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Biology

세균성 세포의 전자 Cryotomography

doi: 10.3791/1943 Published: May 6, 2010

Summary

가까운 원시 상태에서 세균 세포의 ultrastructure 연구를 전자 cryotomography (요법)를 사용하는 방법을 우리는 "macromolecular"(~ 4 NM) 해상도, 여기를 보여줍니다.

Abstract

많은 이미 세균 세포의 기본적인 신진 대사에 대한 알려져 있지만, 많은 근본적인 문제는 여전히 놀라울 정도로 그들이 생성하고 유지 특정 셀 모양, 극성을 설립, 자신의 genomes을 분리하고, 어떻게 분할 예를 들어 포함 답이 있습니다. 이러한 현상을 이해하기 위해 이미징 기술이 필요합니다 그 다리 형광 조명 현미경 및 X - 레이 crystallography와 NMR 분광법으로 높은 해상도의 방법 사이의 해상도 차이.

전자 cryotomography (요법)는 세포의 ultrastructure이 "macromolecular"해상도 (~ 4nm)의 세 차원 (3D)에 가까운 원시 상태에 시각 수 있도록, 이번 않는 새로운 기술입니다. 1, 2 년 요법, 세포는 낮은 온도에서 cryo 전송 전자 현미경 (cryoTEM)에 "냉동 수산화"상태, 유리체에서 몇 군데 아르 (<-180 ° C). 슬림 전지 (두께 3 최대 ~ 500 nm의)의 경우, 손상 세포 수 있습니다 플런지 - 냉동 등 에탄이나 에탄 / 프로판 혼합물로 cryogens에서 EM 격자를 통해 미디어 이내. 두꺼운 세포 biofilms도 처음엔 "고압 동결 '과하여 유리 상태로 몇 군데있을 수있다, 그들을"cryo는 - sectioning. " 그것이 점차적으로 하나 또는 두 개의 축을 따라 기울어져와 같이 2 차원 투영 이미지의 시리즈는 다음 예제를 통해 수집하고 있습니다. 3 차원 재건, 또는 "tomogram"는 다음 그림에서 계산하실 수 있습니다. 요법은 비싼 장비를 필요로하지만, 최근 몇 년 동안, 그것은 다양한 외부 부속의 구조를 밝힐 수있는 몇 가지 실험실에서 사용되고 있으며, 다른 세포 봉투, cytoskeletal 필라멘트의 위치와 구조, 그리고 위치 및 대형 macromolecular의 아키텍처의 구조 이러한 flagellar 모터, 내부 구획 및 chemoreceptor 배열로 조립. 1, 2

이 비디오를 문서에서 우리는 샘플 준비 프로세스, 데이터 수집, tomogram 재건 및 세분화를 통해 가벼운 현미경과 어떤 경우의 상관 관계에있는 결과의 해석을 포함한 요법과 이미지 세포 방법을 보여줍니다.

Protocol

세균성 세포 배양의 I. 준비

  1. 몇 ML 액체 문화에 원하는 단계로 그들의 정상적인 미디어에서 박테리아 세포를 성장. 높은 농도가 필요한 경우, 방적 신선한 미디어 다시 정지 채택 수 있지만이 프로세스가 때로는 세포의 구조적 변화를 도입하지 않을 수도 있습니다.
  2. 문화 오염 물질과 적절한 합류에서 무료로 있는지 확인하기 위해 가벼운 현미경으로 확인합니다.
  3. 일부 박테리아 세포는 막대 또는 EM 격자에 커질 수 있습니다. 격자, 탄소 코팅과 금색 격자에 성장 세포는 대부분 세포에 독성을 방지하기 위해 사용하는 경우. 그들은 15 분 동안 자외선 아래에서 소독 2 분 동안 배출 빛이되어야하고, 액체의 문화에 직접 배치해야합니다. 자기편 세포가 자연스럽게 그리드에 집중되며, 다른 사람이 코팅에 의해 격자 최초로 폴리 - L - 라이신 0.1 %에 격자를 준수하라는 메시지가 수 있습니다. 세포의 농도가 냉동하기 전에 적절한지 먼저 빛의 현미경에 그리드를 확인합니다.

II. 플런지 냉동 얇은 세포

얇은 박테리아 세포, 손상 세포의 정지는 EM 격자에 걸쳐 냉동 빠지게됩니다. 과정은 박테리아 세포의 울트라 구조를 보존하고 나중에 EM의 높은 진공 상태에서 물의 증발을 방지할 수 있습니다. 이것은 사용자 정의 - 만든 플런지 냉동 장치 중 완료, 또는 우리가 상용 자동 플런지 냉장고와 함께 여기로 표시, 황비홍 Vitrobot MKIII 4. 수 있습니다

  1. 2 글로우 방전은 탄소 코팅 EM 그리드 - 4 분. 이것은 따라서 균일 전체 그리드를 통해 샘플을 확산하는 데 도움이 친수성 ​​그리드의 표면을합니다.
  2. 5 % BSA 집중 솔루션의 25μl와 100μl 콜로이드 골드 솔루션 (10 NM의 입자 직경)을 섞는다. BSA 코팅은 금 입자 그리고 이것은 그들의 집계를 방지합니다.
  3. 15 분 18,000그램에서 BSA와 금 입자 혼합물을 원심 분리기. 뜨는을 제거한 후, 남아있는 황금 펠릿 20 μl 세포 솔루션을 혼합합니다. BSA 취급 금 입자는 세포와 반응하지 않지만, 그들은 tomograms의 재건을위한 fiducial 마커 필요한 것입니다.
  4. 100 % 습도에서 Vitrobot에서 EM의 격자를 배출 형광으로 세포와 골드 솔루션 혼합 4 μl을 적용합니다. 그리드는 자동으로 넘버 1 필터 종이로 양쪽에서 blotted 있습니다. 이것은 자신의 미디어에있는 세포의 단지 박막이 남아 있도록 여분의 액체를 제거합니다. 그리드는 다음 에탄 및 액체 질소로 약 77K로 냉각 프로판의 액체 혼합물로 급속도로 뛰어들 수 있습니다. 이 과정에서, 샘플은 얼음 결정의 형성이 박막 <1 μm의에 방지되도록 빠르게 냉동 수 있습니다.
  5. 조심스럽게 에탄 / 프로판 혼합물에서 격자를 제거하고 신속하게 액체 질소하에 보관하는 그리드 스토리지 상자에 전송할 수 있습니다.

III. 두껍게 셀의 Sectioning 고압 냉동 및 Cryo

두꺼운 전지, 고압 냉동 얼음 결정을 감소 이후 cryo의 sectioning은 EM 이미징 충분히 얇은 샘플. 5, 6, 고압 냉동에 사용할 여러 가지 표본 소지자가 있습니다 7 렌더링, 당신의 선택, 샘플의 유형을 따라 달라집니다 냉동 기계 사용하거나 수사 응용 프로그램이 선택되었습니다. 여기 발 - 테크 HPM 010 고압 냉동기 및 Leica Microsystems에서 cryo 울트라 마이크로톰 모델 UC6/FC6을 사용합니다.

  1. 박테리아, 15mls 스피너 문화 OD> 0.5은 37 ° C 배양기에서 직접 촬영하고 3 분 1000rpm에서 centrifuged. 다음 20% dextran의 cryoprotectant의 0.5ml로 남아있는 문화 펠렛의 표면에 뜨는, 믹스 0.5ml를 제거하고 나면 15 초 동안 13000rpm에서 원심 분리기.
  2. 뜨는 제거 후, ​​슈퍼 펠렛의 피펫 0.1ml 이미 0.2ml 20% dextran cryoprotecant (40000Mwt)이 포함되어 열 봉인 micropipette 팁에 붙여 넣습니다. 30 초 동안 13,000 rpm으로 micropipette 팁의 혼합물을 원심 분리기 및 뜨는 제거합니다. 50-10 μl 꽉 펠렛은 봉인 끝에 볼 수 있습니다.
  3. "테플론"코팅 황동 - 돔형 고압 냉동기 홀더 팔 플랜쳇 준비 장착 한 하프 돔에서 붙여넣기를 받고 그 평면 파트너 황동 모자와 함께 밀봉합니다.
  4. 팔 조립 그러면 즉시 동결 준비 준비하는 고압 냉동고에 삽입됩니다.
  5. 2100 바 압력에서 세포를 포함하는 결합 놋쇠 플랜쳇 단위가 빠르게 고압 액체 질소의 분사에 의해 냉각, 즉시 팔 어셈블리를 제거하고 액체 질소의 욕조에 뛰어드는 것은 온난 화에서 플랜쳇을 방지합니다.
  6. cryo - sectioning에 필요한까지 플랜쳇 단위는 액체 질소 아래에 저장됩니다.
  7. sectioning에 대한 세포의 잘 냉동 돔을 노출하려면 두 놋쇠 planchets 신중 unde를 구분됩니다R 액체 질소.
  8. 세포의 완벽 냉동 돔, 외관의 유리 균열 및 얼음 핵의 균열 무료입니다.
  9. 이 플랜쳇은 precooled -170 ° C 챔버로 전송하고 cryo - 마이크로톰 부회장처럼 척에 안전하게 장착됩니다.
  10. 냉각 cryomicrotome은 sectioning에 필요한 필수 cryotools를 포함, 이들은 다음과 같습니다 낮은 각도 cryo - 다이아몬드 나이프, 다이아몬드 트리밍 도구를 누르십시오 플랫폼, 그리드 스토리지 박스, 정전기 방지 스프레이 장치와 그리드 유지 장치.
  11. 물론 냉동 둘레의 ~ 200μm 깊이를 유지하면서 외부 돔 지역 sectioning 성공 리본 처음 다이아몬드 트리밍 도구 및 빠른 sectioning 속도 <0.2mm 정사각형 모양이다. 들면
  12. 낮은 각도 나이프와 근접 구리 지원 격자에서 감독 정전기 방지 스프레이로, 다이아몬드 나이프는 광택 블록 얼​​굴 sectioning에 대한 readied에 신중 고급입니다.
  13. 마이크로톰 매개 변수가 함께 ~ 0.4mm/sec 좁고 절단 윈도우의 절삭 속도와 같은 50-350 nm의 사이 섹션 두께 설정으로 선택됩니다. 가까운 지역에서 낮은 습도 조건에 정전기 방지 스프레이 범위와 강도를 조절하는 것이 중요합니다.
  14. 첫 번째 섹션이 생산으로 고급 속눈썹의 작은 주걱은 낮은 각도 다이아몬드 칼날을 미끄러져 초기 섹션을 낚아채 손이나 micromanipulator에 의해 였는데 있습니다.
  15. 섹션의 리본이 칼을를 강제하는 동안 그들은 부드럽게 속눈썹 프로브가 지원하는 주변 구리 그리드 지원에 걸쳐 안내하고 있습니다.
  16. 섹션을 넣으려면, 리본과 함께 로드된 격자가 다음 단단히 냉각 광택 - 실버 프로브를 사용하여 누르면, 일부 섹션 너무 높은 최신 정전기 방지 장치가 부착 과정에서 도움을 드릴 수가 부과됩니다.
  17. 현미경은 그리드 전송 준비가 될 때까지 그리드 상자가 건조 발송을 냉각 액화 질소에 장기 보관을 위해 보관됩니다.

IV. Cryo 라이트 현미경을 사용하여 세포를 검사

그리드에있는 박테리아 세포는 cryo 조명 현미경 (cryoLM)를 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 우리가 사용하는 현미경 사용자 정의 니콘 거꾸로 현미경 여분 긴 작업 거리 (ELWD) 60x 공기 목적 렌즈와 티 E / B. 격자는 빛의 현미경에 대한 수정된 페이 cryo의 무대입니다 이미징 동안 cryo 단계에 보관됩니다. 찾기 격자를 사용하여 전지는 그리드 사각형에 위치한 수 있으며 cryoLM 이미지는 cryoEM의 tomograms로 상호 수 있습니다.

  1. cryo - 스테이션에서 카트리지에 그리드를로드합니다. 카트리지 페이 TF30H - 폴라라위한 표준 EM 카트리지에서 수정된 정의됩니다. 그리드는 구리 클립 링을 아래 개최됩니다. 카트리지는 다음 전송 액체 질소의 튜브에 저장됩니다.
  2. 액체 질소 온도 (-190 ° C)에 cryo 단계를 쿨.
  3. cryo 단계에 카트리지를로드하고 보는 창에 격자를 이동합니다. 무대는 두 사용자 정의 수정 카트리지까지 저장할 수 있습니다.
  4. 콘덴서 렌즈를 낮추고 그리드에 60x 목적 렌즈 초점.
  5. 세포를 찾아 이미지를 가져가라. 상관 LM 및 EM 연구 들어, 그리드는 나중 EM에있는 세포를 찾는, 세포의 주위 스캔입니다.
  6. 이미징 후 그리드는 튜브에 다시 카트리지를 넣고 EM에 몇 군데 준비 때까지 액체 질소에 튜브를 유지.

V.은 Cryo TEM에서 틸트 시리즈를 수집

샘플이 점차적으로 cryo TEM에 하나 또는 두 개의 축을 따라 기울어져있는 동안 세균 세포의 3D tomogram을 얻으려면 프로젝션 이미지 일련의가 촬영됩니다. 틸트 각도 및 기타 실험 설정을 감안할 때, 자동으로 기울기 시리즈를 수집하기 위해 가능한 여러 가지 소프트웨어가 있습니다. 우리는 페이 TF30H - 폴라라는 우리 cryo의 TEM에 대한 Leginon를 사용합니다. 그것은 자동으로 preselected 세포의 기울기 시리즈셔서 수 있습니다. 8

  1. precooled cryo 스테이션에서 다중 선택 자 (MSH)에 카트리지를로드합니다. MSH는 6 카트리지까지 저장할 수 있습니다.
  2. TF30H - 폴라라에 MSH를 연결 한 카트리지를 선택하고 EM 칼럼에를 삽입합니다.
  3. EM 컴퓨터와 다른 워크 스테이션에 Leginon 주요 프로그램 Leginon 클라이언트를 시작합니다.
  4. Leginon 세션에 대해 미리 설정을 (이미지 상태) 설정합니다. 중요한 매개 변수는 배율, 아래 초점 값, 전자 복용하고 시작 각도, 끝 각도와 증가를 포함하여 기울기 시리즈에 대한 기울기 각도입니다.
  5. 가장 낮은 배율부터 영상에 목표를 선택하고 높은 배율과 함께 다음 단계로 보내주시기 바랍니다.
  6. 틸트 시리즈 컬렉션의 모든 대상 최대 대기열 및 최종 "tomography"단계로 전부를 제출합니다.
  7. 데이터 수집 프로세스는 로컬 워크 스테이션에서 웹 도구를 통해 모니터링할 수 있습니다.
  8. 실험 데이터 수집은 다운 완료되면재건을위한 로컬 워크 스테이션에 완성된 기울기 시리즈를로드합니다.

VI. Biosafety 고려 사항

우리가 작업하는 생물 학적 샘플의 대부분은 비 병원성하며 토양, 수돗물이나 곤충의 내장에서 고립되었습니다. 기본 무균 기술이 샘플을 처리하기위한 충분합니다. 병원균 작업하는 것은 극단적인 위험에 대한 일부 연구소는 BSL - 3 실험실 내에서 전체 cryo - EM 현미경을 설치, 추가 안전 단계의 구현이 필요합니다. 다음은 우리가 우리가 실험실에서 병원균 작업의 위험을 감소 가지고있는 몇 가지 방법입니다.

  1. 샘플의 pathogenicity도 화학적으로 또는 유전적으로 감쇠 수 있습니다. 바이러스 cryo - EM을하고 많은 실험실 잠수 - 냉동하기 전에 화학 fixatives 그들을 inactivated 있습니다. 대안으로, 주요 돌연변이가 특정 효소의 포인트 변이의 운영을 중지시키지 또는 수용체를 두드리는 인스턴스에 대한 포함하는 샘플 비 infective을 렌더링이 도입하실 수 있습니다.
  2. 이러한 장갑, 실험 복과 고글 등 개인 보호 장구를 착용한다.
  3. 유해 샘플은 biosafety 캐비닛 (BSC)에서 처리할 수 있습니다. 세균성 문화는 성장 집중, 심지어 EM에 BSC에 그리드를 다이빙은 - 냉동 수 있습니다. 우리는이 목적을 위해 우리의 BSC에 맞는 작고 수동 다이빙 - 냉동 장치를합니다. 자동 플런지 - 냉동고에 의해 제공되는 더 큰 일관성이 필요한 경우, 그들 중 BSC에 도입이 될 수도 있고, 더 간단하게, 어떤 경우에는 우리는 장치의 오염을 방지하기 위해 알루미늄 호일과 함께 Vitrobot의 모래 바닥 패드를 지원합니다. BSC와 함께 작업할 경우, 가능한 도구와 자료의 많은 각료로가는 건지는 70 % 에탄올로 소독해야합니다. 우리 격자를 준비할 때, 우리는 왓먼 종이로 blotted 도착 대부분의 세균성 또는 바이러스성 문화의 작은 볼륨 (보통 4 UL) 사용합니다. 압지, 피펫 팁, 그리고 남아있는 문화 biohazardous 폐기물로 폐기됩니다. 모든 도구 및 노출된 표면은 희석 표백, 95 % 에탄올 후 물로 소독하고 있습니다.
  4. 격자가 얼어되면, 그들은 스토리지 및 데이터 수집을 통해 액체 질소 온도에서 보관됩니다. 그것은 세포 해동 후 동결 살아남을 수 있다고 보여 왔으며,에도 불구하고, 우리는 스토리지 및 데이터 수집을 통해 유해로 치료를 계속합니다. 데이터 수집의 끝에서, 냉동 격자를 포함하는 카트리지는 cryo - TEM에서 제거되고 70 % 알콜에 직접 떨어졌다. 희귀 있지만, 그것은 때로는 격자는 열 안에 "감소"는 것을 지적해야하고, 이러한 이벤트의 결과는 각 위험에 대해 숙고 샘플되어야합니다. 현미경의 대부분은 상온에서입니다 떨어졌다 그리드에 대한 예제는 가능성 열 내부 해동 완전히 EM의 초고 진공에서 desiccated 될 수 있도록. 이건 분명히 몇 가지 생물 학적 샘플을 inactivate 싶지만, 아마도 아니 강력한 바이러스 및 샘플의 desiccated 잔존물은 잠재적 현미경 칼럼은 다음 서비스에 대한 열 에어로졸로 발표 수 있습니다.

VII. Tomogram 재건

세균성 세포의 tomograms는 소프트웨어를 통해 복원하고 있습니다. 이 일을 사용할 수 몇 가지 소프트웨어가 있습니다. 우리는 자동 재건 및 심사 tomograms에 대한 랩터를 사용합니다. 자동 틸트 시리즈 정렬 및 그 이후의 재건이 아닌 하찮은 작업이므로 9, 랩터는 현재 100 % 성공률을 가지고 있지 않습니다. 랩터의 고장이나 고품질의 재건을 위해 필요한 경우, 우리는 수동 이미지 정렬 및 IMOD의 tomography 소프트웨어 스위트의 eTomo와 함께 재건을 사용합니다. 10, 11

  1. 지역 Leginon 웹 서버에서 각각의 기울기 시리즈를 다운로드합니다. 그들이 쉽게 찾을 수있는 디렉토리에 저장합니다.
  2. 수동 IMOD의 3dmod 뷰어를 사용하여 기울기 시리즈를 검사하고 Leginon가 목표물을 추적하거나 유용한 틸트 시리즈를 제작 실패하면들을 폐기.
  3. 우리는 랩터는 복숭아 (네트워크를 통해 작업을 배포하는 펄 기반 시스템)을 통해 실험실에서 리눅스 시스템을 통해 분산 실행합니다. 우리는 fiducial 마커의 크기를 지정, 콜로이드 골드 입자 즉, 재건에 사용되는 마커의 픽셀 크기, 재건의 원하는 두께, 비닝 요소와 같은 입력으로 기본 설정을 숫자 (의 수, 출력 경로 및 출력 커맨드 라인에서 형식)와 그것이 122 - 이미지 세트 (2K에서 2K)을 2 시간으로 일반적으로 20 분, 실행 둡니다. 재건의 결과에 만족하는 경우,이 섹션에있는 다음 단계는 생략 수 있습니다.
  4. 수동 재건이 필요한 경우, ". MRC"에서 파일을 ". 세인트"로 이름을 바꾼 후 IMOD의 tomography 제품군에 eTomo GUI로 각각의 기울기 시리즈를로드합니다.
  5. 틸트 시리즈 축 종류 (단일 또는 이중 축)을 지정하고, SA에서 사용 fiducial 크기를 입력mple 준비. 픽셀 크기를 결정하고, "COM 스크립트 만들기"를 클릭하여 진행하는 파일 헤더를 검사합니다.
  6. 틸트 시리즈에서 tomogram을 재구성하는 eTomo GUI의 각 탭의 단계를 수행하십시오. 검사하고 각 단계 후 결과를 확인하고, 만족하지 않을 경우, 우리는 항상 거기에서 모든 이전 단계와 재처리로 돌아갈 수 있습니다. "사전 처리는"예비 처리를 수행하고 X - 레이로 인한 높은 강도 픽셀 비정상적으로 제거하는 것입니다. "거친 정렬"는 기울기 시리즈의 각 후속 프로젝션 이미지가 교차 상관에 의해 이전에 정렬됩니다 궁극적 틸트 시리즈를 생산하고 있습니다. 우리는 "Fiducial 모델 세대"에 fiducials으로 사용할 골드 비즈 어떤을 정의하고,이 프로그램은 각각의 투영 이미지의 fiducial 마커를 추적하고 "파인 정렬"을 작성합니다. "Tomogram의 위치가"Z.에서 tomogram을 자르기 수있는 "최종 연합 스택"은 선형 보간과 같은 CTF - 보정, 골드 - 지우개와 차원 필터링을 선택 적용할 수로 함수를 사용하여 생성됩니다. tomogram는 푸리에 공간에서 가중 다시 프로젝션에 의해 "Tomogram 만들기"에 계산됩니다. "포스트 - 프로세싱은"관심과 스케일링 관심의 구조의 범위에있는 대조의 XY - 영역에 tomogram의 자르기 수 있으며 삭제 중간 파일을 "정리"와 디스크 공간을 공간을 만듭니다.

VIII. 데이터베이스에있는 Tomograms의 스토리지

우리는 웹 기반의 사내 구성 데이터베이스 저장, 검색, 및 단층 데이터를 배포를 사용합니다. 각 틸트 시리즈, 우리는 샘플 세부 정보, 현미경 수집 매개 변수, 원시 기울기 시리즈뿐만 아니라 연관된 3 차원 재건 및 기타 처리 파일을 녹음할 수 있습니다. 기본 탐색 페이지는 축소판 이미지를 제공하고 각 tomogram에 대한 영화와 같은 기능을 갖춘 '유튜브'와 항목은 다운로드 주파수, 작가, 견본 입력하거나 날짜별로 정리하실 수 있습니다. 사용자는 키워드 또는 특수 기능을 입력하여 데이터베이스를 검색할 수 있습니다. 현재 4,500 개 이상의 단층 틸트 시리즈는 11,000 개 이상의 연결된 파일의 총, 종 / 시료의 약 60 종류를 다루는 데이터베이스에 입금되었습니다.

IX. Tomograms의 분석 및 세그먼트

  1. tomograms의 구조적 세부 사항 조회 및 이미지 처리 도구, 써, XYZ 및 슬라 이서 윈도우와 IMOD의 예 3dmod 시청자와 함께 다양한 소프트웨어를 통해 분석할 수 있습니다.
  2. 다음 단계는 3D 이미지 (tomogram)의 세분화를 만드는 것입니다. 세분화는 3D 이미지의 각 voxel (체적 픽셀)로 할당하는 지역 또는 자료 voxel은 예를 들어, 멤브레인 또는 cytoskeleton, 속해 설명 레이블을 붙입니다. 우리는 이러한 IMOD 및 Amira (비세 영상)에 3dmod와 같은 소프트웨어 도구를 사용합니다.
  3. 일부 소프트웨어 도구가 자동 세그먼트 모듈 (예를 들어, 임계값 세분화)를 제공하지만, 그들은 주로 높은 콘트라스트의 이미지를 위해 작동합니다. 낮은 선량 전자 cryotomography에서 파생된 3D 이미지는 대부분의 경우 우리가 수동으로 각 voxel에 라벨을 할당하는 것으로 같은 낮은 대비를했습니다.
  4. 세분화는 별도의 데이터 파일에 저장됩니다. 그것은 각 지역이 다른 색깔로 표시하고 3D로 볼있는 표면 모델을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
  5. tomograms 다른 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 템플릿 매칭 및 후속 계산 리보솜 같은 macromolecular 복합 통계 정보를 얻을 수 있습니다. Subvolume 정렬 및 평균 높은 반면 구조를 보여줍 미세한 세부 정보를 보여줍니다.

X.은 tomograms에 따라 영화를 만들기

우리는 각각의 프로젝트를 정리하고 우리의 단층 이미지의 영상 투어를주는 영화를합니다.

  1. 우리가 이러한 기능을 렌더링하는 방법을 보여하고 싶은 데이터 기능의 스크립트를 확인합니다. 예를 들어, 전체 셀 tomography 프로젝트의 전형적인 영화에서, 우리는 재건 tomogram 한 조각별로 슬라이스 전망에 따라 다음 대표 틸트 시리즈 데이터를 표시하고하여 시작합니다. 다음, 우리는 예를 들면 세포의 주요 macromolecules의 세분화, flagellar 모터 또는 chemoreceptor 복합 또는 cytosolic 필라멘트을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 공부하는 macromolecules의 이상적인 해석을 보여주는 모델과 결론을 내린다.
  2. 이러한 Amira 또는 치메라 같은 그래픽 표현 소프트웨어는 동영상의 각 프레임을 렌더링 계속하는 데 사용됩니다. 우리는 일반적으로 각 클립에 변화를 촉진하기 위하여 짧은 클립에서 영화를 조립.
  3. 최종 동영상에 동영상으로 여전히 프레임, 다음 동영상 클립을 조립하기 위해 어도비 프리미어와 같은 상업 영화 편집 소프트웨어를 사용합니다.
  4. 우리는 영화를 narrates 오디오 트랙을 추가하기 시작했습니다. 나레이션은 "영화 전설 '역할을하고 관객이 영화를 보면서 데이터가 제시되는에 집중할 수 있습니다.

XI. 애니메이션

시각이야기는 구체적인 과학적 도메인의 복잡한 어휘를하지 않고도 지식을 전달합니다. 영상 시연과 함께하면 어려운 개념은 간단된다. 만화로 생물 학적 아이디어를 설명의 관행은 새로운되지 않습니다. 그러나, 지난 10 년간 전문적인 3D 컨텐츠 생성 과학적 애니메이션을 구축하는 작업에 대한 부담에 회부되었습니다의 정교한 도구를했습니다. 적극적으로 역동적인 3D 애니메이션으로 생물 학적 시스템을 번역 연구자 수십 지금있다. 많은 아름다운 애니메이션에 전시 아르 http://MolecularMovies.org . 해당 사이트는 자습서를 호스트와 오토 데스크 마야의 분자 구조를 조작 무료 툴킷을 배포하고 있습니다. 오픈 소스 3D 컨텐츠 제품군, 블렌더는 여러 사용자가 생성 PDB 수입업자가 포함되어 있습니다.

3D 애니메이션을 제작하는 과정은 일반적으로 세 단계를 포함 :

  1. 모델링 : 우리는 마야로 가져올 수 형식으로 표면을 수출하기 위해 그래픽 표현 소프트웨어를 사용합니다. 이러한 표면 재건 tomograms에서 segmentations도 있으며, 예를 들면, 세포막, 과립, 또는 필라멘트, 또는 분자 표면의 표현. Tomogram의 segmentations는 Amira로 진행되며 분자 표면은 치메라 또는 VMD에 생성됩니다. 분자의 원자 표현은 PDB 파일에서 마야에 직접 가져올 수 있습니다. 모델 마야 이내되면, 그들은 수정 중복, 그리고 적절한 위치에있을 수 있습니다.
  2. 애니메이션 : 애니메이션은 전통적으로 작가가 수동으로 움직이는 물체를 재배치 주요 프레임의 일련의 기록과, 손으로 만들어진 있습니다. 3D 그래픽 소프트웨어의 새로운 발전은 이제 모듈과 스크립팅 API를 내장 통해 역학이 절차 생성하실 수 있습니다.
  3. 렌더링 : 절차 역학 이러한 자기 조립 구조로 역동적인 생물 학적 과정의 설득력있는 애니메이션을 제공할 수 있습니다. 그러나 현실 생물 학적 시스템을 시뮬레이션의 어려움으로 인해, 3D 애니메이션의 대부분은 여전히​​ 전통적인 핵심 프레임 기술을 사용하여 구축됩니다. 역학 순서대로되면 시각 주석, 텍스처 및 조명 효과를 추가할 수 있습니다. 마지막으로, 카메라 경로가 선택되고 완성된 애니메이션 영​​화로 렌더링됩니다.

Discussion

우리는 박테리아 세포 요법을 수행하는 방법이 비디오를 문서에 표시됩니다. 공간과 시간에 의해 제한, 우리는 일반적인 프로토콜을 보여줍니다. 자세한 내용은 논문, 장비 및 소프트웨어 개발자의 제조에 의해 제공된 온라인 또는 기타 정보, 그리고 요법 연구 그룹에서 찾을 수 있습니다. 공부 다른 세균 종에 따라 사용하는 장비와 세포의 구조 관심, 프로토콜 및 실험 매개 변수를 테스트하고 최적화해야합니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 GJJ에 보건 보조금 R01 AI067548, R01 GM081520, R01 GM086200, R01 AI049194 및 P01 GM066521 국립 연구소뿐만 아니라 하워드 휴즈 의학 연구소, Caltech에서 베크맨 연구소와에서 Caltech에 선물로 일부 지원이 고든 무어와 베티 재단과 Agouron 연구소. MSL은 파멜라 S. Björkman에 NIH 부여 2R37 - A1041239 - 06A1에 의해 지원됩니다. Leica 마이크로 시스템즈 주식 회사 친절 cryosection 컬렉션의 비디오 콘텐츠를 제공했습니다. Treponema primitia의 대표적인 결과가 수집 및 처리 가빈 E. 머피에 의해, 그리고 제목이 "Treponema primitia 및 운동성 위해 의미의 소설 ultrastructures"와 분자 미생물에 게시되었습니다. (머피, G. 외., 몰. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P8920 0.1% solution
MKIII Vitrobot FEI
Gold colloid solution Sigma-Aldrich G1527-25ml 10 nm
Bovine serum Albumin Invitrogen P2489 10%
Nr 1 Filter paper Whatman, GE Healthcare 1001 055
Dextran Sigma-Aldrich 31389 15-25%, MW 39000
Brass-domed planchet Swiss Precision Company
Bal-Tec HPm 010 high pressure freezer Leica Microsystems
Cryo-ultra microtome UC6/FC6 Leica Microsystems
Diamond cryo trim 45 Diatome
Static line II ioniser Diatome
CX100 Dry shipper Taylor-Wharton
MSH loading station Gatan
Ti E/B inverted microscope Nikon Instruments Custom
Cryo LM stage FEI Custom
TF30-polara FEI With UltraCam from Gatan
Amira Visage Imaging

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References

  1. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  2. Li, Z., Jensen, G. J. Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure. Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).
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세균성 세포의 전자 Cryotomography
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Chen, S., McDowall, A., Dobro, M. J., Briegel, A., Ladinsky, M., Shi, J., Tocheva, E. I., Beeby, M., Pilhofer, M., Ding, H. J., Li, Z., Gan, L., Morris, D. M., Jensen, G. J. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943, doi:10.3791/1943 (2010).More

Chen, S., McDowall, A., Dobro, M. J., Briegel, A., Ladinsky, M., Shi, J., Tocheva, E. I., Beeby, M., Pilhofer, M., Ding, H. J., Li, Z., Gan, L., Morris, D. M., Jensen, G. J. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943, doi:10.3791/1943 (2010).

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