Summary
Denna artikel beskriver ett protokoll för utvinning av översätta ribosomer från eukaryota celler. När extraherade, är ribosomer separeras i monosomes och polyribosomes av sackaros gradient fraktionering att tillåta olika ribosomala populationer som skall analyseras. Som sådan är denna metod den gyllene standarden för att granska regleringen av översättning.
Abstract
Proteinsyntesen är en komplex cellulär process som regleras på många nivåer. Till exempel kan den globala översättning hämmas vid initieringsfasen eller töjning fasen av en mängd olika cellulära stress, såsom aminosyror svält eller tillväxtfaktor tillbakadragande. Alternativt kan översättning av enskilda mRNA regleras av mRNA lokalisering eller förekomsten av likartade mikroRNA. Studier av proteinsyntesen utnyttjar ofta polyribosome analys för att belysa mekanismerna för översättning förordning eller defekter i proteinsyntesen. I denna analys är mRNA / ribosomen komplex isolerade från eukaryota celler. En sackaros densitetsgradient separerar mRNA bunden till flera ribosomer kallas polyribosomes från mRNA bunden till en enda ribosomen eller monosome. Fraktionering av gradienter ger isolering och kvantifiering av de olika ribosomala befolkningar och deras tillhörande mRNA eller protein. Skillnader i förhållandet polyribosomes att monosomes fastställda villkor kan tyda på brister i antingen översättning inledande eller förlängning / uppsägning. Undersökning av mRNA som finns i polyribosome fraktioner kan avslöja om den kohort av enskilda mRNA översätts förändras med experimentella förhållanden. Dessutom kan ribosomen montering övervakas genom analys av de små och stora subenheten på ribosomerna toppar som också skiljs åt av övertoningen. I denna video presenterar vi en metod för framställning av råolja ribosomala utdrag från jästceller, separation av extraktet av sackaros lutning och tolkning av resultaten. Detta förfarande är lätt att anpassa till däggdjursceller.
Protocol
1. Beredning av 7-47% sackaros gradienter
- Förbered sackaros gradienter en dag innan den används för att gradienter att bli kontinuerlig. Gör steril 7% och 47% sackaros lösningar innehållande 50 mM NH 4 Cl, 50mm tris-acetat pH 7,0 och 12 mm MgCl 2 och förvara vid 4 ° C 1.
- För 6 gradienter blanda 7% och 47% sackaros lösningar lager för att göra 48 ml av vardera av följande sackaros koncentrationer. Lägg DTT (1M lager) till varje sackaros lösning till en slutlig koncentration av 1mm.
Slutlig koncentration 7% sackaros 47% sackaros 7% 48 ml 0 17% 36 ml 12 ml 27% 24 ml 24 ml 37% 12 ml 36 ml 47% 0 48 ml - För att hälla gradienter, bifoga en pasteurpipett till en 20 ml spruta genom att säkra och tätning med Parafilm eller använda en lång nål. Tillsätt 7 ml 7% sackaros till botten av en 1 x 3,5 "polyallomer ultracentrifugen röret. Nästa tillsätt 7 ml 17% sackaros lösning under 7% lösning genom att placera Pasteur pipettspetsen nära botten av röret och pipettering inte snabbare än 0,3 mL / sek. Upprepa med 7 ml vardera 27%, 37% och 47% lösningar sackaros. Du bör observera tydliga linjer mellan lagren, vilket indikerar att minimal blandning har skett. Förvara lutningar vid 4 ° C över natten tillsammans med rotorer, flaskor och rör som ska användas för att skörda prover.
2. Beredning av jästextrakt
- Odla 125 ml jäst kultur till en OD 600 på 0,8-1,0. Lägg cykloheximid till kulturen till en slutlig koncentration av 100 mikrogram / ml och fortsätter skaka vid 30 ° C i 15 min.
- Under tiden förbereder lyseringsbuffert innehåller 80 mikrogram / ml cykloheximid, 200 mikrogram / ml heparin, 0,2% DEPC, och 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 miljoner NaCl, 30mm MgCl 2. Håll allt på is från och med nu.
- Häll kulturen till en 250 ml centrifug flaska och fyll med is. Centrifugera vid 8000 xg (7250 rpm i en SLA-1500 rotor) i 5 minuter vid 4 ° C. Tvätta pelleten gång med 10 ml iskall lyseringsbuffert och transfer till 15 tuber ml polypropylen. Centrifugera vid 5900 xg (~ 6000 rpm i en SLA-600TC rotor) i 3 min vid 4 ° C. Återsuspendera pelleten i 0,5 ml lyseringsbuffert, transfer till 1,5 ml rör och tillsätt 0,5 ml kyld, bakad syratvättad glaspärlor. Vortex cellerna för fyra 30 sek intervaller, kyla röret på is i 30 sekunder mellan varje intervall. Lägg till ytterligare 0,5 mL lyseringsbuffert till 1,5 ml rör. Centrifugera vid maximal hastighet i mikrocentrifug (14.000 rpm i ett Eppendorf-5417R mikrocentrifug) i 10 min vid 4 ° C. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Ta bort 10 l till en separat slang för att fastställa OD 260 / OD 280-tal (se steg 3.1). Förvara extrakten vid -80 ° C.
3. Beredning av extrakt från däggdjursceller
- För anhängare celler växer i 100 mm maträtt till ~ 70% sammanflödet. Du behöver en 100 mm fat per 11 ml lutning (typiskt avkastning är ~ 20 OD 260 enheter). Skala beloppet linjärt för större eller mindre lutning storlekar. För icke-häftande celler, är cirka 1 x 10 7 celler som behövs per 11 ml lutning.
- Före lys, lägga cykloheximid till 100 mikrogram / ml. Inkubera vid 37 ° C i 15 min. Överföring tallrikar till is och skölj celler två gånger i iskallt PBS. Alla framtida åtgärder måste utföras vid 0-4 ° C.
- Ta bort alla spår av PBS genom aspiration (låt plattorna rinna av på en vinklad bädd av is) och tillsätt 1 ml buffert lys, skrapa och överföra till redan kyld 1,5 ml rör. Lyseringsbuffert komponenter måste optimeras för att den celltyp och villkor tillväxt. En bra start buffert skulle vara 20 mm HEPES-KOH, pH 7,4, 15 mm MgCl 2, 200 mm KCl, 1% Triton X-100 (v / v), 100 mikrogram / ml cykloheximid, 2 mM DTT och 1 mg / mL heparin. De viktigaste variablerna är halterna av magnesium och kalium klorid samt inkludering eller uteslutning av icke-joniska tvättmedel för att förbättra utvinningen av cytoskelettala eller membranbundna polysomes. Lyse cellerna genom att passera 27 gauge injektionsnålen två gånger eller med 5-10 slag av dounce homogenisering med hjälp av typ B mortelstöt. Sprutan eller homogeniseringsblandare bör pre-kyld innan användning.
- Snurra på 14.000 xg under 5 minuter i kylda mikrocentrifug. Överföring färska lysat till sackaros lutning (för mammalieceller detta består i lyseringsbuffert saknar Triton X-100 och heparin men annars som beskrivs i 1.2 och 1.3) eller Flash frysa i flytande kväve för senare användning. 4. Centrifugering av gradienter
- Tina polyribosome lysates på is. Bestäm koncentrationen av nukleinsyra i lysat genom att lägga till den reserverade 10 mikroliter prov till 1 ml vatten och läsa OD 260 / OD 280 kvoten med en spektrofotometer. Typiska avkastningen från en jästkultur växt som beskrivs är 50 OD enheter.
- Med hjälp av en pipett med spetsen placerad mot väggen av röret nära ytan på toningen, mjukt lager 25 OD 260 enheter av lysat ovanpå övertoningen. För en 35 ml gradient 500 ìl lysat är normalt laddas. Lyseringsbuffert kan användas för att försäkra alla lutningar är laddade med en lika volym. Lägre mängder material ger bättre upplösning. Använd pincett försiktigt sänka gradienter i hinkar med en svängig hink rotor.
- Centrifugera gradienter vid 100.000 xg (23 tusen rpm i en Surespin 630 rotor) för 4 tim vid 4 ° C. Detta protokoll kan anpassas för mindre volym gradienter.
- Cirka 30 min före slutförandet av den 4 tim snurra fast nålen till modell 184 röret piercer. Fäst pennan till online Isco modell UA-5 Absorbans / Fluorescence Monitor. Slå på absorbansen monitorn för att möjliggöra en stabil baslinje ska nås innan för att analysera prover. Elektronisk förvärvet av polysome profilen kan enkelt erhållas genom att fästa en DI-148U datainsamling enhet (DATAQ Instruments) till diagrammet brännaren. Profiler kan sedan samlas i realtid och sparas för senare anteckning med medföljande WinDaq programvaran.
- Fyll sprutan pumpen med 50 ml Fluorinert med omvänt flöde, snabb inställning. Se till att inga luftbubblor förekommer. Anslut slangen från sprutan till röret piercer och kort slå på strömmen av Fluorinert på 3 ml / min i riktning framåt för att rensa slangen i några luftbubblor.
- Placera ett slöseri bägare eller serie rör om samla fraktioner under slangen i slutet av flödet cellen för att samla prov rinner av.
- Ta försiktigt bort rören polyallomer centrifugen innehåller sackaros gradient från centrifugrotorns och placera dem på is (pre-form brunnarna i isen med en tom tub för att undvika störande gradienter).
- Att analysera cell extrakt, placera lutning röret på tuben piercer. Anslut toppen av röret till uttaget och säkert. Höj den nedre scenen till centrifugröret så att nålen tränger ner i röret. När nålen har stack genom botten av centrifugröret börjar flödet av Fluorinert i framriktningen på 6mL/min.
- När Fluorinert nu flyter i röret, övervaka förflyttningar av nålen på online absorbansen monitorn. När nålen börjar röra sig, slå på diagrammet rörelsen till en hastighet inställning av 60. Monitorn registrerar OD-254 som börjar med den fria materialet följt av 40S-subenheten på ribosomerna upptäckt och fortsätter genom att polyribosome komplex. Om du samlar fraktioner för RNA eller protein analys, är vanligtvis 0,2 min fraktioner tas (1 ml). För RNA-analys bör fraktioner samlas direkt i provrör innehållande Trizol (Invitrogen), fenol eller SDS / proteinas K, beroende på vilken metod som föredras av extraktion.
- När slutet av polyribosome profilen har uppnåtts, stänga av flödet av Fluorinert till centrifugröret och stoppa diagrammet rörelse absorbansen / fluorescens bildskärm.
- Fäll in Fluorinert från centrifugröret i sprutan genom att börja flödet i motsatt riktning i snabb takt och se till att inte dra sackaros från röret in i sprutan. Skruva centrifugröret från tuben piercer, sänka nålen och ta bort röret.
- Upprepa steg 5,5 till 5,8 för varje sackaros lutning.
- När alla sackaros lutningar har analyserats, dra tillbaka Fluorinert från slangen tillbaka in i sprutan. Ta bort varje del av fraktionerings (rör piercer och flödescell) inklusive avfall slangen längst upp och skölj väl med vatten.
5. Insamling av data och fraktioner
6. Representativa resultat
Figur 1. Representant spår av ribosomen extrakt framställda av jäst stam BY4741 (matta en his3 Δ 1 leu2 Δ 0 met15 Δ 0 ura3 Δ 0) i närvaro av cykloheximid. Den ribosomala extrakt var fraktionerade använder en 7 47% sackaros lutning och analyseras med hjälp av en apparat pump spruta kopplad till en UV-detektor. Toppar som innehåller polyribosomes och 80S, 60S och 40S ribosomer anges.
Discussion
Den information som erhålls från polyribosome profilen kan ge värdefull inblick i translationell status cellen. Dessutom kan status för montering av ribosomsubenheterna själva bestämmas 2. Till exempel förekomsten av halfmers eller 80S och större toppar med en liten skuldra till höger på den profil som visar en bunden 40S subenhet väntar 60S subenhet gå. Utföra experiment i avsaknad av någon extra cykloheximid eller andra hämmare av töjning möjliggör analys av graden av avrinning, som anger om eller inte töjning ändras 3. De procenttal som själva är en rik källa av reagenser för den efterföljande bestämningen av den sammanslutning av ett specifikt mRNA eller protein med ribosomala delpopulationer av norra eller Western blotting av bråk. Den totala pool av mRNA i samband med aktiva ribosomer kan bestämmas via en tillhörande microarray 4 eller djupa sekvensering analys 5. Proteinet föreningar kan också stabiliseras genom en lämplig tillsats av ett kors länka reagens 6.
Polyribosome analys från däggdjursceller är också värt att nämna som en distinkt protokoll i termer av de uppenbara svårigheter att fastställa de villkor som krävs för att få en stabil polysomes. Bufferten system rapporterats i litteraturen är vitt varierande från 70 till 10, så det kan finnas ett behov av celltyp specifika optimering av lyseringsbuffert, eller är det lika troligt att bufferten är inte lika viktigt som noga följa arbetet med färska lysates förvaras vid låga temperaturer. Såvitt vi vet en systematisk utvärdering av de parametrar som påverkar däggdjur polysome bildning har inte rapporterats.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för John Woolford för den första grunden för denna metod, TGK stöds av NIH GM057483 och AI076245 och Kina stöds av GM77073.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyallomer ultracentrifuge tube | Beckman Coulter Inc. | 326823 | 1 x 3.5 in. (25x89mm) |
| Fluorinert | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Cycloheximde | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 | Other strains work equally well |
References
- Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C. Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
- Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking. Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).
- Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon. Rna. 6, 1573-1584 (2000).
- Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R. Analysis of mRNA formation and function. Richter, J. D. , Academic Press. 305-321 (1997).
- Martin, G. W. 3rd, Berry, M. J. Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs. Genes Cells. 6, 121-129 (2001).
- Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation. J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).
