细菌细胞的电子Cryotomography

Summary

我们在这里说明如何使用电子cryotomography（ECT）的研究在附近的原生状态的细菌细胞超微结构，“大分子”（〜4 nm）的决议。

Abstract

尽管已经称为细菌细胞的基本新陈代谢，许多基本问题仍然令人惊讶的答复，例如，包括他们是如何产生和保持特定的细胞形态，建立极性，分离它们的基因组，并鸿沟。为了了解这些现象，成像技术，桥梁之间的荧光光学显微镜的分辨率和更高分辨率的方法，如X射线晶体学和核磁共振光谱的差距。

电子cryotomography（ECT）是一项新兴技术，它就是这样，使细胞超微结构在附近的原生状态的可视化，三维（3D）与“大分子”的决议^{（〜4nm），1，} 2 ECT的，细胞成像中的玻璃体，“冻结”在一个低温透射电子显微镜在低温（cryoTEM）水合状态（<-180℃）。细长的细胞（高达〜500纳米^厚 3），完整的细胞暴跌冻结范围内跨乙烷或乙烷/丙烷混合物的制冷剂，如EM电网的媒体。较厚的细胞和生物膜也可以在玻璃态成像第一“的高压冻结”，然后，“冷冻切片”他们。一系列的二维投影图像，然后通过样品的收集，因为它是逐步沿着一个或两个轴倾斜。一个三维重建，或“断层扫描”，然后可以从图像中计算。近年来，虽然ECT的需要昂贵的仪器，它已在几个实验室使用，以揭示各种外部附属物的结构，结构的信封不同的细胞，细胞骨架细丝的位置和结构，并地点和大大分子结构集会，如鞭毛马达，内部隔层和化学感受器阵 ​​列^1， 2

在这个视频文章中，我们说明如何细胞与ECT的形象，包括样品制备过程，数据收集，断层扫描重建，并通过分割和在某些情况下，光镜相关的结果的解释。

Protocol

一，细菌细胞培养制备

1. 在其正常的媒体生长的细菌细胞在几毫升液体培养所需的阶段。如果需要浓度较高，纺纱，并可以通过新媒体的再悬浮，但要知道，这个过程有时会介绍了细胞结构的变化。
2. 在光镜下检查，以确保文化是无污染物，并在适当的合流。
3. 有些细菌的细胞能够坚持，甚至上生长的EM电网。当电网，电网与碳大衣金生长的细胞，是最常用，以避免细胞毒性。他们应该焕发出院2分钟，下一个15分钟的紫外灯灭菌，直接放入液体培养基。贴壁细胞，自然会坚持到网格，和其他人可以提示坚持涂层的电网电网聚- L -赖氨酸0.1％第一。在光镜下检查电网首先，以确保细胞的浓度是适当的冻结前。

二。切入冻结瘦细胞

对于薄的细菌细胞，完整的细胞悬浮液是跨EM电网冻结的暴跌。该过程会保留超结构的细菌细胞，并防止水分蒸发后在高真空的EM。这是可以做到定制暴跌冷冻设备，或我们在这里展示与商业冷冻室自动暴跌，飞Vitrobot MKIII 。

1. 辉光放电的碳包覆EM网格2 - 4分钟。这使得电网的表面亲水性，从而帮助均匀地分散到整个电网的样本。
2. 混合5％集中BSA溶液25μl100μL胶体金溶液（颗粒直径为10 nm）。 BSA的大衣的金颗粒，并防止其聚集。
3. 离心机在18000克BSA和15分钟的黄金粒子混合物。取出上清液后，剩余的黄金颗粒混合与20μL的细胞解决方案。 BSA处理的黄金粒子不与细胞发生反应，但他们将作为基准标记重建的tomograms需要。
4. 应用4μL的细胞和金溶液混合EM网格在100％湿度的Vitrobot出院辉光。网格，然后自动抹杀双方NR 1滤纸。这将删除多余的液体，仍然是这样，只有在他们的媒体细胞薄膜。网格，然后迅速下跌到约77K液氮降温的乙烷和丙烷液体混合物。在这个过程中，样品被冻结如此迅速，防止冰晶的形成是在薄膜<1微米。
5. 小心取出乙烷/丙烷混合物的电网，并迅速转移到网格储物盒，是根据液氮保存。

三。高压冷冻和低温较厚的细胞切片

对于较厚的细胞，高压冷冻减少冰结晶和随后的冷冻切片呈现样本足够薄^{电磁成像的5，6，7}有许多不同的标本持有人可用于高压冷冻，您的选择将取决于样品的类型用于冷冻机或应用程序中选择的调查。在这里，我们使用BAL - Tec的HPM 010高压力冰箱和冷冻超切片模型UC6/FC6徕卡显微系统。

1. 对于细菌，15mls微调文化外径> 0.5采取直接从37℃培养箱中培养，在1000RPM离心3分钟。然后，取出后用20％右旋糖酐冷冻保护剂0.5毫升上清液，余下的文化沉淀的混合0.5毫升在13000rpm离心15秒。
2. 去除上清液后，超级颗粒吸管0.1毫升粘贴到热封微量提示已经包含0.2毫升20％右旋糖酐cryoprotecant（40000Mwt）。 13000 RPM为30秒的微管尖端的混合物离心，去除上清液。 5-10μL紧颗粒被认为是在密封的提示。
3. 一个“特富龙”涂层的黄铜圆顶planchet在高压冷冻持有人的手臂准备安装接收粘贴在一个半圆顶和与平面伙伴黄铜帽子密封。
4. ARM汇编，然后迅速插入的催芽高压冷冻冻结。
5. 含有细胞结合黄铜planchet单位在2100巴的压力正在迅速喷射高压液氮冷却，ARM汇编即刻消除，并陷入液氮浴，防止气候变暖的planchet。
6. Planchet单位储存在液氮，直至冷冻切片。
7. 为了揭露对切片的细胞​​冷冻球，两个黄铜planchets仔细分离undeř液氮。
8. 细胞完全冻结的圆顶是玻在外观上的裂缝和冰核裂隙。
9. 这planchet是转移到预冷的-170 ° C室，并牢固地安装在冷冻切片机夹头副。
10. 冷却cryomicrotome包含必要的必要的cryotools，对切片的，其中包括：低角度低温金刚石刀，金刚石修整工具，按平台，网格储物盒，防静电喷涂机和电网控股仪器。
11. 对于切片外的圆顶地区的成功色带初步形<0.2毫米平方米的金刚石修整工具和快速的切割速度，同时保留了〜200μm的深度以及冻结周边。
12. 在低角度刀和铜在靠近支持电网的防静电喷雾，钻石刀是准备为切片抛光块面仔细先进。
13. 切片机的参数选择，如一个切片厚度设置50至350纳米之间，连同〜0.4mm/sec和切割窗口窄的切割速度。重要的是要控制的防静电喷雾的范围和强度低湿度条件下，在不久的面积。
14. 由于第一部分是制作了精美的睫毛撒施是操纵手或显微嵌入滑出低角度的钻石刀刃的早期部分。
15. 节剪彩，虽然被迫关闭的刀，他们轻轻地支持由睫毛探头，通过附近的铜网支持指导。
16. 要坚持的部分，装入用丝带网格，然后坚定地按下使用水冷抛光银探头，部分路段是如此高电荷最新的防静电设备，可协助在粘附过程。
17. 电网盒都保存在液氮冷却的干托运人长期贮存，直到在显微镜是电网传输。

四。使用低温光学显微镜检查细胞

可以使用的低温光镜下（cryoLM）成像对电网的细菌细胞。我们这里使用的显微镜​​是一个自定义的尼康倒置显微镜TI E / B的超长工作距离（ELWD）60X空气物镜。成像，这是一个改装费冷冻光镜下阶段期间，电网保持在低温阶段。使用取景网格，可位于细胞上的方格和cryoEM tomograms相关cryoLM图像。

1. 装入冷冻站的墨盒电网。墨盒是从我们标准的EM墨盒费TF30H polara修改定制。电网是铜剪辑环。碳粉盒，然后在管在液氮转移中保存。
2. 酷液氮温度（-190℃）的低温阶段。
3. 墨盒装入冷冻阶段，并移动到网格的观景窗。舞台可容纳多达两个自定义的修改墨盒。
4. 下聚光镜和60X物镜聚焦到电网。
5. 查找细胞和拍摄图像。对于相关的LM和EM研究，电网扫描周围区域的细胞，定位的细胞后在EM。
6. 成像后的网格，把墨盒放回管，并保存在液氮管，直到准备在EM成像。

五，收集倾斜系列在低温透射电子显微镜

为了获得一个细菌细胞的三维断层扫描，采取一系列投影图像，而样本是增量沿着一个或两个轴在低温透射电子显微镜倾斜。由于倾斜角度和其他实验设置，有几个不同的软件可以自动收集倾斜系列。我们用我们的低温透射电子显微镜，这是费TF30H polara Leginon。它允许自动倾斜系列预选细胞。

1. 预冷冷冻站的墨盒装入持有多选（MSH）。 MSH最多可容纳6个墨盒。
2. TF30H - polara的MSH的连接，挑一个墨盒，并把它​​插入到EM列。
3. 开始对EM计算机和Leginon上的其他工作站的主要方案的Leginon客户端。
4. 设置预置（图像条件），为一个Leginon会话。最重要的参数是放大倍率，根据重点的价值，电子剂量和倾斜一系列的倾斜角度，包括起始角度，终止角度和增量。
5. 从最低放大倍率开始图像选择的目标，并发送具有较高的放大倍率，他们下一步。
6. 排队倾斜系列收集的所有目标，并提交所有这些最后的“断层”的一步。
7. 通过从本地工作站的网络工具，可以监视数据收集的过程。
8. 实验数据收集完成后，同比下降加载到本地工作站为重建完成的倾斜系列。

六。生物安全考虑

大多数的生物样品，我们的工作与非致病性，并已经从土壤，自来水或昆虫的肠道中分离。基本无菌技术操作是足够的处理这些样本。病原体的工作需要额外的安全步骤的实施，但是，对于极端的危害，一些实验室已经安装了整个冷冻电镜在B​​SL - 3实验室显微镜。以下是一些我们减少风险的工作在我们的实验室病原体的的方法。

1. 化学或基因样品的致病性，可以减毒。许多实验室的病毒，做冷冻电镜暴跌冻结之前与化学固定剂灭活。作为替代方案，关键突变可以推出，导致非感染性的样品，包括点突变在某些酶的失活或淘汰受体的实例。
2. 应戴手套，实验室外套和护目镜等个人防护装备。
3. 有害样品可以在生物安全柜（BSC）的处理。可以生长的细菌培养，浓缩，甚至到新兴市场大跌冻结在BSC电网。我们已经较小，人工插的冷冻设备，到我们BSC的适合于这一目的。如果自动暴跌冰柜提供更大的一致性是必要的，它们可以被引入平衡计分卡，或更简单，在某些情况下，我们支持我们Vitrobot的印迹垫用铝箔，以防止污染设备。与BSC的工作时，许多可能的工具和材料进入或内阁应消毒，用70％乙醇。当我们准备我们的电网，使用小体积的细菌或病毒培养（通常为4 UL），其中大部分得到的Whatman纸吸干。吸墨纸，枪头，和其余的文化作为生物危险废物处置。所有的工具和暴露的表面，用稀释的漂白剂，95％的乙醇，然后水消毒。
4. 电网一旦被冻结，他们在整个存储和数据收集液氮温度下保存。虽然，它已被证明，细胞可以生存冻结，然后解冻，所以我们继续来对待他们作为整个存储和数据收集的危险。数据收集，含冷冻电网的墨盒从低温透射电子显微镜和直接下降到70％的酒精。虽然罕见，但应注意到，有时电网“下降”列内，此类事件的后果应为每个危险的样本设想。大多数显微镜在室温，所以在下降电网的样品可能会列内解冻，成为完全的EM超高真空干燥。这显然​​灭活一些生物样品，但也许没有强大的病毒，和干燥样品的残余可能被显微镜列下次打开服务时的气溶胶释放。

七。断层扫描重建

细菌细胞tomograms，是通过软件重建。有几个软件，用于这项工作。我们使用自动重建和筛选tomograms的“ ^猛禽 ”，9自动倾斜的一系列调整和随后的重建是一个不平凡的任务，猛禽目前不会有100％的成功率。在猛禽出现故障或需要高品质的重建的情况下，我们使用手动图像对齐和与eTomo重建中的IMOD断层^{软件套件。} ，10，11

1. 从本地Leginon Web服务器的每个下载的个人倾斜系列。保存在一个地方，他们可以很容易地所在的目录。
2. 手动检查使用的IMOD的3dmod观者倾斜系列，抛弃那些Leginon已经失败时，跟踪目标，或产生一个有用的倾斜系列。
3. 我们运行猛禽分布在实验室中通过桃 （珍珠为基础的系统，通过网络分发任务）在Linux机器。我们指定我们的基准标记的大小，即胶体金颗粒，标记为重建，像素大小，重建所需的厚度，分级的因素和一些基本设置，如输入（输出路径和输出格式在命令行）和离开它运行，一般20分钟至2H 122图像数据集（2K由2K）。如果与重建的结果感到满意，在本节下面的步骤可以跳过。
4. 当需要手动重建，重命名“。MRC”文件“。ST”和个人倾斜加载到eTomo GUI在IMOD断层套房系列。
5. 指定倾斜系列轴型（单或双轴），并进入SA使用的基准尺寸mple准备。扫描的文件头，以确定像素大小，然后继续点击“创建COM脚本”。
6. 在eTomo GUI中的每个选项卡的步骤重建倾斜一系列的断层扫描。检查和核实后，每个步骤的结果，如果不满意，我们可以随时回去，从有到以前的任何步骤，并重新处理。 “前处理”，是执行准备处理和删除异常像素高强度X射线引起的。 “粗对准”产生一个倾斜的系列，其中随后每个倾斜系列投影图像对齐到以前的交叉相关。我们定义的黄金珠使用“基准模型生成”的基准点，并计划在每个投影图像跟踪的基准指标，并建立了“美术对齐”。 “断层扫描定位”允许种植的断层扫描在Z“最终不结盟栈”是使用线性插值和功能，如周大福改正，黄金橡皮擦及2D滤波可以选择性地应用于产生。断层扫描是在“生成断层扫描”Fourier空间中的加权反投影计算。 “后处理”，使种植的断层扫描XY区域的利益和缩放在利益结构的范围对比，并“清理”删除中间文件并释放磁盘空间。

八。存储在数据库中的Tomograms

我们使用一个基于Web的内部数据库来组织，存储，搜索，并分发层析成像数据。对于每个系列倾斜，我们可以记录样品的详细信息，显微镜收集参数，原材料倾斜系列以及相关的三维重建和其他处理的文件。主浏览页面显示缩略图图像，并可以通过下载的频率，创作者，标本类型或日期举办一个有特色的“YouTube”电影就像每个断层扫描和条目。通过输入关键字或特殊功能，用户可以搜索的数据库。目前已超过4500个断层倾斜系列存放在数据库中，占地近60种/标本的类型，共有超过11,000名关联的文件。

九。分析和分割的Tomograms

1. tomograms的结构细节，可以查看和分析，通过不同图像处理工具，如观众与ZAP，XYZ和切片窗口的IMOD 3dmod软件。
2. 下一步是创建一个分割的三维图像（断层扫描）。分段分配给每个体素（体积像素）的三维图像的标签描述体素是属于哪个地区或材料，例如，膜或骨架。如IMOD和阿米拉（Visage的影像）3dmod我们使用的软件工具。
3. 虽然一些软件工具，提供自动分割模块（例如，阈值分割），他们往往只工作与高对比度的图像。从低剂量电子cryotomography所得的三维图像，低对比度，在大多数情况下，我们必须手动分配一个标签，每个体素。
4. 分割存储在一个单独的数据文件。它可用于生成一个表面模型，在每个区域用不同的颜色显示在3D查看。
5. tomograms可用于其他分析。例如，模板匹配和随后的计算，可以产生如核糖体等大分子复杂的统计信息。子卷对齐和平均显示了更高的对比度的结构，并揭示了更精细的细节。

十，基于tomograms电影

我们拍电影，总结每一个项目，并给予我们的断层图像的视觉之旅。

1. 做一个脚本在数据的功能，我们想表明，如何使这些功能。例如，在整个细胞的断层项目的一个典型的电影，我们开始通过展示有代表性的倾斜的一系列数据，然后按照一个重建的断层扫描片由片。下一步，我们将展示一个关键大分子在细胞内，例如分割，鞭毛马达或化学感受器复杂或胞质长丝。最后，我们的结论显示一个理想化的解释我们正在研究的大分子模型。
2. 阿米拉或嵌合体图形，如代表性的软件是用来呈现电影的个人静帧。我们通常组装较短的剪辑的电影，以方便每个剪辑的变化。
3. 使用商业电影编辑软件如Adobe Premiere组装成最终的影片到影片剪辑中的静帧，然后在影片剪辑。
4. 我们已经开始添加音轨，叙述了电影。旁白作为“电影传奇”，让观众把重点放在数据一边看电影。

十一。动画

视觉讲故事的通信，而无需复杂的词汇具体的科学领域的知识。难以理解的概念变得简单时，伴随着视觉示范。实践说明生物与动画片的想法是不是新的。然而，仅在过去十年中被带到承担建设科学动画的任务的专业3D内容创建复杂的工具。现在有几十个研究人员，积极转化为生物系统的动态三维动画。许多美丽的动画展示http://MolecularMovies.org 。该网站还举办了教程和分配操纵Autodesk Maya中的分子结构的一个免费的工具包。开源的3D内容套房，搅拌机，包含几个用户生成的PDB进口商。

三维动画的过程一般包括三个步骤：

1. 建模：我们使用图形代表性的软件，可以进口到玛雅的格式导出到表面。这些表面重建tomograms之一分割，例如，膜，颗粒剂，或细丝，或分子表面的交涉。在阿米拉断层扫描分割;分子表面生成嵌合体或VMD。原子分子表示可以直接导入到PDB文件玛雅。一旦在Maya的模型，他们可能会被修改，复制，和适当的定位。
2. 动画：动画传统手工建造与艺术家手工搬迁移动的物体，并录制了一系列关键帧。三维图形软件中的新进展，现在允许程序动态生成，通过内置的模块和脚本API。
3. 渲染：程序动态动态的生物过程，如结构的自组装，可以提供有说服力的动画。然而由于现实地模拟生物系统的困难，三维动画，大部分仍采用传统的关键帧技术。一旦动力，为了视觉的注释，纹理和照明效果可能会增加。最后，相机的路径选择，并完成动画电影中呈现。

Discussion

我们出现在这个视频文章怎么做ECT的细菌细胞。空间和时间的限制，我们只能显示一般的协议。更多细节，可以发现在论文，网上或其他的设备和软件开发商的制造商提供的信息，和ECT的研究小组。根据不同的细菌种类的研究，所使用的设备，并在细胞的结构利益，协议和实验参数需要测试和优化。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	0.1% solution
MKIII Vitrobot	FEI
Gold colloid solution	Sigma-Aldrich	G1527-25ml	10 nm
Bovine serum Albumin	Invitrogen	P2489	10%
Nr 1 Filter paper	Whatman, GE Healthcare	1001 055
Dextran	Sigma-Aldrich	31389	15-25%, MW 39000
Brass-domed planchet	Swiss Precision Company
Bal-Tec HPm 010 high pressure freezer	Leica Microsystems
Cryo-ultra microtome UC6/FC6	Leica Microsystems
Diamond cryo trim 45	Diatome
Static line II ioniser	Diatome
CX100 Dry shipper	Taylor-Wharton
MSH loading station	Gatan
Ti E/B inverted microscope	Nikon Instruments		Custom
Cryo LM stage	FEI		Custom
TF30-polara	FEI		With UltraCam from Gatan
Amira	Visage Imaging