokol, test edilmiş ve Dr. Richard Hynes (MIT) laboratuvar başlangıçta optimize edilmiştir. Finansman NYSTEM FİKİR ÖDÜLÜ (LX) ve Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü (LX) tarafından sağlanmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
