Elektron Cryotomography av bakterieceller

Summary

Vi illustrerar här hur du kan använda elektron cryotomography (ECT) för att studera ultrastruktur bakterieceller i nära infödda stater att "makromolekylära" (~ 4 nm) upplösning.

Abstract

Även om mycket redan är känt om den grundläggande metabolismen av bakterieceller, många grundläggande frågor fortfarande är förvånansvärt obesvarade, exempelvis vad gäller hur de skapar och upprätthåller specifik cell former, skapa polaritet, segregerar sina genom, och dividera. För att förstå dessa fenomen, är imaging teknik som behövs för att överbrygga upplösningen klyftan mellan fluorescens ljusmikroskopi och högre upplösning metoder såsom röntgenkristallografi och NMR-spektroskopi.

Electron cryotomography (ECT) är en ny teknik som gör just detta, vilket gör att ultrastruktur celler som skall visualiseras i en nästan infödd staten, i tre dimensioner (3D), med "makromolekylära" upplösning (~ 4nm). ^{1, 2} I ECT är celler avbildad i en glaskroppen, "frozen-hydrerad" stat i ett Cryo transmissionselektronmikroskop (cryoTEM) vid låg temperatur (<-180 ° C). För smal celler (upp till ca 500 nm i tjocklek ^3), intakta celler är kasta-frysas inom media över hela EM-nät i cryogens såsom etan eller etan / propan blandningar. Tjockare celler och biofilmer även kan avbildas i ett glaskroppen tillstånd genom att först "högt tryck frysning" och sedan "kryo-snittning" dem. En serie av två-dimensionell projektion bilderna sedan samlas in via provet som är stegvis lutar längs en eller två axlar. En tredimensionell rekonstruktion, eller "tomogram" kan sedan beräknas från bilderna. Medan ECT kräver dyra instrument, under de senaste åren har den använts i ett fåtal laboratorier för att avslöja strukturer av olika yttre bihang, strukturer annan cell kuvert, positioner och strukturer cytoskelettala trådar, och de platser och arkitekturer för stora makromolekylära församlingar som flagellar motorer, invändiga fack och arrayer chemoreceptor. ^{1, 2}

I denna video artikeln illustrerar vi hur bilden celler med ECT, inklusive processerna för provberedning, datainsamling, tomogram återuppbyggnad och tolkning av resultat genom segmentering och i vissa fall korrelation med ljusmikroskop.

Protocol

I. Förberedelse av bakterie kultur

1. Väx bakteriecellerna i sin normala media till önskad fas i ett par ml vätska kultur. Om högre koncentration behövs, spinning och resuspension av färskt media kan antas, men tänk på att denna process ibland inför strukturella förändringar i cellerna.
2. Kontrollera i ljusmikroskop att se till att kulturen är fri från föroreningar och vid en lämplig sammanflöde.
3. Vissa bakterieceller kan hålla eller till och med växa på EM näten. När växande celler på galler, guld nät med en kol päls används oftast för att undvika toxicitet till cellerna. De ska lysa ut i 2 minuter, steriliseras under UV-ljus i 15 minuter, och placeras direkt i vätskan kulturen. Vidhäftande celler kommer naturligtvis att hålla sig till nätet, och andra kan bli uppmanad att ansluta sig till nätet genom beläggning nätet i 0,1% poly-L-lysin först. Kontrollera nät i ljusmikroskop först för att se koncentrationen av celler är lämpligt före frysning.

II. Plunge frysning tunna celler

För tunna bakterieceller, är upphävandet av intakta celler kasta frysta över ett EM rutnät. Processen bevarar ultra-strukturen i bakterier celler och att undvika att vatten avdunstar i högt vakuum i EM senare. Det kan göras antingen med specialanpassade produkter störta frysning, eller som vi visar här, med en kommersiell automatisk djupdykning frys, FEI Vitrobot MKIII. ⁴

1. Glow utsläpp av kol belagda EM nätet för 2 - 4 minuter. Detta gör ytan på nätet hydrofila, vilket bidrar till att jämnt sprida urvalet över hela nätet.
2. Blanda 100μl kolloidalt guld lösning (partikel diameter på 10 nm) med 25μl i en 5% koncentrerad BSA lösning. BSA rockar guldpartiklar och det hindrar de sammanräknas.
3. Centrifugera BSA och guld partikel blandning på 18000g i 15 minuter. Efter att supernatanten, är den återstående guld pellets blandas med 20 l cell lösning. BSA behandlade guldpartiklar reagerar inte med celler, men de kommer att behövas som referenspunkternas markörer för rekonstruktion av tomograms.
4. Applicera 4 l av cellen och guld lösning blandningen till glöden ut EM-nätet i Vitrobot vid 100% luftfuktighet. Nätet är då automatiskt utplånas från båda sidor med Nr 1 filterpapper. Detta tar bort överflödig vätska, så att endast en tunn film av celler i sina medier kvarstår. Nätet är sedan störtade snabbt till en flytande blandning av etan och propan som kyls ner till ca 77k med flytande kväve. Under denna process är provet frysas så snabbt att det bildas iskristaller förhindras i tunna filmer <1 mikrometer.
5. Ta försiktigt bort gallret från etan / propan blandning och snabbt över till ett rutnät förvaringsbox som hålls under flytande kväve.

III. High Pressure Frysning och Cryo Sektionering av Tjockare celler

För tjockare celler minskar högtryck frysa is kristallisation och efterföljande Cryo sektionering gör prover tunt nog för EM bildbehandling. ^{5, 6, 7} Det finns många olika provhållare tillgängliga för högtryck frysning, kommer ditt val beror på provet, typ av frysning maskin som används eller den undersökande programmet valt. Här använder vi Bal-Tec HPM 010 högtryck frys och Cryo ultra mikrotom modell UC6/FC6 från Leica Microsystems.

1. För bakterier är 15mls spinner kultur OD> 0,5 tas direkt från 37 ° C inkubator och centrifugeras vid 1000rpm i 3 minuter. Efter att supernatanten, blanda 0,5 ml av den återstående kultur pellets med 0,5 ml av 20% dextran frysskyddsmedel och sedan centrifugera vid 13000rpm i 15 sekunder.
2. Efter att supernatanten pipett 0,1 ml av super pellets klistra in värmeförseglade mikropipett spets som redan innehåller 0.2ml 20% dextran cryoprotecant (40000Mwt). Centrifugera blandningen i mikropipett spets på 13 tusen rpm i 30 sekunder och ta bort supernatanten. En 5-10 l stram pellets ses på den förseglade spetsen.
3. En "Teflon" belagda mässing kupol plattan färdig monterad i det höga trycket frysen arm får klistra in i ett halv-kupol och är förseglad med sitt platta partner mässing hatt.
4. Armen församling är sedan snabbt in i primas högtryck frysen redo för frysning.
5. På 2100 bar det kombinerade mässing plattan enhet som innehåller cellerna snabbt kyls av en stråle av högt tryck flytande kväve, ta bort armen montering omedelbart och kastar sig in i ett bad av flytande kväve hindrar plattan från uppvärmningen.
6. Plattan enheter lagras i flytande kväve tills de skall Cryo-snittning.
7. Att avslöja den väl frusna kupol av celler för sektionering, är de två mässing planchets noggrant separerade under flytande kväve.
8. Den perfekt frusna kupol av celler är glansig, fri från sprickor och is sprickor kärnbildning.
9. Denna plattan överförs till en precooled -170 ° C kammare och säkert monterad på Cryo-mikrotomen vice som Chuck.
10. Den kyls cryomicrotome innehåller eteriska cryotools nödvändiga för sektionering, dessa inkluderar: en låg vinkel Cryo-diamant kniv, en diamant trimning verktyg trycker plattform, galler förvaringsbox, en antistatikspray enhet och ett rutnät håller apparat.
11. För framgångsrika band sektionering en yttre kupol regionen är initialt formas till <0,2 mm kvadrat med diamant trimning verktyg och en snabb sektionering hastighet med bibehållen ~ 200μm djup och frysta omkrets.
12. Med antistatspray riktade till låg vinkel kniven och koppar nät stöder i närheten, är diamant kniven försiktigt avancerat till polerat blocket ansiktet readied för sektionering.
13. Mikrotom parametrar väljs, till exempel en snittjocklek inställning mellan 50 och 350 nm, tillsammans med en skärhastighet på ~ 0.4mm/sec och smala skära fönster. Det är viktigt att kontrollera antistatspray sortiment och intensitet för låg luftfuktighet i närområdet.
14. Som första avsnitt är producerade en fin ögonfransar applikator manövreras för hand eller mikromanipulator att fastna den tidiga avsnitten glider av låg vinkel kanten diamant kniv.
15. Medan bandet av sektioner tvingas bort kniven, de är försiktigt stöd av en ögonfrans sond och guidade över koppar-nätet stöd närheten.
16. För att fästa delarna är rutnätet laddad med band sedan fast pressas med hjälp av en kyld polerat-silver sond, är vissa delar så laddade den senaste antistatiska enheter kan bistå i anslutningsprocessen.
17. Grid lådor hålls för långtidsförvaring i flytande kväve kyld torr avsändaren tills mikroskop är redo för stamnätet överföring.

IV. Undersök celler med Cryo ljusmikroskop

Bakteriecellerna på nätet kan avbildas med hjälp av Cryo ljusmikroskop (cryoLM). Mikroskopet vi använder här är en anpassad Nikon inverterat mikroskop Ti E / B med extra långa arbetsdagar avstånd (ELWD) 60x luften objektiv. Näten hålls i en Cryo skede bildbehandling, vilket är en modifierad FEI Cryo scen för ljusmikroskop. Med hjälp av en hitta nätet, kan cellerna finnas på rutor och cryoLM bilderna korrelerad till cryoEM tomograms.

1. Ladda galler i kassetter på Cryo-station. Patronerna är anpassade ändras från vår standard EM patron för FEI TF30H-Polara. Gallret hålls nere av ringar koppar klipp. Kassetten hålls sedan i ett rör i flytande kväve för överföring.
2. Kyl Cryo steget ner till flytande kväve temperatur (-190 ° C).
3. Lägg i patronen i Cryo scenen och flytta gallret i fönstret. Scenen rymmer upp till två egna modifierad patroner.
4. Sänk kondensorn objektivet och fokusera 60x objektivet på nätet.
5. Hitta cellerna och ta bilder. För korrelerade LM och EM studie är nätet skannade runt området av cellerna, för att lokalisera de celler senare i EM.
6. Efter bildbehandling nätet, sätt patronen tillbaka in i röret och håll röret i flytande kväve tills den ska avbildas i EM.

V. Samla Tilt-serien i Cryo TEM

För att få en 3D tomogram av bakterie, är en serie av projektion bilder tagna medan provet stegvis lutas längs en eller två axlar i Cryo TEM. Med tanke på lutning vinklar och andra experimentella inställningar, det finns flera olika programvaror för att automatiskt samla in lutningen serien. Vi använder Leginon för vår Cryo TEM som FEI TF30H-Polara. Det möjliggör automatiskt tar lutning serie förvalda celler. ⁸

1. Ladda patroner i flera val hållare (MSH) på precooled Cryo stationen. MSH rymmer upp till sex patroner.
2. Anslut MSH till TF30H-Polara, plocka en kassetten och sätt in den i EM-kolumnen.
3. Start Leginon-klienten på EM datorn och Leginon huvudprogram på den andra arbetsstationen.
4. Ställa in förinställningar (bild villkor) för en Leginon session. De viktiga parametrarna är förstoringen, den i fokus värde, elektronen dos och lutningsvinklar för tilt-serien, inklusive startvinkel, slut vinkel och steg.
5. Plocka mål på bilder med början från den lägsta förstoringen och skicka dem till nästa steg med högre förstoring.
6. Kö upp alla mål för tilt-serien insamling och skicka alla dem till den slutliga "tomografi" steg.
7. Processen för insamling av data kan övervakas via web-verktyg från en lokal arbetsstation.
8. Efter den experimentella datainsamlingen är klar, nerbelastning det färdiga tilt-serien på en lokal arbetsstation för återuppbyggnad.

VI. Biosäkerhet överväganden

De flesta av de biologiska prover som vi arbetar med är icke-patogen och har isolerats från jord, kranvatten eller tarmen av insekter. Grundläggande aseptisk teknik är tillräcklig för att hantera dessa prover. Arbeta med patogener kräver genomförandet av extra säkerhet steg dock för extrema risker, har en del labb installerat hela Cryo-EM mikroskop inom BSL-3 laboratorier. Följande är några av de sätt vi har minskat risken för att arbeta med patogener i vårt laboratorium.

1. Den patogenicitet av ett urval kan minskas antingen kemiskt eller genetiskt. Många laboratorier gör Cryo-EM av virus har inaktiverat dem med kemiska fixativ innan störta-frysning. Som ett alternativ kan knappa mutationer införas som gör proven icke smittsam, exempelvis vad gäller inaktivering punktmutationer i vissa enzymer eller slå ut receptorer.
2. Personlig skyddsutrustning såsom handskar, skyddsrock och skyddsglasögon ska bäras.
3. Farliga prover kan hanteras på ett biosäkerhet skåp (BSC). Bakteriekulturer kan odlas, koncentrerade, och till och med kasta-frysta på EM nät i BSC. Vi har ett mindre, manuell dopp-frysning enhet som passar in i vårt BSC för detta ändamål. Om större samstämmighet som erbjuds av automatisk kasta-och frysskåp är nödvändig, kan de antingen föras in i BSC, eller enklare i vissa fall har vi stött blotting kuddar i vår Vitrobot med aluminiumfolie för att förhindra förorening av enheten. När du arbetar med ett BSC, eftersom många av de verktyg och material som möjligt att gå in i eller ut ur skåpet skall desinfekteras med 70% etanol. När man förbereder vårt nät använder vi små volymer av en bakterie-eller virusodling (vanligtvis 4 UL), varav de flesta blir utplånade av Whatman papper. Den läskpapper, pipettspetsar, och återstående kultur om hand som biologiskt avfall. Alla verktyg och utsatta ytor desinficeras med utspätt blekmedel, 95% etanol och vatten.
4. När näten är frysta, de hålls på flytande kväve temperaturer under lagring och datainsamling. Det har visat sig att cellerna kan överleva frysning och upptining, dock, så vi fortsätter att behandla dem som farligt under lagring och datainsamling. I slutet av datainsamling, är patroner som innehåller frusna galler bort från kryo-TEM och föll direkt i 70% alkohol. Det är sällsynt, bör det noteras att ibland nät är "tappade" inuti kolonnen, och konsekvenserna av en sådan händelse bör övervägas om varje farlig prov. De flesta av mikroskop är i rumstemperatur, så provet på en tappad rutnät sannolikt skulle tina inuti kolonnen och bli helt uttorkad i ultrahögvakuum i EM. Detta skulle naturligtvis inaktivera vissa biologiska prover, men kanske inte robust virus, och de uttorkade resterna av provet skulle kunna frigöras i form av aerosoler när mikroskop kolumnen bredvid öppnas för service.

VII. Tomogram återuppbyggnad

Den tomograms av bakterieceller rekonstrueras genom programvara. Det finns flera program tillgängliga för detta jobb. Vi använder Raptor för automatisk återuppbyggnad och tomograms screening. ⁹ Som automatiserade luta serie anpassning och efterföljande rekonstruktion är en icke-trivial uppgift, Raptor närvarande inte har en 100% framgång. Vid Raptor fel eller behovet av en högkvalitativ återuppbyggnad, använder vi manuell bildjustering och återuppbyggnad med eTomo i imod tomografi programsvit. ^{10, 11}

1. Ladda ner varje enskild luta serie från den lokala Leginon webbserver. Spara dem i en katalog där de lätt kan placeras.
2. Manuellt inspektera lutningen serie med imod är 3dmod betraktaren och kasta dem när Leginon har misslyckats spåra målet eller leder till en bra lutning serie.
3. Vi kör Raptor fördelade över Linux-maskiner i labbet genom Peach (en Pearl-baserat system för att fördela arbetsuppgifter över ett nätverk). Vi anger storleken på våra referenspunkternas markörer, det vill säga kolloidala guldpartiklar, antal markörer som ska användas för återuppbyggnad, pixel-storlek, önskad tjocklek återuppbyggnad, binning faktor och ett antal grundläggande inställningar (t.ex. input, utgång vägar och utdataformat) på kommandoraden och låt den köra i allmänhet 20min till 2h för en 122-image-dataset (2k med 2k). Om nöjd med återuppbyggnaden resultat kan stegen nedan i detta avsnitt hoppas över.
4. När manuell rekonstruktion behövs, byta namn på filer från ". MRC" till ". ST" och ladda enskilda luta serien i eTomo GUI i imod tomografi sviten.
5. Ange luta typserien axeln (enkel eller dubbel axlar) och ange referenspunkter som används vid SAmple beredning. Scan filhuvudet att bestämma pixelstorlek, och fortsätt genom att klicka på "Skapa Com skript".
6. Följ stegen i varje flik i eTomo GUI att rekonstruera tomogram från lutningen serien. Inspektera och kontrollera resultatet efter varje steg, och om inte nöjda, vi kan alltid gå tillbaka till tidigare steg och bearbeta därifrån. "Pre-processing" är att utföra förberedande behandling och ta bort onormalt hög intensitet pixlar som orsakas av röntgenstrålning. "Grov anpassning" producerar en lutning serie där varje efterföljande projektion bild i lutning serien är anpassad till den tidigare genom cross-korrelationen. Vi definierar som guld pärlor att använda som fiducials i "referenspunkter Model Generation", och programmet spårar referenspunkternas markörer i varje projicerade bilden och bygger "Fine Alignment". "Tomogram Positioning" kan beskära tomogram i Z. "Final Aligned Stack" genereras med hjälp av linjär interpolation, och funktioner som CTF-korrigering, Gold-Eraser och 2D-filtrering kan användas valfritt. Den tomogram beräknas i "Generera Tomogram" med vägt back-projektion i Fourier rymden. "Post-processing" ger skörd på tomogram till XY-regionen av intresse och skalning kontrasten i intervallet av strukturerna för intresse, och "städa upp" raderas de mellanliggande filer och frigör diskutrymme.

VIII. Förvaring av Tomograms i databasen

Vi använder en webbaserad intern databas för att organisera, lagra, söka och distribuera tomografiska data. För varje lutning serie kan vi spela in prov detaljer, mikroskop parametrar insamling, rå lutning serier samt tillhörande 3D-rekonstruktion och andra filer bearbetning. De viktigaste besöker presenteras en miniatyrbild och en presenterade "YouTube" som film för varje tomogram, och uppgifterna kan organiseras av nedladdning frekvens, skapare, provtyp eller datum. Användare kan söka i databasen genom att ange sökord eller specialfunktioner. Närvarande mer än 4500 tomografiska luta serien har deponerats i databasen, som omfattar nästan 60 olika arter / prov, med totalt mer än 11.000 tillhörande filer.

IX. Analys och segmentering av Tomograms

1. Den strukturella detaljer i tomograms kan ses och analyseras genom olika program med verktyg för bildbehandling, t.ex. 3dmod betraktaren av imod med ZAP, XYZ och Slicer fönster.
2. Nästa steg är att skapa en segmentering av 3D-bilden (tomogram). En segmentering tilldelar varje Voxel (volymetrisk pixel) på 3D-bilden en etikett som beskriver till vilken region eller material Voxel hör, till exempel, ett membran eller en cytoskelettet. Vi använder programverktyg som 3dmod i imod och Amira (Visage Imaging).
3. Även om vissa programvaror ger automatisk segmentering moduler (t.ex., tröskel segmentering), de ofta bara fungerar för bilder med hög kontrast. 3D-bilder från lågdos elektron cryotomography ha så låg kontrast som i de flesta fall har vi att manuellt tilldela en etikett till varje Voxel.
4. Segmenteringen lagras i en separat datafil. Den kan användas för att generera en yta modell där varje region visas med en annan färg och visas i 3D.
5. Den tomograms kan användas för andra analyser. Till exempel kan mallen matchning och efterföljande beräkning ger statistisk information om makromolekylära komplex som ribosomer. Subvolume inriktning och i genomsnitt visar strukturer i högre kontrast och avslöjar finare detaljer.

X. Att göra filmer baserade på tomograms

Vi gör filmer för att sammanfatta varje projekt och för att ge en visuell visning av våra tomografiska bilder.

1. Gör ett manus av funktionerna i de data vi vill visa och hur man gör dessa funktioner. Till exempel i en typisk film av en hel-cell tomografi projektet börjar vi med att visa ett representativa uppgifter lutning serien och sedan följa med en bit-för-bit bild av den rekonstruerade tomogram. Därefter visar vi en segmentering av viktiga makromolekyler i cellen, till exempel en flagellar motor eller en chemoreceptor komplex eller en cytosoliska glödtråd. Till sist avslutar vi med en modell som visar en idealiserad tolkning av makromolekyler vi studerar.
2. Grafik representation program som Amira eller Chimera används för att göra enskilda stillbilder av filmen. Vi monterar typiskt filmer från kortare klipp för att underlätta förändringar i varje klipp.
3. Använd kommersiell film redigeringsprogram som Adobe Premiere för att sätta ihop stillbilder till filmklipp, och sedan filmklipp i den slutliga filmen.
4. Vi har börjat lägga till ett ljudspår som berättar filmen. Berättandet fungerar som en "film legend" och låter publiken att fokusera på de data som presenteras medan du tittar på film.

XI. Animation

Visualhistorieberättande kommunicerar kunskap utan att kräva den komplexa vokabulär av specifika vetenskapliga områden. Svåra begrepp blir enkla när de åtföljs av visuell demonstration. Bruket att illustrera biologiska idéer med karikatyrerna är inte ny. Men bara under det senaste decenniet har den sofistikerade verktyg för professionella 3D skapa innehåll kommit att bära på sig uppgiften att konstruera vetenskapliga animationer. Det finns nu ett tiotal forskare aktivt översätta biologiska system till dynamiska 3D-animationer. Många vackra animationer är utställningsmonter på http://MolecularMovies.org . Den platsen är också värd tutorials och distribuerar ett gratis verktyg för att manipulera molekylära strukturer i Autodesk Maya. Med öppen källkod 3D-material svit, Blender, innehåller flera användargenererat preliminära importörer.

Processen att göra en 3D-animation innebär i allmänhet tre steg:

1. Modeling: Vi använder grafik representation programvara för att exportera ytor i format som kan importeras till Maya. Dessa ytor är antingen segmenteringar från rekonstruerade tomograms t.ex. membran, granulat eller trådar, eller representationer av molekylära ytor. Tomogram segmenteringar utförs i Amira, molekylära ytor skapas i Chimera eller VMD. Atomic representationer av molekyler kan importeras direkt in i Maya från det preliminära budgetförslaget filer. När modellerna är inom Maya, kan de ändras, dupliceras och placeras på lämpligt sätt.
2. Animera: Animationer traditionellt byggda för hand, med konstnären manuellt flyttar rörliga objekt och spela in en rad centrala ramar. Nya framsteg i 3D-grafik programvara tillåter nu dynamik som skapas formellt via inbyggda moduler och skript API: er.
3. Rendering: Processuella dynamik kan ge övertygande animeringar av dynamiska biologiska processer, såsom strukturella självorganisering. Men på grund av svårigheten att realistiskt simulera biologiska system, är majoriteten av 3D-animationer fortfarande byggs med traditionell nyckelbildruta tekniker. När dynamiken är i ordning, kan visuella anteckningar, texturer och ljuseffekter läggas till. Slutligen är kameran väg valt och den färdiga animationen återges i en film.

Discussion

Vi visar i denna video artikeln hur man gör ECT av bakterieceller. Begränsad av tid och rum, visar vi bara det allmänna protokollet. Mer information finns i tidningar, på nätet eller annan information som tillhandahålls av tillverkarna av utrustningen och mjukvaruutvecklare, och från ECT forskargrupper. Beroende på de olika bakteriearter studerats, den utrustning som används och de strukturella intresset i cellerna, protokollet och den experimentella parametrar behöver testas och optimeras.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	0.1% solution
MKIII Vitrobot	FEI
Gold colloid solution	Sigma-Aldrich	G1527-25ml	10 nm
Bovine serum Albumin	Invitrogen	P2489	10%
Nr 1 Filter paper	Whatman, GE Healthcare	1001 055
Dextran	Sigma-Aldrich	31389	15-25%, MW 39000
Brass-domed planchet	Swiss Precision Company
Bal-Tec HPm 010 high pressure freezer	Leica Microsystems
Cryo-ultra microtome UC6/FC6	Leica Microsystems
Diamond cryo trim 45	Diatome
Static line II ioniser	Diatome
CX100 Dry shipper	Taylor-Wharton
MSH loading station	Gatan
Ti E/B inverted microscope	Nikon Instruments		Custom
Cryo LM stage	FEI		Custom
TF30-polara	FEI		With UltraCam from Gatan
Amira	Visage Imaging