Biology

बैक्टीरियल कोशिकाओं के इलेक्ट्रॉन Cryotomography

Published: May 6, 2010 doi: 10.3791/1943

Songye Chen¹, Alasdair McDowall^1,2, Megan J. Dobro¹, Ariane Briegel^1,2, Mark Ladinsky^1,2, Jian Shi², Elitza I. Tocheva¹, Morgan Beeby^1,2, Martin Pilhofer^1,2, H. Jane Ding¹, Zhuo Li^1,2, Lu Gan¹, Dylan M. Morris¹, Grant J. Jensen^1,2

¹Division of Biology, California Institute of Technology - Caltech, ²Howard Hughes Medical Institute, California Institute of Technology - Caltech

Summary

हम यहाँ वर्णन कैसे इलेक्ट्रॉन cryotomography (ECT) का उपयोग करने के लिए पास देशी राज्यों में बैक्टीरियल कोशिकाओं के अध्ययन ultrastructure "macromolecular" (~ 4 एनएम) संकल्प.

Abstract

हालांकि बहुत पहले से ही बैक्टीरियल कोशिकाओं के बुनियादी चयापचय के बारे में जाना जाता है, कई मौलिक सवाल अभी भी आश्चर्यजनक उदाहरण के लिए सहित अनुत्तरित कि वे कैसे पैदा करते हैं और विशिष्ट कक्ष आकार को बनाए रखने, polarity स्थापित, उनके जीनोम को अलग करने के लिए, और विभाजन,. आदेश में इन घटनाओं को समझने के लिए, इमेजिंग तकनीक की जरूरत है कि प्रकाश प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और एक्स - रे क्रि और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी जैसे उच्च संकल्प तरीकों के बीच पुल संकल्प अंतराल.

इलेक्ट्रॉन cryotomography (ECT) एक उभरती हुई प्रौद्योगिकी है कि यह सिर्फ करता है, कक्षों की ultrastructure एक के पास देशी राज्य में visualized किया जा करने के लिए, तीन आयाम (3 डी) में "macromolecular" संकल्प (4nm ~) के साथ, ^{की अनुमति 1,} 2 में. ECT, कोशिकाओं एक शीशे में imaged हैं, "जमे हुए हाइड्रेटेड" कम तापमान पर एक क्रायो संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (cryoTEM) में राज्य (<-180 डिग्री सेल्सियस). पतला कोशिकाओं (अप करने के लिए ~ ³ मोटाई में 500 एनएम) के लिए, कोशिकाओं बरकरार हैं डुबकी EM एटैन या एटैन / प्रोपेन मिश्रण जैसे cryogens में ग्रिड भर में मीडिया के भीतर जमी. मोटा कोशिकाओं और biofilms भी पहले "उच्च दबाव ठंड" और फिर से एक कांच राज्य में imaged किया जा सकता है उन्हें "क्रायो - सेक्शनिंग". दो आयामी प्रक्षेपण छवियों की एक श्रृंखला तब नमूना के माध्यम से एकत्र कर रहे हैं के रूप में यह संवर्द्धित एक या दो axes साथ झुका हुआ है. एक तीन आयामी पुनर्निर्माण, या "tomogram" तो छवियों से गणना की जा सकता है. हालांकि ECT महंगा इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता है, हाल के वर्षों में, यह कुछ प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया गया है विभिन्न बाहरी appendages की संरचनाओं प्रकट, अलग अलग सेल लिफाफे, cytoskeletal filaments के पदों और संरचनाओं, और स्थानों और बड़े macromolecular के आर्किटेक्चर की संरचना flagellar मोटर्स, आंतरिक डिब्बों और chemoreceptor सरणियों जैसे विधानसभाओं ^{1, 2}

इस वीडियो लेख में हम कैसे ECT के साथ छवि कोशिकाओं नमूना तैयार करने की प्रक्रिया, डाटा संग्रह, tomogram पुनर्निर्माण, और विभाजन के माध्यम से और प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ कुछ मामलों के संबंध में परिणामों की व्याख्या सहित, उदाहरण देकर स्पष्ट करना.

Protocol

बैक्टीरियल सेल संस्कृति की मैं तैयार

कुछ मिलीलीटर तरल संस्कृति में वांछित चरण के लिए अपने सामान्य मीडिया में बैक्टीरियल कोशिकाओं बड़े हो जाओ. कताई यदि उच्च एकाग्रता की जरूरत है, और फिर से ताजा मीडिया में निलंबन को अपनाया जा सकता है, लेकिन ध्यान रखें कि इस प्रक्रिया को कभी कभी कोशिकाओं में संरचनात्मक परिवर्तन का परिचय.
प्रकाश माइक्रोस्कोप जांच करने के लिए यकीन है कि संस्कृति और contaminants के एक उपयुक्त संगम पर मुक्त है.
कुछ बैक्टीरियल कोशिकाओं छड़ी या EM ग्रिड पर भी विकसित कर सकते हैं. जब ग्रिड, एक कार्बन कोट के साथ सोने ग्रिड पर बढ़ कोशिकाओं सबसे अक्सर कोशिकाओं को विषाक्तता से बचने के लिए उपयोग किया जाता है. वे चमक 2 मिनट के लिए छुट्टी, 15 मिनट के लिए एक यूवी प्रकाश तहत निष्फल होना चाहिए, और तरल संस्कृति में सीधे रखा. पक्षपाती कोशिकाओं को स्वाभाविक रूप से ग्रिड से छड़ी जाएगा, और दूसरों द्वारा कोटिंग ग्रिड के लिए 0.1% में पाली एल lysine ग्रिड पहली पालन करने के लिए संकेत किया जा सकता है. ग्रिड प्रकाश माइक्रोस्कोप में ठंड से पहले सुनिश्चित करें कि कक्षों की एकाग्रता उपयुक्त है बनाने के लिए पहले की जाँच करें.

द्वितीय. डुबकी ठंड पतली कोशिकाओं

पतली बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए, बरकरार कोशिकाओं के निलंबन डुबकी एक EM ग्रिड भर जमी है. प्रक्रिया अल्ट्रा बैक्टीरिया कोशिकाओं की संरचना को बरकरार रखता है और EM के उच्च वैक्यूम बाद में पानी के वाष्पीकरण रोकने जाएगा. यह कस्टम बनाया डुबकी ठंड उपकरणों के साथ भी किया जा सकता है, या ⁴ के रूप में हम यहाँ एक वाणिज्यिक स्वचालित डुबकी फ्रीजर के साथ, शो, फी Vitrobot MKIII .

चमक निर्वहन कार्बन 2 के लिए लेपित EM ग्रिड - 4 मिनट. यह हाइड्रोफिलिक ग्रिड की सतह बनाता है, इस प्रकार के समान रूप से पूरे ग्रिड भर नमूना फैल करने में मदद.
25μl एक 5% केंद्रित BSA समाधान के साथ मिश्रण 100μl कोलाइडयन सोने समाधान (10 एनएम के कण व्यास). BSA कोट सोने के कणों और यह उनके एकत्रीकरण रोकता.
BSA और 15 मिनट के लिए सोने के कण मिश्रण 18000g पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला हटाने के बाद, शेष सोने गोली 20 μl सेल समाधान के साथ मिश्रित है. BSA इलाज सोने के कणों की कोशिकाओं के साथ प्रतिक्रिया नहीं, लेकिन वे tomograms के पुनर्निर्माण के लिए Fiducial मार्कर के रूप में की जरूरत होगी.
सेल और Vitrobot में 100% आर्द्रता पर EM ग्रिड छुट्टी चमक सोने समाधान मिश्रण के 4 μl लागू करें. ग्रिड तो स्वतः Nr 1 फिल्टर पेपर के साथ दोनों पक्षों से blotted. इस अतिरिक्त तरल पदार्थ निकालता है, इसलिए है कि केवल अपने मीडिया में कोशिकाओं की एक पतली फिल्म बनी हुई है. ग्रिड तो एटैन और प्रोपेन कि नीचे ठंडा करने के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ लगभग 77K है की एक तरल मिश्रण में तेजी से गिर गया. इस प्रक्रिया के दौरान, नमूना इतनी तेजी से जमे हुए है कि बर्फ क्रिस्टल के गठन पतली फिल्मों <1 सुक्ष्ममापी में रोका है.
ध्यान से एटैन / प्रोपेन मिश्रण से ग्रिड हटाने और जल्दी से एक ग्रिड भंडारण बॉक्स है कि तरल नाइट्रोजन के अंतर्गत रखा है में स्थानांतरित.

III. उच्च दाब बर्फ़ीली और क्रायो मोटा कक्ष के सेक्शनिंग

मोटा कोशिकाओं के लिए, उच्च दबाव ठंड बर्फ crystallization कम कर देता है और बाद में क्रायो सेक्शनिंग EM इमेजिंग के लिए काफी पतली ^{नमूने 5. 6, 7,} वहाँ कई अलग अलग नमूना धारकों उच्च दबाव ठंड के लिए उपलब्ध हैं renders है, अपने चयन के नमूने पर निर्भर करती है, प्रकार के ठंड मशीन का इस्तेमाल किया है या चयनित खोजी आवेदन. यहाँ हम बाल-Tec एचपीएम 010 उच्च दबाव फ्रीजर और क्रायो अति सूक्ष्म तक्षणी मॉडल UC6/FC6 Leica माइक्रोसिस्टम्स से उपयोग करें.

बैक्टीरिया के लिए, 15mls स्पिनर संस्कृति> आयुध डिपो 0.5 सीधे 37 ° सी इनक्यूबेटर से लिया जाता है और 3 मिनट के लिए 1000rpm पर centrifuged. 13000rpm पर 0.5ml 20% dextran cryoprotectant के साथ सतह पर तैरनेवाला, शेष संस्कृति गोली के मिश्रण 0.5ml को हटाने और उसके बाद के बाद 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र.
सतह पर तैरनेवाला हटाने के बाद, सुपर गोली के विंदुक 0.1ml गर्मी सील micropipette टिप जो पहले से ही 0.2ml 20% dextran cryoprotecant (40000Mwt) शामिल हैं में पेस्ट करें. 30 सेकंड के लिए 13,000 rpm पर micropipette टिप में मिश्रण अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें. एक 5-10 μl तंग गोली सील नोक पर देखा है.
एक "Teflon" लेपित पीतल गुंबददार उच्च दबाव फ्रीजर धारक हाथ में planchet तैयार घुड़सवार एक आधा गुंबद में पेस्ट प्राप्त है और अपने फ्लैट साथी पीतल टोपी के साथ बंद.
हाथ विधानसभा फिर तुरंत primed उच्च दबाव ठंड के लिए तैयार फ्रीजर में डाला.
2100 बार दबाव कम संयुक्त पीतल planchet इकाई कोशिकाओं से युक्त तेजी से उच्च दबाव तरल नाइट्रोजन के एक जेट द्वारा ठंडा है, हाथ विधानसभा तुरन्त हटाने और तरल नाइट्रोजन के एक स्नान में डूबनेवाला वार्मिंग से planchet रोकता है.
Planchet इकाइयों तरल नाइट्रोजन के तहत संग्रहीत कर रहे हैं जब तक क्रायो - सेक्शनिंग करने के लिए आवश्यक है.
सेक्शनिंग के लिए कक्षों की अच्छी तरह से जमी गुंबद का पर्दाफाश करने के लिए, दो पीतल planchets ध्यान unde अलग हो रहे हैंr तरल नाइट्रोजन.
कक्षों की पूरी तरह से जमे हुए गुंबद बेजान दिखने में, दरारें और बर्फ nucleation दरारें मुक्त है.
यह planchet precooled ° कक्ष सी -170 को सौंप दिया है और सुरक्षित क्रायो - सूक्ष्म तक्षणी उपाध्यक्ष की तरह चक पर घुड़सवार.
एक कम कोण क्रायो - हीरे की चाकू, एक हीरे उपकरण trimming के लिए, CTRL मंच, ग्रिड भंडारण बॉक्स, एक विरोधी स्थैतिक स्प्रे इकाई और एक ग्रिड पकड़ तंत्र: ठंडा cryomicrotome आवश्यक cryotools सेक्शनिंग के लिए आवश्यक हैं, इन में शामिल हैं.
सफल एक बाहरी गुंबद क्षेत्र सेक्शनिंग रिबन शुरू <हीरे trimming के उपकरण और एक तीव्र गति सेक्शनिंग द्वारा 0.2mm वर्ग के आकार का है, जबकि ~ अच्छी तरह से जमी परिधि के 200μm गहराई बनाए रखने के लिए
Antistatic कम कोण चाकू और तांबे के करीब निकटता में समर्थन ग्रिड पर निर्देशित स्प्रे के साथ, हीरा चाकू ध्यान से पॉलिश ब्लॉक चेहरे सेक्शनिंग के लिए सुसज्जित करने के लिए उन्नत है.
सूक्ष्म तक्षणी पैरामीटर, जैसे 50 से 350 एनएम के बीच एक अनुभाग मोटाई सेटिंग में चुना ~ 0.4mm/sec और संकीर्ण काटने खिड़की के एक काटने गति के साथ मिलकर. यह antistatic स्प्रे रेंज और तत्काल क्षेत्र में कम नमी की स्थिति के लिए तीव्रता को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
पहली वर्गों के रूप में उत्पादित कर रहे हैं एक ठीक बरौनी applicator हाथ या micromanipulator द्वारा maneuvered जल्दी से कम कोण हीरे की धार फिसलने वर्गों रोड़ा.
जबकि वर्गों के रिबन से चाकू मजबूर है, वे धीरे से एक बरौनी जांच के द्वारा समर्थित हैं और तांबे ग्रिड के पास समर्थन के पार निर्देशित.
वर्गों को छड़ी करने के लिए, रिबन के साथ भरी हुई ग्रिड तो मजबूती से एक ठंडा जांच पॉलिश चांदी का उपयोग कर दबाया, कुछ वर्गों इतना उच्च चार्ज किया जाता है नवीनतम antistatic उपकरणों आसंजन प्रक्रिया में सहायता कर सकते हैं.
ग्रिड बक्से दीर्घकालिक भंडारण के लिए एक तरल शुष्क shipper ठंडा नाइट्रोजन में रखा जाता है जब तक खुर्दबीन ग्रिड के हस्तांतरण के लिए तैयार है.

चतुर्थ. क्रायो लाइट माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं की जांच

ग्रिड पर बैक्टीरियल कोशिकाओं क्रायो प्रकाश माइक्रोस्कोप (cryoLM) का उपयोग imaged किया जा सकता है. खुर्दबीन हम यहाँ का उपयोग एक कस्टम Nikon उलटा माइक्रोस्कोप है तिवारी / ई अतिरिक्त लंबे समय तक काम (ELWD) दूरी 60x हवा उद्देश्य लेंस के साथ बी. ग्रिड इमेजिंग, जो प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए एक संशोधित फी क्रायो चरण के दौरान एक क्रायो चरण में रखा जाता है. एक खोजक ग्रिड का प्रयोग, कोशिकाओं ग्रिड वर्गों पर स्थित किया जा सकता है और cryoLM छवियों cryoEM tomograms सहसंबद्ध किया जा.

क्रायो - स्टेशन पर कारतूस में ग्रिड का लोड. कारतूस हमारे TF30H polara फी के लिए मानक EM कारतूस से संशोधित कस्टम हैं. ग्रिड नीचे तांबा क्लिप के छल्ले द्वारा आयोजित किया जाता है. कारतूस फिर स्थानांतरित करने के लिए तरल नाइट्रोजन में एक ट्यूब में रखा जाता है.
क्रायो चरण तरल नाइट्रोजन तापमान (-190 डिग्री सेल्सियस) के लिए शांत हो जाओ.
क्रायो चरण में कारतूस लोड ग्रिड और देखने के विंडो में ले जाएँ. चरण दो कस्टम संशोधित कारतूस को पकड़ कर सकते हैं.
कंडेनसर लेंस निचले और ग्रिड पर 60x उद्देश्य लेंस ध्यान केंद्रित.
कोशिकाओं को ढूँढें और चित्र लेने के लिए. सहसंबद्ध LM और EM अध्ययन के लिए, ग्रिड कोशिकाओं की आसपास के क्षेत्र स्कैन बाद EM में कोशिकाओं का पता लगाने के लिए.
इमेजिंग, कारतूस के बाद ग्रिड ट्यूब में वापस डाल तरल नाइट्रोजन में ट्यूब रखने के लिए जब तक EM में imaged किया जा करने के लिए तैयार है.

वी. क्रायो मंदिर में घुमाएँ श्रृंखला लीजिए

बैक्टीरिया कोशिका के एक 3D tomogram प्राप्त करने के लिए, प्रक्षेपण छवियों की एक श्रृंखला ले रहे हैं जबकि नमूना संवर्द्धित क्रायो मंदिर में एक या दो axes साथ झुका हुआ है. झुकाव कोण और अन्य प्रयोगात्मक सेटिंग्स को देखते हुए, वहाँ कई अलग अलग के लिए स्वचालित रूप से झुकाव श्रृंखला इकट्ठा उपलब्ध सॉफ्टवेयर रहे हैं. हम हमारे क्रायो मंदिर जो TF30H - polara फी है के लिए Leginon का उपयोग करें. यह स्वचालित रूप से preselected कोशिकाओं के झुकाव श्रृंखला लेने के ^लिए अनुमति देता है 8.

Precooled में क्रायो स्टेशन पर बहु - चयन धारक (MSH) में कारतूस लोड. MSH 6 कारतूस को पकड़ कर सकते हैं.
TF30H - polara MSH कनेक्ट, एक कारतूस लेने और यह EM स्तंभ में सम्मिलित.
EM कंप्यूटर और Leginon दूसरे वर्कस्टेशन पर मुख्य कार्यक्रम पर Leginon ग्राहक शुरू करो.
एक Leginon सत्र के लिए सेट presets (छवि शर्तों). महत्वपूर्ण पैरामीटर बढ़ाई, ध्यान के तहत मूल्य, इलेक्ट्रॉन खुराक और झुकाव कोण झुकाव श्रृंखला के लिए शुरू कोण, अंत कोण और वेतन वृद्धि सहित, कर रहे हैं.
सबसे कम बढ़ाई से शुरू छवियों पर लक्ष्य उठाओ और अगले कदम के लिए उन्हें उच्च आवर्धन के साथ भेज.
झुकाव श्रृंखला के संग्रह के लिए सभी लक्ष्यों को कतार और अंतिम टोमोग्राफी "" कदम के लिए उन सभी को प्रस्तुत.
डाटा संग्रह की प्रक्रिया एक स्थानीय वर्कस्टेशन से वेब उपकरण के माध्यम से नजर रखी जा सकती है.
प्रयोगात्मक डेटा के संग्रह के बाद किया है, नीचेपुनर्निर्माण के लिए एक स्थानीय वर्कस्टेशन पर पूरा झुकाव - श्रृंखला लोड.

छठी. जैवसुरक्षा सावधानियाँ

जैविक नमूने है कि हम साथ काम के अधिकांश गैर रोगजनक रहे हैं और मिट्टी, पानी के नल या कीड़े के पेट से अलग किया गया है. मूल सड़न रोकनेवाला तकनीक इन नमूनों से निपटने के लिए पर्याप्त है. रोगज़नक़ों के साथ कार्य करना अतिरिक्त सुरक्षा कदम के कार्यान्वयन की आवश्यकता है, लेकिन चरम खतरों के लिए, कुछ प्रयोगशालाओं BSL-3 प्रयोगशालाओं के भीतर पूरे क्रायो-EM सूक्ष्मदर्शी स्थापित किया है. निम्नलिखित तरीके हम हमारी प्रयोगशाला में रोगज़नक़ों के साथ काम करने का जोखिम को कम कर दिया है की कुछ कर रहे हैं.

एक नमूना के pathogenicity तनु या तो रासायनिक या आनुवंशिक जा सकता है. वायरस के कई प्रयोगशालाओं कर क्रायो - EM उन्हें डुबकी ठंड से पहले रासायनिक fixatives के साथ निष्क्रिय है. एक विकल्प के रूप में, कुंजी म्यूटेशनों पेश किया है कि गैर संक्रामक कुछ एंजाइमों में बिंदु उत्परिवर्तन निष्क्रिय या बाहर रिसेप्टर्स दस्तक उदाहरण के लिए सहित नमूने, प्रदान कर सकते हैं.
दस्ताने, प्रयोगशाला कोट और चश्मे के रूप में इस तरह के व्यक्तिगत सुरक्षात्मक गियर पहना होना चाहिए.
खतरनाक नमूने एक जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में संभाला जा सकता है है. बैक्टीरियल संस्कृतियों, उगाया जा सकता है ध्यान केंद्रित किया, और यहां तक कि EM पर BSC में ग्रिड डुबकी जमी. हम एक छोटे, मैनुअल डुबकी ठंड डिवाइस है कि इस उद्देश्य के लिए हमारे BSC में फिट बैठता है. यदि अधिक से अधिक स्वत: डुबकी - फ्रीजर द्वारा की पेशकश की स्थिरता की जरूरत है, वे या तो BSC में पेश किया जा सकता है, या अधिक बस, कुछ मामलों में हम एल्यूमीनियम पन्नी के साथ हमारे Vitrobot के सोख्ता पैड का समर्थन किया है डिवाइस के प्रदूषण को रोकने. जब एक BSC के साथ काम कर रहे हैं, के रूप में उपकरण के रूप में और सामग्री के में कई संभव में जा रहा है या कैबिनेट के बाहर 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित किया जाना चाहिए. जब हमारे ग्रिड की तैयारी, हम एक बैक्टीरियल या वायरल संस्कृति की छोटी मात्रा में (आमतौर पर 4 उल), जिनमें से अधिकांश वाटमान कागज द्वारा blotted हो जाता है का उपयोग करें. सोख्ता कागज, विंदुक युक्तियाँ, और शेष संस्कृति की biohazardous बर्बादी के रूप में निपटारा कर रहे हैं. सभी उपकरण और सतहों उजागर पतला ब्लीच, 95% इथेनॉल और फिर पानी के साथ कीटाणुरहित कर रहे हैं.
एक बार ग्रिड जमे हुए हैं, वे भंडारण और डेटा संग्रह भर में तरल नाइट्रोजन तापमान पर रखा जाता है. यह दिखाया गया है है कि कोशिकाओं को ठंड और तब विगलन जीवित रह सकते हैं, हालांकि, तो हम उन्हें भंडारण और डेटा संग्रह भर खतरनाक के रूप में इलाज जारी है. डेटा संग्रह के अंत में, जमी ग्रिड युक्त कारतूस क्रायो - मंदिर से हटा रहे हैं और 70% शराब में सीधे गिरा दिया. हालांकि दुर्लभ, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कभी कभी ग्रिड कॉलम के अंदर कर रहे हैं "लटकाई" चाहिए, और ऐसी एक घटना के परिणामों के प्रत्येक खतरनाक नमूने के लिए विचार किया जाना चाहिए. माइक्रोस्कोप के अधिकांश कमरे के तापमान पर है, तो एक गिरा ग्रिड पर नमूना संभावना स्तंभ अंदर पिघलना होगा और पूरी तरह से EM के अति उच्च निर्वात में desiccated हो. यह स्पष्ट रूप से कुछ जैविक नमूने निष्क्रिय होगा, लेकिन शायद वायरस नहीं, मजबूत और नमूना के desiccated अवशेष संभावित एयरोसौल्ज़ जब खुर्दबीन स्तंभ अगले सेवा के लिए खोला जाता है के रूप में जारी किया जा सकता है है.

सातवीं. Tomogram पुनर्निर्माण

बैक्टीरियल कोशिकाओं के tomograms सॉफ्टवेयर के माध्यम से पुनर्निर्मित कर रहे हैं. इस काम के लिए कई सॉफ्टवेयर उपलब्ध हैं. हम स्वचालित पुनर्निर्माण और स्क्रीनिंग tomograms के लिए Raptor ^{उपयोग} 9 स्वचालित झुकाव श्रृंखला संरेखण और बाद पुनर्निर्माण एक गैर तुच्छ कार्य है, Raptor वर्तमान में एक 100% सफलता दर नहीं है .. Raptor विफलता या एक उच्च गुणवत्ता वाले पुनर्निर्माण के लिए जरूरत के मामले में, हम पुस्तिका छवि संरेखण और eTomo साथ IMOD टोमोग्राफी सॉफ्टवेयर सुइट में पुनर्निर्माण ^{का उपयोग} 11 10.

स्थानीय Leginon वेबसर्वर से प्रत्येक व्यक्ति झुकाव श्रृंखला डाउनलोड करें. उन्हें जहां वे आसानी से स्थित हो सकता है एक निर्देशिका में सहेजें.
मैन्युअल रूप से झुकाव IMOD 3dmod दर्शक का उपयोग करते हुए श्रृंखला का निरीक्षण किया और उन है जब Leginon लक्ष्य ट्रैकिंग या एक उपयोगी झुकाव श्रृंखला उत्पादन में नाकाम रही है त्यागें.
हम चलाने Raptor प्रयोगशाला में लिनक्स मशीनों पर पीच (पर्ल आधारित प्रणाली के एक नेटवर्क पर कार्य वितरित) के माध्यम से वितरित की. हम हमारे Fiducial मार्करों के आकार निर्दिष्ट करने के लिए, कोलाइडयन सोने के कणों यानी, मार्करों के पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा, पिक्सेल आकार, मोटाई पुनर्निर्माण के वांछित, binning कारक और मूल सेटिंग्स के एक ऐसे इनपुट के रूप में में (संख्या की संख्या उत्पादन पथ और कमांड लाइन पर उत्पादन में प्रारूप) और इसे चलाने के लिए, आम तौर पर 20min 122 छवि डाटासेट (2k 2k द्वारा) के लिए 2 के लिए छोड़ दें. यदि पुनर्निर्माण के परिणाम से संतुष्ट है, इस अनुभाग में नीचे दिए गए चरणों को छोड़ दिया जा सकता है.
जब मैनुअल पुनर्निर्माण की जरूरत है, "MRC" से फ़ाइलें "सेंट." नाम बदलें और eTomo जीयूआई में IMOD टोमोग्राफी सुइट में व्यक्तिगत झुकाव श्रृंखला लोड.
झुकाव श्रृंखला अक्ष प्रकार (एकल या दोहरा अक्षों) निर्दिष्ट करें, और Fiducial सा में इस्तेमाल किया आकार दर्ज करेंmple तैयारी. फ़ाइल शीर्षक स्कैन के लिए पिक्सेल आकार का निर्धारण, और क्लिक "कॉम स्क्रिप्ट बनाएँ" द्वारा आगे बढ़ना.
झुकाव श्रृंखला से tomogram पुनर्निर्माण eTomo जीयूआई में प्रत्येक टैब के चरणों का पालन करें. निरीक्षण और हर कदम के बाद परिणाम को सत्यापित करने के लिए, और अगर संतुष्ट नहीं है, हम हमेशा किसी भी पिछले कदम और पुनर्संसाधन के लिए वहाँ से वापस जा सकते हैं. "पूर्व प्रसंस्करण" तैयारी प्रसंस्करण प्रदर्शन और उच्च तीव्रता पिक्सल एक्स - रे की वजह से असामान्य हटायें है. "मोटे संरेखण" एक झुकाव झुकाव श्रृंखला में प्रत्येक बाद प्रक्षेपण छवि पार सहसंबंध द्वारा पिछले करने के लिए गठबंधन किया है जिसमें श्रृंखला पैदा करता है. हम जो सोने मोती "Fiducial मॉडल पीढ़ी" में fiducials के रूप में उपयोग को परिभाषित है, और कार्यक्रम के प्रत्येक प्रक्षेपण छवि में Fiducial मार्करों पटरियों और "ठीक" संरेखण बनाता है. "Tomogram पोजिशनिंग" जेड में tomogram फसल की अनुमति देता है "अंतिम निरपेक्ष ढेर" रैखिक प्रक्षेप, और CTF-सुधार, गोल्ड मिटानेकारबर और 2D फ़िल्टरिंग वैकल्पिक लागू किया जा सकता है जैसे कार्यों का उपयोग करने के लिए उत्पन्न होता है. tomogram फूरियर अंतरिक्ष में भारित वापस प्रक्षेपण द्वारा उत्पन्न Tomogram "गणना है. "पोस्ट प्रोसेसिंग" tomogram के ब्याज और ब्याज की संरचनाओं की सीमा में विपरीत स्केलिंग के XY क्षेत्र के लिए फसल में सक्षम बनाता है, हटाता मध्यवर्ती फ़ाइलें "सफाई" और डिस्क स्थान को मुक्त कर देते है.

आठवीं. डाटाबेस में Tomograms का भंडारण

हम एक वेब आधारित घर में संगठित डेटाबेस, स्टोर, खोज, और tomographic डेटा वितरित का उपयोग करें. प्रत्येक झुकाव श्रृंखला के लिए, हम नमूना विवरण, माइक्रोस्कोप संग्रह पैरामीटर, कच्चे झुकाव श्रृंखला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जुड़े 3D पुनर्निर्माण और अन्य संसाधन फ़ाइलों को रिकॉर्ड कर सकते हैं. मुख्य ब्राउज़िंग पृष्ठ थंबनेल छवि प्रस्तुत करता है और प्रत्येक tomogram के लिए फिल्म की तरह एक विशेष रुप से प्रदर्शित "यूट्यूब" प्रविष्टियों और डाउनलोड आवृत्ति, निर्माता, नमूना प्रकार या तारीख द्वारा आयोजित किया जा सकता है है. उपयोगकर्ता खोजशब्दों या विशेष सुविधाओं में प्रवेश करके डेटाबेस खोज कर सकते हैं. वर्तमान में 4,500 से अधिक tomographic झुकाव श्रृंखला के डेटाबेस में जमा है, प्रजातियों / नमूना के लगभग 60 प्रकार के कवर 11,000 से अधिक संबद्ध फ़ाइलों के एक कुल के साथ.

ग्यारहवीं. विश्लेषण और Tomograms के विभाजन

tomograms के संरचनात्मक विवरण और देखा जा सकता है छवि प्रसंस्करण उपकरण, जैसे जैप XYZ, और Slicer खिड़की के साथ IMOD के 3dmod दर्शक के साथ विभिन्न सॉफ्टवेयर के माध्यम से विश्लेषण किया.
अगले कदम के 3D छवि (tomogram) के एक विभाजन बनाने के है. एक विभाजन 3D छवि के प्रत्येक voxel (बड़ा पिक्सेल) के लिए प्रदान करती है जो क्षेत्र या सामग्री voxel अंतर्गत आता है, उदाहरण के लिए, एक झिल्ली या एक cytoskeleton वर्णन लेबल. हम IMOD और Amira (व्यक्तित्व इमेजिंग) में 3dmod जैसे सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग करें.
हालांकि कुछ सॉफ्टवेयर टूल्स स्वचालित विभाजन मॉड्यूल (उदाहरण के लिए, दहलीज विभाजन) प्रदान करते हैं, वे अक्सर ही उच्च विपरीत के साथ छवियों के लिए काम. 3 डी छवियों कम खुराक इलेक्ट्रॉन cryotomography से व्युत्पन्न इतनी कम विपरीत है कि ज्यादातर मामलों में हम करने के लिए मैन्युअल रूप से प्रत्येक voxel के लिए एक लेबल आवंटित किया है.
विभाजन एक अलग डेटा फ़ाइल में संग्रहीत किया जाता है. यह एक सतह मॉडल है जो प्रत्येक क्षेत्र में एक अलग रंग के साथ दिखाया गया है और 3 डी में देखा उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
tomograms अन्य विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, टेम्पलेट मिलान और बाद में गणना macromolecular ribosomes के रूप में ऐसी जटिल सांख्यिकीय जानकारी उपज सकती है. Subvolume संरेखण और औसत उच्च विपरीत में संरचनाओं से पता चलता है और महीन विवरण से पता चलता है.

एक्स tomograms पर आधारित फिल्में बनाना

हम फिल्में बनाने के लिए प्रत्येक परियोजना को संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए और हमारे tomographic छवियों का एक दृश्य दौरे दे.

डेटा में सुविधाओं का एक स्क्रिप्ट हम दिखाने के और कैसे उन सुविधाओं को प्रदान करने के लिए करना चाहते हैं. उदाहरण के लिए, टोमोग्राफी पूरे सेल परियोजना के एक विशिष्ट फिल्म में, हम एक प्रतिनिधि झुकाव श्रृंखला डेटा दिखा और फिर खंगाला tomogram टुकड़ा द्वारा टुकड़ा के एक दृश्य के साथ पालन द्वारा शुरू. अगला, हम सेल में महत्वपूर्ण अणुओं के विखंडन, उदाहरण के लिए, एक flagellar मोटर या एक chemoreceptor जटिल या एक साइटोसोलिक फिलामेंट दिखा. अंत में, हम एक मॉडल के साथ बड़े अणुओं हम अध्ययन कर रहे हैं की एक idealized व्याख्या दिखा समाप्त.
ग्राफिक्स Amira या कल्पना के रूप में प्रतिनिधित्व सॉफ्टवेयर फिल्म के व्यक्ति अभी भी फ्रेम रेंडर करने के लिए उपयोग किया जाता है. हम आम तौर पर छोटे क्लिप से फिल्मों को इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक क्लिप के लिए परिवर्तन की सुविधा.
Adobe Premiere जैसे व्यावसायिक फिल्म संपादन सॉफ्टवेयर का प्रयोग अंतिम फिल्म में फिल्म क्लिप में अभी भी फ्रेम, और फिर फिल्म क्लिप को इकट्ठा.
हम एक ऑडियो ट्रैक है कि फिल्म बयान जोड़ने के लिए शुरू कर दिया है. कथन एक "फिल्म कथा" के रूप में कार्य करता है और जबकि फिल्म देख डेटा प्रस्तुत किया जा रहा है पर ध्यान केंद्रित करने के लिए दर्शकों की अनुमति देता है है.

ग्यारहवीं. एनिमेशन

दृश्यकहानी कहने विशिष्ट वैज्ञानिक डोमेन के जटिल शब्दावली की आवश्यकता के बिना ज्ञान वालों में था. कठिन अवधारणाओं को सरल हो जाते हैं जब दृश्य प्रदर्शन के साथ. कार्टून के साथ जैविक विचारों illustrating का अभ्यास नया नहीं है. हालांकि, पिछले एक दशक में ही पेशेवर 3D सामग्री निर्माण किया गया है वैज्ञानिक एनिमेशन के निर्माण के काम पर सहन लाया परिष्कृत उपकरण है. वहाँ अब कर रहे हैं शोधकर्ताओं के दर्जनों सक्रिय रूप से गतिशील 3 डी एनिमेशन में जैविक प्रणालियों अनुवाद हैं. कई खूबसूरत एनिमेशन पर प्रदर्शन कर रहे हैं http://MolecularMovies.org . यह साइट भी ट्यूटोरियल मेजबान और Autodesk माया में आणविक संरचना से छेड़छाड़ के लिए एक मुक्त टूलकिट वितरित. खुला स्रोत 3D सामग्री सूट, ब्लेंडर, कई उत्पन्न उपयोगकर्ता PDB आयातकों शामिल हैं.

एक 3 डी एनीमेशन बनाने की प्रक्रिया आम तौर पर तीन चरणों शामिल हैं:

मॉडलिंग: हम ग्राफिक्स प्रतिनिधित्व सॉफ्टवेयर का उपयोग करें कि माया में आयात किया जा सकता है है प्रारूपों में सतहों निर्यात. इन सतहों खंगाला tomograms से भी segmentations हैं, उदाहरण के लिए, झिल्ली, granules, या filaments या आणविक सतहों के अभ्यावेदन. Tomogram segmentations Amira में प्रदर्शन कर रहे हैं, आणविक सतहों कल्पना या VMD में उत्पन्न कर रहे हैं. अणुओं के परमाणु प्रतिनिधित्व PDB फ़ाइलों से माया में सीधे आयात कर सकते हैं. एक बार मॉडल माया के भीतर हैं, वे संशोधित किया जा सकता है दोहराया, और उचित रूप में तैनात है.
Animating: एनिमेशन पारंपरिक रूप से हाथ से कलाकार मैन्युअल रूप से चलती वस्तुओं को स्थानांतरित करने और कुंजी तख्ते की एक श्रृंखला रिकॉर्डिंग के साथ, निर्माण कर रहे हैं. 3 डी ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर में नई प्रगति अब गतिशीलता procedurally उत्पन्न करने के लिए मॉड्यूल और पटकथा एपीआई का निर्माण के माध्यम से, की अनुमति.
प्रतिपादन: प्रक्रियात्मक गतिशीलता जैसे संरचनात्मक आत्म - विधानसभा गतिशील जैविक प्रक्रियाओं के कायल एनिमेशन प्रदान कर सकते हैं. वास्तविक जैविक प्रणालियों अनुकरण करने की कठिनाई के कारण फिर भी, 3 डी एनिमेशन के बहुमत अभी भी परंपरागत मुख्य फ्रेम तकनीक का उपयोग कर बनाया जाता है. एक बार गतिशीलता क्रम में हैं, दृश्य एनोटेशन, textures, और प्रकाश प्रभाव जोड़ा जा सकता है. अंत में, कैमरा रास्ता चुना है और पूरा एनीमेशन फिल्म में गाया है.

Discussion

हम इस वीडियो लेख में बताते हैं कैसे बैक्टीरियल कोशिकाओं के ECT के करने के लिए. स्थान और समय के द्वारा सीमित है, हम केवल सामान्य प्रोटोकॉल दिखा. अधिक जानकारी के कागजात, ऑनलाइन या अन्य उपकरण और सॉफ्टवेयर डेवलपर्स के विनिर्माण के द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी, और ECT अनुसंधान समूहों से पाया जा सकता है. अलग बैक्टीरियल प्रजातियों पर निर्भर करता है अध्ययन किया है, उपकरणों का इस्तेमाल किया है और कोशिकाओं में संरचनात्मक ब्याज, प्रोटोकॉल और प्रयोगात्मक मापदंडों का परीक्षण करने के लिए और अनुकूलित की जरूरत है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय स्वास्थ्य AI067548 R01 अनुदान, GM081520 R01, R01 GM086200, R01, AI049194 और P01 GM066521 GJJ संस्थान के रूप में अच्छी तरह के रूप में हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट, कैलटेक में Beckman संस्थान, और से कैलटेक के लिए उपहार के द्वारा समर्थित किया गया गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन और Agouron संस्थान. MSL पामेला एस Björkman एनआईएच 2R37-A1041239-06A1 अनुदान द्वारा समर्थित है. Leica माइक्रोसिस्टम्स इंक कृपया cryosection संग्रह की वीडियो सामग्री प्रदान की है. Treponema primitia के प्रतिनिधि परिणाम एकत्र संसाधित गेविन ई. मर्फी द्वारा, और शीर्षक "Treponema primitia और गतिशीलता के लिए अपने प्रभाव के उपन्यास ultrastructures" के साथ आण्विक माइक्रोबायोलॉजी में प्रकाशित. (मर्फी, जी एट अल. Mol Microbiol 67, 1184-1195, 2008).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	0.1% solution
MKIII Vitrobot	FEI
Gold colloid solution	Sigma-Aldrich	G1527-25ml	10 nm
Bovine serum Albumin	Invitrogen	P2489	10%
Nr 1 Filter paper	Whatman, GE Healthcare	1001 055
Dextran	Sigma-Aldrich	31389	15-25%, MW 39000
Brass-domed planchet	Swiss Precision Company
Bal-Tec HPm 010 high pressure freezer	Leica Microsystems
Cryo-ultra microtome UC6/FC6	Leica Microsystems
Diamond cryo trim 45	Diatome
Static line II ioniser	Diatome
CX100 Dry shipper	Taylor-Wharton
MSH loading station	Gatan
Ti E/B inverted microscope	Nikon Instruments		Custom
Cryo LM stage	FEI		Custom
TF30-polara	FEI		With UltraCam from Gatan
Amira	Visage Imaging