Summary
توضح هذه المقالة على بروتوكول لاستخراج ترجمة ريبوسوم من خلايا حقيقية النواة. استخراج مرة واحدة ، يتم فصلها في ريبوسوم monosomes وpolyribosomes بواسطة تجزيء التدرج السكروز للسماح بتحليل السكان الريباسي مختلفة. على هذا النحو ، فإن هذا الأسلوب هو معيار الذهب لدراسة تنظيم الترجمة.
Abstract
تخليق البروتين هو عملية معقدة الخلوية التي تنظم في العديد من المستويات. على سبيل المثال ، يمكن أن تحول دون الترجمة العالمي في مرحلة بدء المرحلة استطالة أو من جانب مجموعة متنوعة من الضغوط الخلوية مثل المجاعة الأحماض الأمينية أو النمو الانسحاب عامل. بدلا من ذلك ، يمكن أن ينظم ترجمة mRNAs الفردية عن طريق توطين مرنا أو وجود microRNAs وما شابه ذلك. دراسات لتصنيع البروتين في كثير من الأحيان استخدام تحليل polyribosome لتسليط الضوء على آليات التنظيم الترجمة أو عيوب في تخليق البروتين. في هذا الاختبار ، يتم عزل مرنا / المجمعات الريبوسوم من خلايا حقيقية النواة. التدرج الكثافة السكروز يفصل mRNAs منضمة إلى ريبوسوم متعددة المعروفة باسم polyribosomes من mRNAs منضم إلى الريبوسوم واحد أو monosome. تجزيء من التدرجات يسمح العزلة والكمي للسكان الريباسي المختلفة والمرتبطة بها أو mRNAs البروتينات. يمكن الاختلاف في نسبة polyribosomes لmonosomes في ظل ظروف محددة يكون مؤشرا على بدء عيوب في الترجمة أو استطالة / الإنهاء. ويمكن النظر في mRNAs موجودة في الكسور polyribosome تكشف ما إذا كان فوج من mRNAs الفردية يترجم التغييرات مع الظروف التجريبية. بالإضافة ، يمكن رصد التجمع الريبوسوم من خلال تحليل قمم الوحيدات الريباسي الصغيرة والكبيرة التي يتم فصلها أيضا عن طريق التدرج. في هذا الفيديو ، نقدم طريقة لإعداد مقتطفات الريباسي الخام من خلايا الخميرة ، وفصل من مستخلص بواسطة التدرج السكروز وتفسير النتائج. هذا الإجراء هو قابلية للتكيف مع خلايا الثدييات.
Protocol
1. إعداد التدرجات السكروز 7-47 ٪
- إعداد التدرجات السكروز قبل يوم واحد للسماح للاستخدام تدرجات لتصبح مستمرة. جعل العقيمة 7 ٪ و 47 ٪ سكروز الحلول التي تحتوي على 50mM NH 4 CL ، 50mM 7.0 درجة الحموضة تريس ، وخلات MgCl 12mM (2) ومخزن في 4 درجات مئوية 1.
- لخليط من التدرجات 6 7 ٪ و 47 ٪ سكروز الأسهم حلول لجعل 48 مل من كل من تركيز السكروز التالية. إضافة DTT (1M الأسهم) إلى كل حل السكروز إلى التركيز النهائي لل1MM.
التركيز النهائي 7 ٪ سكروز 47 ٪ سكروز 7 ٪ 48 مل 0 17 ٪ 36 مل 12 مل 27 ٪ 24 مل 24 مل 37 ٪ 12 مل 36 مل 47 ٪ 0 48 مل - من أجل صب التدرجات ، نعلق ماصة باستور لحقنة 20 مل من خلال تأمين وختم مع Parafilm أو استخدام إبر طويلة. إضافة 7 مل من السكروز بنسبة 7 ٪ إلى أسفل (أ) 1 × 3.5 "polyallomer أنبوب نابذة فائقة السرعة. التالي إضافة 7 مل من محلول السكروز 17 ٪ في إطار حل 7 ٪ عن طريق وضع غيض ماصة باستور بالقرب من الجزء السفلي من أنبوب وpipetting بسرعة لا تزيد على 0.3 مل / ثانية. كرر مع 7 مل من كل من 27 ٪ ، 37 ٪ وحلول السكروز 47 ٪. يجب مراقبة خطوط واضحة بين الطبقات ، مشيرا إلى أن الحد الأدنى من الخلط حدث. مخزن التدرجات في 4 درجات مئوية خلال الليل مع الزجاجات والدوارات والأنابيب التي سيتم استخدامها لجني العينات.
2. إعداد خلاصة الخميرة
- تنمو 125 مل من ثقافة الخميرة إلى OD 600 من 0،8-1،0. إضافة إلى الثقافة سيكلوهيكسيميد إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل ويستمر اهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- وفي الوقت نفسه ، وإعداد العازلة تحلل تحتوي على 80 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد ، 200 الهيبارين ميكروغرام / مل ، DEPC 0.2 ٪ ، و 10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5 ، 0.1M كلوريد الصوديوم ، 30mM MgCl 2. ابقاء كل شيء على الجليد من هذه النقطة.
- من أجل ثقافة في زجاجة مل 250 جهاز طرد مركزي وملء مع الثلج. الطرد المركزي في 8000 XG (7250 دورة في الدقيقة في الدوار SLA - 1500) لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. بيليه يغسل مرة واحدة مع 10 مل من الجليد العازلة تحلل الباردة ونقل أنابيب البولي بروبلين إلى 15 مل. الطرد المركزي في 5900 XG (~ 6000 دورة في الدقيقة في جيش لبنان الجنوبي ، 600TC الدوار) لمدة 3 دقائق على 4 درجات مئوية. Resuspend الكرية في 0.5 مل من نقل تحلل ، عازلة لأنبوب 1.5mL وإضافة 0.5 مل من ، خبز المبردة الخرز الزجاجي حمض غسلها. دوامة الخلايا لفترات four 30 ثانية ، والتبريد الأنبوب على الجليد لمدة 30 ثانية بين كل فاصل زمني. إضافة آخر مل 0.5 من تحلل عازلة داخل الأنبوب مل 1.5. الطرد المركزي في السرعة القصوى في microcentrifuge (14000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge 5417R إيبندورف) لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف لنقل جديد 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. إزالة 10 ميكرولتر لأنبوب منفصل لتحديد 260 / 280 OD OD نسبة (انظر الخطوة 3.1 أدناه). مقتطفات المحل في -80 درجة مئوية.
3. إعداد مقتطفات من خلايا الثدييات
- لخلايا ملتصقة ، وتنمو في طبق بقطر 100 ملم لالتقاء ~ 70 ٪. سوف تحتاج طبق واحد لكل 100 ملم التدرج مل 11 (العائد النموذجية ~ 20 OD 260 وحدة). مقياس كمية خطيا لأحجام التدرج أكبر أو أصغر. لغير ملتصقة الخلايا ، وهناك حاجة إلى ما يقرب من 1 × 10 7 خلايا التدرج في 11 مل.
- قبل تحلل ، إضافة إلى سيكلوهيكسيميد 100 ميكروغرام / مل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. نقل صفائح الجليد الى الخلايا وشطف مرتين في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. يجب أن تتم جميع الخطوات المستقبلية في الخروج 0-4 درجة مئوية.
- إزالة جميع آثار PBS بواسطة الطموح (لوحات استنزاف على سرير من الثلج الزاوية) وإضافة 1 مل تحلل العازلة ، كشط ونقل مبردة إلى ما قبل 1.5 مل أنبوب. وسوف تحلل مكونات عازلة تحتاج إلى أن يكون الأمثل لنوع من الخلايا وظروف النمو. ومن شأن انطلاق جيدة العازلة هو 20 ملي HEPES - كوه ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 15 ملم MgCl 2 ، 200 ملي بوكل ، 1 ٪ تريتون X - 100 (V / V) ، و 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد ، 2 مم DTT ، و 1 ملغم / مل الهيبارين. المتغيرات الرئيسية هي تركيزات المغنيسيوم وكلوريد البوتاسيوم وكذلك إدراج أو استبعاد غير الأيونية المنظفات لتحسين استخراج هيكل الخلية أو الغشاء polysomes ملزمة. ليز الخلايا التي تمر عبر قياس 27 إبرة حقنة مرتين أو السكتات الدماغية 50-10 من التجانس dounce باستخدام نوع B مدقة. ينبغي أن تكون حقنة أو الخالط قبل المبردة قبل الاستخدام.
- تدور 14000 XG لمدة 5 دقائق في microcentrifuge مبردة. نقل جديدة لlysate التدرج السكروز (للخلايا الثدييات يتم هذا في المخزن تحلل تفتقر تريتون X - 100 ولكن على خلاف ذلك الهيبارين كما هو موضح في 1.2 و 1.3) أو وميض التجميد في النيتروجين السائل للاستخدام في وقت لاحق. 4. الطرد المركزي من التدرجات
- أذاب lysates polyribosome على الجليد. تحديد تركيز الحمض النووي في lysate بإضافة 10 عينة محفوظة ميكرولتر إلى 1 مل من الماء وقراءة 260 / 280 OD OD النسبة مع معمل. العائد نموذجية من ثقافة الخميرة نمت كما هو موضح هو 50 وحدة التطوير التنظيمي.
- باستخدام ماصة توضع مع طرف ضد جدار الانبوب بالقرب من سطح التدرج ، طبقة بلطف 25 OD 260 وحدات من lysate على أعلى من التدرج. ليتم تحميلها عادة التدرج مل 500 35 ميكرولتر من lysate. ويمكن استخدام العازلة تحلل لضمان يتم تحميل كافة التدرجات مع حجم مساو. انخفاض كميات من المواد العائد أفضل قرار. باستخدام الملقط ، وانخفاض بعناية التدرجات في دلاء من الدوار الدلو المتأرجح.
- الطرد المركزي التدرجات في XG 100000 (23000 دورة في الدقيقة في الدوار Surespin 630) لمدة 4 ساعة على 4 درجات مئوية. يمكن تكييفها لهذا البروتوكول التدرجات حجم أصغر.
- حوالي 30 دقيقة قبل الانتهاء من زيادة ونقصان 4 ساعة إرفاق الإبرة إلى أنبوب ثاقبة الموديل 184. نعلق القلم لنموذج ISCO الانترنت UA - 5 امتصاص / مراقب الإسفار. السلطة على رصد الامتصاصية للسماح ليتم التوصل إلى خط مستقر قبل تحليل العينات. ويمكن بسهولة الحصول الإلكترونية من ملف polysome يمكن الحصول عليها عن طريق إرفاق الحصول على البيانات DI - 148U الوحدة (DATAQ صكوك) إلى مسجل التخطيط. ويمكن عندئذ أن تكون مواصفات التي تم جمعها في الوقت الحقيقي ، وحفظها للشرح في وقت لاحق باستخدام برنامج WinDaq المرافق له.
- شغل مضخة المحاقن مع 50mL استخدام Fluorinert التدفق العكسي ، ووضع السريع. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء الحاضر. بتوصيل خرطوم من الحقنة إلى الأنبوب ثاقبة وبدوره لفترة وجيزة على تدفق Fluorinert في 3 مل / دقيقة في اتجاه واضح إلى الأمام لخرطوم من أي فقاعات هواء.
- دورق مكان النفايات أو سلسلة من الأنابيب إذا جمع الكسور تحت خرطوم في نهاية الخلية التدفق لجمع عينة الجريان.
- إزالة بعناية أنابيب أجهزة الطرد المركزي التي تحتوي على التدرج polyallomer السكروز من الدوار بالطرد المركزي ووضعها على الجليد (ما قبل تشكل الآبار في الجليد مع أنبوب فارغ لتجنب التدرجات مزعجة).
- مقتطفات من تحليل الخلية ، وضع أنبوب التدرج ثاقبة على الأنبوب. ربط الجزء العلوي من الأنبوب إلى منفذ وآمنة. رفع مرحلة القاع في أنبوب الطرد المركزي بحيث إبرة يثقب قاع الأنبوب. مرة واحدة الإبرة ويبرز من خلال الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي ، يبدأ تدفق Fluorinert في الاتجاه إلى الأمام في 6mL/min.
- مرة واحدة في Fluorinert بدأت تتدفق على أنبوب ، ورصد حركة الإبرة على رصد الامتصاصية على الانترنت. الإبرة مرة واحدة تبدأ في التحرك ، بدوره على حركة التخطيط لإعداد سرعة 60. سيتم رصد تسجيل 254 OD بدءا من المواد حرة تليها 40S الريباسي الوحيدات ، والكشف المستمر من خلال مجمعات لpolyribosome. إذا كنت جمع الكسور أو تحليل الحمض النووي الريبي للبروتين ، وتؤخذ عادة كسور دقيقة 0.2 (1 مل). لتحليل الحمض النووي الريبي ، ينبغي جمع الكسور في أنابيب تحتوي على مباشرة Trizol (Invitrogen) ، الفينول أو K SDS / بروتين ، اعتمادا على الأسلوب المفضل لاستخراج.
- عندما تم الوصول إلى نهاية ملف polyribosome ، إيقاف تدفق Fluorinert إلى أنبوب الطرد المركزي وتوقف حركة الرسم البياني للالامتصاصية / رصد مضان.
- التراجع عن Fluorinert من أنبوب الطرد المركزي في حقنة قبل بداية تدفق في الاتجاه المعاكس بمعدل سريع مع التأكد من عدم استخلاص السكروز من أنبوب داخل المحقنة. فك أنبوب الطرد المركزي من أنبوب ثاقبة ، وانخفاض الإبرة ، وإزالة الأنبوب.
- كرر الخطوات من خلال 5،5 5،8 لكل التدرج السكروز.
- عندما تم تحليل جميع التدرجات السكروز ، والتراجع عن Fluorinert من خرطوم مرة أخرى إلى المحقنة. إزالة كل جزء من fractionator (ثاقبة وأنبوب تدفق الخلية) بما في ذلك خرطوم النفايات الموجود في أعلى وشطف جيدا مع الماء.
5. جمع البيانات والكسور
6. ممثل النتائج
الشكل 1. تتبع ممثل الريبوسوم محضرة من مستخلص الخميرة BY4741 سلالة (حصيرة a his3 Δ Δ 0 1 leu2 met15 Δ Δ ura3 0 0) في وجود سيكلوهيكسيميد. كان استخراج الريباسي مجزأة الاستفادة من التدرج السكروز 7 47 ٪ ، وتحليلها باستخدام جهاز ضخ حقنة موصولة إلى كاشف للأشعة فوق البنفسجية. يشار إلى القمم التي تحتوي على polyribosomes و80S ، 60s و 40S ريبوسوم.
Discussion
يمكن الحصول على المعلومات من التشكيل polyribosome توفير معلومات قيمة حول حالة متعدية للخلية. بالإضافة ، يمكن تحديد حالة تجميع مفارز الريباسي أنفسهم 2. على سبيل المثال وجود halfmers أو 80S وأكبر قمم مع الكتف طفيفة إلى اليمين على ملف يشير إلى الالتزام الوحيدات 40S 60S الوحيدات تنتظر الانضمام. تنفيذ التجربة في ظل غياب أي سيكلوهيكسيميد المضافة أو غيرها من مثبطات استطالة يسمح للتحليل في معدل الجريان السطحي ، الذي يشير إلى ما إذا كانت أو لم يتم تبديل استطالة 3. الكسور هي نفسها مصدرا غنيا من الكواشف لقرار لاحق للجمعية من بروتين معين أو مرنا مع المجموعات السكانية الفرعية التي الريباسي النشاف أو الشمالية الغربية من الكسور. يمكن تحديد تجمع مجموعه mRNAs المرتبطة ريبوسوم النشطة عبر ميكروأري المرتبطة 4 أو 5 العميق تحليل التسلسل. كما يمكن للجمعيات أن يستقر البروتين بإضافة المناسبة لربط عبر كاشف 6.
تحليل Polyribosome من خلايا الثدييات الجدير بالذكر كبروتوكول متميزة من حيث الصعوبات الواضحة في تهيئة الظروف اللازمة للحصول على polysomes مستقرة. نظم العازلة التي أعلن عنها في الأدبيات هي متغير على نطاق واسع 70-10 ، وبالتالي قد يكون هناك شرط لخلية من نوع التحسين المحددة للتحلل العازلة ، أو أنه أمر وارد أيضا أن نظام المخزن ليس مهما بقدر الاهتمام حريصة على العمل مع أبقى lysates جديدة في درجات حرارة منخفضة. على حد علمنا لم يتم إجراء تقييم منهجي من المعلمات التي تؤثر على تشكيل polysome الثدييات عنها.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أنوه لجون Woolford الأساس الأولي لهذا الأسلوب ، يتم اعتماد TGK المعاهد الوطنية للصحة وGM057483 AI076245 ومعتمد من قبل لجان المقاومة الشعبية GM77073.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyallomer ultracentrifuge tube | Beckman Coulter Inc. | 326823 | 1 x 3.5 in. (25x89mm) |
| Fluorinert | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Cycloheximde | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 | Other strains work equally well |
References
- Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C. Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).
- Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).
- Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3. J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).
- Serikawa, K. A. The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
- Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking. Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).
- Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon. Rna. 6, 1573-1584 (2000).
- Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R. Analysis of mRNA formation and function. Richter, J. D. , Academic Press. 305-321 (1997).
- Martin, G. W. 3rd, Berry, M. J. Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs. Genes Cells. 6, 121-129 (2001).
- Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation. J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).
