Summary
Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione di tradurre ribosomi delle cellule eucariotiche. Una volta estratto, i ribosomi sono separati in monosomes e poliribosomi per frazionamento gradiente di saccarosio per consentire diverse popolazioni ribosomiale da analizzare. Come tale, questo metodo è il gold standard per l'esame della regolamentazione della traduzione.
Abstract
Sintesi proteica è un processo complesso cellulare che è regolata a diversi livelli. Per esempio, la traduzione globale può essere inibito in fase di inizio o la fase di allungamento da una varietà di stress cellulare come fame di aminoacidi o fattore di crescita ritiro. In alternativa, la traduzione di mRNA individuo può essere regolato dalla localizzazione mRNA o la presenza di microRNA affini. Studi di sintesi proteica frequentemente utilizzano analisi polyribosome a far luce sui meccanismi di regolazione traduzione o difetti di sintesi proteica. In questo saggio, mRNA / ribosoma complessi sono isolate da cellule eucariotiche. Un gradiente di densità di saccarosio separa mRNA legata ai ribosomi più conosciuto come poliribosomi da mRNA associato a un ribosoma singola o monosome. Frazionamento dei gradienti consente l'isolamento e la quantificazione delle diverse popolazioni ribosomiale e il loro mRNA associati o proteine. Le differenze nel rapporto tra poliribosomi monosomes a determinate condizioni può essere indicativo di difetti in entrambe le iniziazione traduzione o allungamento / terminazione. L'esame dei mRNA presenti nelle frazioni polyribosome può rivelare se la coorte di mRNA individuale in corso di traduzione cambia con le condizioni sperimentali. Inoltre, il montaggio ribosoma può essere monitorato attraverso l'analisi dei picchi piccoli e grandi subunità ribosomiale che sono anche separati dal gradiente. In questo video, vi presentiamo un metodo per la preparazione di estratti grezzi di ribosomiale da cellule di lievito, la separazione dell'estratto dal gradiente di saccarosio e l'interpretazione dei risultati. Questa procedura è facilmente adattabile alle cellule di mammifero.
Protocol
1. Preparazione di gradienti di saccarosio 7-47%
- Preparare gradienti di saccarosio un giorno prima per permettere l'uso gradienti di diventare continua. Rendere sterile il 7% e soluzioni di saccarosio al 47% contenente 50 mM NH 4 Cl, 50 mM Tris-acetato pH 7,0 e 12mm MgCl 2 e conservare a 4 ° C 1.
- Per 6 gradienti di mescolare il 7% e il 47% soluzioni madri di saccarosio per fare 48 ml di ciascuna delle seguenti concentrazioni di saccarosio. Aggiungi DTT (1M magazzino) per ogni soluzione di saccarosio a una concentrazione finale di 1 mm.
Concentrazione finale 7% di saccarosio 47% di saccarosio 7% 48 ml 0 17% 36 ml 12 ml 27% 24 ml 24 ml 37% 12 ml 36 ml 47% 0 48 ml - Al fine di versare i gradienti, allegare una pipetta Pasteur di una siringa da 20 ml di fissaggio e di tenuta con Parafilm o utilizzare un lungo ago. Aggiungere 7 ml di saccarosio 7% al fondo di una x 1 "tubo 3,5 polyallomer ultracentrifuga. Successiva aggiungere 7 ml di soluzione di saccarosio 17% sotto la soluzione al 7% mettendo la punta della pipetta Pasteur vicino fondo della provetta e pipettaggio non più veloce di 0,3 mL / sec. Ripetete con 7 ml ciascuna del 27%, 37% e soluzioni di saccarosio al 47%. Si dovrebbe osservare chiare linee tra gli strati, ad indicare che la miscelazione minimo si è verificato. gradienti Conservare a 4 ° C per una notte insieme con i rotori, le bottiglie e tubi che verranno utilizzati per raccogliere campioni.
2. Preparazione dell'estratto di lievito
- Grow 125 mL di coltura di lievito ad un OD 600 di 0,8-1,0. Aggiungi cicloeximide alla cultura ad una concentrazione finale di 100 mg / ml e continuare agitazione a 30 ° C per 15 min.
- Nel frattempo, preparare buffer di lisi contenente 80 mg / ml cicloeximide, 200 mg / mL di eparina, 0,2% DEPC, e 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 30mm MgCl 2. Tenere tutto in ghiaccio da questo punto in poi.
- Versare la cultura in una bottiglia da 250 ml centrifuga e riempire con ghiaccio. Centrifugare a 8000 xg (7.250 giri in un SLA-1500 rotore) per 5 minuti a 4 ° C. Lavare il pellet una volta con 10 ml di tampone di lisi ghiaccio freddo e trasferimento in tubi 15 ml in polipropilene. Centrifugare a 5900 g (circa 6.000 giri in un SLA-600TC rotore) per 3 minuti a 4 ° C. Risospendere il pellet in 0,5 ml di tampone di lisi, trasferimento a tubo di 1,5 ml e aggiungere 0,5 ml di acqua refrigerata, al forno lavata con acido perle di vetro. Vortex le cellule per quattro intervalli di 30 secondi, il raffreddamento della provetta in ghiaccio per 30 secondi tra ogni intervallo. Aggiungere un altro 0,5 mL di tampone di lisi nel tubo 1,5 ml. Centrifugare alla massima velocità in una microcentrifuga (14.000 giri al minuto in una microcentrifuga Eppendorf 5417R) per 10 minuti a 4 ° C. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di 1,5 ml microcentrifuga. Rimuovere 10 microlitri di un tubo separato per determinare la 260 / 280 OD OD rapporto (vedi punto 3.1). Estratti di conservare a -80 ° C.
3. Preparazione di estratti da cellule di mammifero
- Per le cellule aderenti, cresca in 100 piatto mm a confluenza ~ 70%. Avrete bisogno di un piatto di 100 mm per 11 ml di gradiente (rendimento tipico è ~ 20 OD 260 unità). Scalare la quantità linearmente per dimensioni gradiente più o meno grandi. Per i non aderenti cellule, circa 1 x 10 7 cellule sono necessari per 11 ml di gradiente.
- Prima di lisi, aggiungere cicloeximide a 100 mg / ml. Incubare a 37 ° C per 15 min. Trasferire le piastre di ghiaccio e lavare le cellule due volte in PBS freddo ghiaccio. Tutte le fasi futuro deve essere effettuata a 0-4 ° C.
- Rimuovere tutte le tracce di PBS per aspirazione (per non piastre di drenaggio su un letto inclinato di ghiaccio) e aggiungere 1 mL di tampone di lisi, raschiare e trasferimento in pre-raffreddata tubo 1,5 ml. Componenti del tampone di lisi dovranno essere ottimizzati per il tipo di cellula e condizioni di crescita. Un buffer di partenza sarà di 20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 15 mM MgCl 2, 200 mM KCl, 1% Triton X-100 (v / v), 100 mg / ml cicloeximide, 2 mM DTT, e 1 mg / mL di eparina. Le variabili chiave sono le concentrazioni di magnesio e cloruro di potassio, nonché l'inclusione o l'esclusione di detergenti non ionici per migliorare l'estrazione di polisomi legati citoscheletro o membrana. Lisare cellule, passando attraverso 27 gauge siringa o due volte da colpi 5-10 di omogeneizzazione dounce utilizzando tipo B pestello. La siringa o omogeneizzatore devono essere pre-raffreddata prima dell'uso.
- Spin a 14000 g per 5 min in microcentrifuga refrigerata. Trasferimento lisato fresco al gradiente di saccarosio (per cellule di mammifero è costituita in tampone di lisi privo Triton X-100 ed eparina ma per il resto come descritto nei punti 1.2 e 1.3) o congelare flash in azoto liquido per un uso successivo. 4. Centrifugazione di gradienti
- Disgelo lisati polyribosome sul ghiaccio. Determinare la concentrazione di acido nucleico del lisato aggiungendo la riservato un campione di 10 microlitri di 1 ml di acqua e leggere il 260 / 280 OD OD rapporto con uno spettrofotometro. Rendimento tipico di una cultura lievito cresciuto come descritto è di 50 unità OD.
- Utilizzando una pipetta con la punta appoggiata alla parete del tubo vicino alla superficie del gradiente, delicatamente layer da 25 OD 260 unità del lisato in cima al gradiente. Per un gradiente di 35 ml 500 microlitri di lisato è tipicamente caricato. Tampone di lisi può essere usato per assicurare a tutti le sfumature vengono caricati con un uguale volume. Minori quantità di materiale resa migliore risoluzione. Prendere con cautela abbassare le pendenze in secchi di un rotore oscillante.
- Centrifugare i gradienti a 100.000 xg (23.000 rpm in un rotore 630 Surespin) per 4 ore a 4 ° C. Questo protocollo può essere adattato per le sfumature volume più piccolo.
- Circa 30 minuti prima del completamento dello spin 4 ore collegare l'ago il piercer tubo Modello 184. Collegare la penna al modello in linea Isco UA-5 Assorbanza / Monitor fluorescenza. Accendere l'assorbanza monitor per consentire una linea di base stabile da raggiungere prima all'analisi di campioni. Acquisizione elettronica del profilo polisomi può facilmente essere ottenuta collegando un DI-148U unità di acquisizione dati (DATAQ Instruments) al registratore grafico. I profili possono poi essere raccolti in tempo reale e salvati per la successiva annotazione utilizzando il software che accompagna WinDaq.
- Riempire la pompa a siringa con 50 mL di Fluorinert utilizzando il flusso inverso, presa rapida. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria presenti. Collegare il tubo dalla siringa al tubo di piercer e brevemente accendere il flusso di Fluorinert a 3 ml / min in avanti per eliminare il tubo di eventuali bolle d'aria.
- Posizionare un bicchiere di rifiuti o di una serie di tubi, se raccolta frazioni sotto il tubo al termine della cella di flusso per la raccolta del campione scappare.
- Rimuovere con attenzione i tubi polyallomer centrifuga contenente il gradiente di saccarosio dal rotore della centrifuga e disporli sul ghiaccio (pre-forma dei pozzi nel ghiaccio con un tubo vuoto per evitare gradienti di disturbo).
- Per analizzare estratti cellulari, posizionare il tubo di pendenza sul piercer tubo. Collegare la parte superiore del tubo alla presa e sicuro. Sollevare il palco fondo alla provetta in modo che l'ago penetra il fondo della provetta. Una volta che l'ago è sporgevano attraverso il fondo della provetta, inizia il flusso di Fluorinert in avanti a 6mL/min.
- Una volta che il Fluorinert ha iniziato scorre nel tubo, monitorare il movimento dell'ago sul monitor assorbanza online. Una volta che l'ago inizia a muoversi, accendere il movimento grafico in una impostazione di velocità di 60. Il monitor registra il diametro esterno 254 a partire dal materiale libero seguita da rilevamento subunità 40S ribosomiale e continuando fino ai complessi polyribosome. Se si stanno raccogliendo frazioni di RNA o analisi delle proteine, tipicamente 0,2 frazioni min sono prese (1 ml). Per l'analisi dell'RNA, le frazioni devono essere raccolti direttamente in tubi contenenti Trizol (Invitrogen), fenolo o SDS / proteinasi K, a seconda del metodo preferito di estrazione.
- Quando alla fine del profilo polyribosome è stato raggiunto, spegnete il flusso di Fluorinert alla provetta e fermare il movimento grafico della assorbanza / monitor fluorescenza.
- Ritrarre il Fluorinert dalla provetta nella siringa inizio il flusso in direzione inversa a un ritmo rapido facendo attenzione a non trarre saccarosio dal tubo nella siringa. Svitare il tubo da centrifuga il piercer tubo, abbassare l'ago, e rimuovere il tubo.
- Ripetere i passaggi 5.5 tramite 5.8 per ogni gradiente di saccarosio.
- Quando tutti i gradienti di saccarosio sono stati analizzati, ritrarre il Fluorinert dal tubo nella siringa. Rimuovere ogni parte del frazionatore (piercer tubo e cella a flusso), tra cui il tubo dei rifiuti situato nella parte superiore e risciacquare bene con acqua.
5. Raccolta dei dati e delle frazioni
6. Rappresentante Risultati
Figura 1. Traccia rappresentante di estratto ribosoma preparata da un ceppo di lievito BY4741 (Mat A Δ his3 1 leu2 met15 Δ Δ 0 0 ura3 Δ 0) in presenza di cicloesimide. L'estratto ribosomiale è stato frazionato utilizzando un gradiente di saccarosio 7 47% e analizzati utilizzando un apparato di siringa pompa collegata ad un rilevatore di raggi UV. Vette contenenti poliribosomi e 80S, 60S e 40S ribosomi sono indicati.
Discussion
Le informazioni ottenute dal profilo polyribosome può fornire informazioni preziose sullo stato traslazionale della cellula. Inoltre, lo stato del gruppo di subunità ribosomiali si può essere determinato 2. Per esempio la presenza di halfmers o 80S e grandi vette con una spalla leggermente a destra sul profilo indica una subunità 40S legato in attesa di entrare subunità 60S. Esecuzione l'esperimento in assenza di qualsiasi cicloeximide aggiunto o inibitore altri allungamento permette l'analisi del tasso di scappare, che indica se non viene alterata o allungamento 3. Le stesse frazioni sono una ricca fonte di reagenti per la determinazione successiva l'associazione di un mRNA specifico o di proteine con sottopopolazioni ribosomiale tamponando Nord Occidentale o delle frazioni. L'intero gruppo di mRNA associati ribosomi attivo può essere determinato tramite un associato microarray 4 o profonda analisi di sequenziamento 5. Le associazioni proteina può anche essere stabilizzato con l'aggiunta appropriata di un reticolazione reagente 6.
Analisi Polyribosome dalle cellule dei mammiferi è da segnalare come un protocollo distinto in termini di apparente difficoltà nello stabilire le condizioni necessarie per ottenere polisomi stabile. I sistemi tampone riportati in letteratura sono ampiamente variable 7-10, quindi non vi può essere un requisito per il tipo cellulare ottimizzazione specifica del tampone di lisi, o è altrettanto plausibile che il sistema tampone non è importante quanto l'attenzione desiderosi di lavorare con lisati fresca conservati a basse temperature. A nostra conoscenza una valutazione sistematica dei parametri che influenzano la formazione di polisomi mammiferi non è stata riportata.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare John Woolford per la base iniziale di questo metodo, TGK è sostenuto da NIH GM057483 e AI076245 e PRC è supportato da GM77073.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyallomer ultracentrifuge tube | Beckman Coulter Inc. | 326823 | 1 x 3.5 in. (25x89mm) |
| Fluorinert | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Cycloheximde | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 | Other strains work equally well |
References
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