Summary
इस लेख यूकेरियोटिक कोशिकाओं से ribosomes अनुवाद की निकासी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. एक बार निकाले ribosomes monosomes और polyribosomes में sucrose ढाल fractionation द्वारा अलग अलग ribosomal आबादी का विश्लेषण किया जा करने की अनुमति. जैसे, इस विधि के अनुवाद के नियमन की जांच के लिए सोने के मानक है.
Abstract
प्रोटीन संश्लेषण एक जटिल सेलुलर प्रक्रिया है कि कई स्तरों पर विनियमित है है. उदाहरण के लिए, वैश्विक अनुवाद दीक्षा या एमिनो एसिड भुखमरी या वृद्धि कारक वापसी के रूप में सेलुलर तनाव की एक किस्म द्वारा बढ़ाव चरण चरण में हिचकते जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, अलग - अलग mRNAs का अनुवाद mRNA स्थानीयकरण या आत्मीय microRNAs की उपस्थिति द्वारा विनियमित किया जा सकता है है. प्रोटीन संश्लेषण के अध्ययन अक्सर polyribosome विश्लेषण का उपयोग करने के लिए अनुवाद विनियमन या प्रोटीन संश्लेषण में दोषों के तंत्र पर प्रकाश डाला. इस परख में, mRNA / ribosome परिसरों यूकेरियोटिक कोशिकाओं से अलग हैं. एक sucrose के घनत्व ढाल एकाधिक एकल ribosome या monosome करने के लिए बाध्य mRNAs से polyribosomes के रूप में जाना जाता है ribosomes के लिए बाध्य mRNAs को अलग करती है. Gradients के Fractionation अलगाव और अलग ribosomal आबादी और उनके संबद्ध mRNAs या प्रोटीन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. Polyribosomes के अनुपात में परिभाषित शर्तों के तहत monosomes करने के लिए अंतर या तो अनुवाद दीक्षा बढ़ाव / या समाप्ति में दोष का संकेत हो सकता है. Polyribosome भागों में मौजूद mRNAs का परीक्षा प्रकट कर सकते हैं कि अलग - अलग mRNAs का काउहोट प्रयोगात्मक शर्तों के साथ परिवर्तन का अनुवाद किया जा रहा है. इसके अलावा, ribosome विधानसभा छोटे और बड़े ribosomal सबयूनिट चोटियों जो भी ढाल के द्वारा अलग कर रहे हैं के विश्लेषण से नजर रखी जा सकता है. इस वीडियो में, हम खमीर कोशिकाओं, निकालने के sucrose ढाल द्वारा जुदाई और परिणामों की व्याख्या से कच्चे ribosomal अर्क की तैयारी के लिए एक तरीका मौजूद है. इस प्रक्रिया को आसानी से स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अनुकूलनीय है.
Protocol
1. 7-47% sucrose gradients की तैयारी
- Sucrose gradients के एक दिन का उपयोग करने से पहले gradients निरंतर बनने के लिए अनुमति देने के लिए तैयार है. बाँझ 7% और 47% sucrose 50mm एनएच 4 सीएल युक्त समाधान, 50mm Tris-एसीटेट पीएच 7.0 और 12mm 2 MgCl और 4 बजे दुकान ° 1 सी.
- के लिए 6 gradients निम्नलिखित sucrose सांद्रता में से प्रत्येक के 48 एमएल बनाने के लिए मिश्रण करने के लिए 7% और 47% sucrose के शेयर समाधान. प्रत्येक 1mm की एक अंतिम एकाग्रता sucrose के समाधान के लिए डीटीटी (शेयर 1M) जोड़ें.
अंतिम एकाग्रता 7% sucrose 47% sucrose 7% 48 एमएल 0 17% 36 एमएल 12 एमएल 27% 24 एमएल 24 एमएल 37% 12 एमएल 36 एमएल 47% 0 48 एमएल - आदेश में gradients डाल करने के लिए, एक 20 एमएल सिरिंज Parafilm के साथ हासिल करने और सील द्वारा पाश्चर विंदुक या संलग्न एक लंबी सुई का उपयोग. एक 1 x 3.5 "polyallomer ultracentrifuge एक ट्यूब के नीचे 7% sucrose के 7 एमएल अगला जोड़ें. पाश्चर विंदुक टिप ट्यूब के नीचे के पास रखने और 0.3 की तुलना में कोई तेजी pipetting द्वारा 17% 7% समाधान के नीचे sucrose के समाधान के 7 एमएल जोड़ने एमएल / सेक 7 एमएल प्रत्येक 27%, 37% और 47% sucrose के समाधान के साथ दोहराएँ. आप परतों के बीच स्पष्ट लाइनों का पालन करते हैं, यह दर्शाता है कि कम से कम मिश्रण 4 में स्टोर. gradients ° सी रातोंरात रोटार, बोतलें, के साथ साथ हुआ है चाहिए और ट्यूबों कि नमूनों को फसल के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
2. खमीर निकालने की तैयारी
- 0.8-1.0 के 600 आयुध डिपो के लिए खमीर संस्कृति के 125 एमएल हो जाओ . संस्कृति cycloheximide 100 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें और 30 में मिलाते ° C 15 मिनट के लिए जारी रखने.
- इस बीच, 80 μg / एमएल cycloheximide, 200 / μg एमएल हेपरिन, 0.2% DEPC, और 10 मिमी Tris - एचसीएल 7.5 पीएच, 0.1M NaCl, 30mm 2 MgCl युक्त lysis बफर तैयार करते हैं. इस बिंदु पर से बर्फ पर सब कुछ रखें.
- संस्कृति एक 250 एमएल अपकेंद्रित्र बोतल में डालो और बर्फ के साथ भरें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 8,000 XG (एक रोटर SLA-1500 में 7250 rpm) पर अपकेंद्रित्र गोली एक बार धो बर्फ के ठंडे lysis बफर और 15 एमएल polypropylene ट्यूबों के लिए स्थानांतरण के 10 एमएल के साथ. 3 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए XG +५९०० (~ एक रोटर SLA-600TC में 6000 rpm) पर अपकेंद्रित्र Lysis बफर हस्तांतरण की 0.5 एमएल में गोली 1.5mL ट्यूब और Resuspend ठंडा, बेक्ड एसिड धोया ग्लास मनकों की 0.5 एमएल जोड़ने. भंवर चार 30 सेकंड अंतराल प्रत्येक अंतराल के बीच 30 सेकंड के लिए बर्फ पर ट्यूब शीतलन के लिए कोशिकाओं. 1.5 एमएल ट्यूब में lysis बफर के एक 0.5 एमएल जोड़ें. 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए microcentrifuge में अधिकतम गति (एक Eppendorf 5417R microcentrifuge में 14,000 rpm) अपकेंद्रित्र एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब करने के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. आयुध डिपो / 260 आयुध डिपो 280 अनुपात (3.1 नीचे कदम देखें) का निर्धारण एक अलग ट्यूब के लिए 10 μl निकालें. -80 पर स्टोर अर्क डिग्री सेल्सियस
3. स्तनधारी कोशिकाओं से अर्क की तैयारी
- पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, 100 मिमी ~ 70% संगम डिश में विकसित. आप एक 100 मिमी प्रति 11 मिलीलीटर ढाल पकवान (ठेठ उपज ~ 20 आयुध डिपो 260 इकाइयों) की आवश्यकता होगी. बड़े या छोटे ढाल के आकार के लिए राशि रैखिक स्केल. गैर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, लगभग 1 x 10 7 कोशिकाओं प्रति 11 मिलीलीटर ढाल की जरूरत है.
- पहले lysis के लिए, 100 μg / एमएल cycloheximide जोड़ें. 37 ° 15 मिनट के लिए सी सेते हैं. बर्फ प्लेटें स्थानांतरण और कोशिकाओं को बर्फ के ठंडे पीबीएस में दो बार कुल्ला. सभी भावी कदम 0-4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए
- आकांक्षा द्वारा पीबीएस के सभी निशान हटाएँ (दो प्लेटों के बर्फ की एक angled बिस्तर पर नाली) और 1 एमएल lysis बफर, परिमार्जन और पूर्व ठंडा 1.5 एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण जोड़ने. Lysis बफर घटकों के सेल प्रकार और विकास की स्थिति के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता होगी. एक अच्छा प्रारंभिक बफर 20 मिमी HEPES - KOH, 7.4 पीएच, 15 मिमी 2 MgCl, 200 मिमी KCl, 1% ट्राइटन होगा एक्स 100 (v / v), 100 μg / एमएल cycloheximide, 2 मिमी डीटीटी, और 1 / मिलीग्राम एमएल हेपरिन. कुंजी चर मैग्नीशियम और पोटेशियम क्लोराइड के रूप में अच्छी तरह के रूप में शामिल किए जाने या गैर ईओण डिटर्जेंट के बहिष्कार cytoskeletal या झिल्ली बाध्य polysomes की निकासी में सुधार की सांद्रता रहे हैं. 27 गेज सिरिंज सुई के माध्यम से दो बार पारित करके या dounce homogenization के 5-10 स्ट्रोक प्रकार बी मूसल का उपयोग करके कक्षों lyse. सिरिंज या homogenizer पहले पूर्व ठंडा उपयोग करने के लिए किया जाना चाहिए.
- प्रशीतित microcentrifuge में 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर स्पिन. Sucrose (स्तनधारी कोशिकाओं के लिए इस lysis ट्राइटन कमी X-100 और हेपरिन बफर में बना है, लेकिन अन्यथा रूप में 1.2 और 1.3 में वर्णित) ढाल या बाद में उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्रीज फ़्लैश ताजा lysate स्थानांतरण. 4. Gradients के centrifugation
- बर्फ पर polyribosome lysates पहले गला लें. 1 पानी की एमएल आरक्षित 10 μL नमूना जोड़ने और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ आयुध डिपो / 260 आयुध डिपो 280 अनुपात पढ़ने lysate में न्यूक्लिक एसिड की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं . बड़े हो के रूप में वर्णित एक खमीर संस्कृति से ठेठ उपज 50 आयुध डिपो इकाइयों है.
- ट्यूब ढाल की सतह के पास की दीवार, धीरे परत ढाल के शीर्ष पर lysate के 25 आयुध डिपो 260 इकाइयों के खिलाफ रखा टिप के साथ एक विंदुक का उपयोग करना. Lysate के 35 एमएल ढाल 500 μl आम तौर पर भरी हुई है. Lysis बफर करने के लिए सभी gradients के एक बराबर मात्रा के साथ लोड कर रहे हैं आश्वासन देता हूं करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सामग्री के निचले मात्रा बेहतर संकल्प उपज है. संदंश का प्रयोग, ध्यान से एक बाल्टी रोटर झूल की बाल्टी में gradients कम.
- 100.000 XG (Surespin 630 रोटर में 23,000 rpm) में gradients 4 में 4 घंटा के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस इस प्रोटोकॉल छोटी मात्रा gradients के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
- लगभग 30 मिनट पहले 4 घंटा स्पिन के पूरा करने के लिए मॉडल 184 ट्यूब बेधनेवाला सुई देते हैं. ऑनलाइन Isco मॉडल कलम संलग्न UA-5 absorbance / प्रतिदीप्ति मॉनिटर. Absorbance पर बिजली के लिए एक स्थिर आधारभूत विश्लेषण नमूने पहले पहुँच की अनुमति निगरानी. Polysome प्रोफ़ाइल के इलेक्ट्रॉनिक अधिग्रहण आसानी से चार्ट रिकार्डर के लिए एक DI-148U डाटा अधिग्रहण इकाई (DATAQ उपकरण) संलग्न द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. प्रोफाइल तो वास्तविक समय में एकत्र किया जा सकता है और एनोटेशन बाद साथ WinDaq सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के लिए बचाया.
- 50ml Fluorinert रिवर्स प्रवाह, तेजी से सेटिंग का उपयोग करने के साथ सिरिंज पंप भरें. यकीन है कि वहाँ कोई हवा बुलबुले मौजूद हैं. सिरिंज से ट्यूब बेधनेवाला नली कनेक्ट और संक्षेप में 3 / एमएल मिनट पर आगे की दिशा में Fluorinert के प्रवाह पर बारी करने के लिए किसी भी हवाई बुलबुले की नली स्पष्ट है.
- अगर भिन्न नली के तहत प्रवाह सेल के अंत में नमूना एकत्र इकट्ठा भाग बर्बादी या ट्यूबों के बीकर श्रृंखला प्लेस.
- ध्यान polyallomer अपकेंद्रित्र अपकेंद्रित्र रोटर sucrose ढाल से युक्त ट्यूबों को हटाने और उन्हें बर्फ पर जगह (एक खाली ट्यूब के साथ बर्फ में कुओं पूर्व फार्म परेशान gradients से बचने).
- सेल के अर्क का विश्लेषण करने के लिए, ट्यूब बेधनेवाला ढाल ट्यूब पर जगह है. आउटलेट ट्यूब के ऊपर कनेक्ट और सुरक्षित. अपकेंद्रित्र ट्यूब नीचे चरण उठाएँ इतना है कि ट्यूब के नीचे सुई pierces. एक बार सुई अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे के माध्यम से protruded है, आगे की दिशा में 6mL/min Fluorinert के प्रवाह शुरू.
- एक बार Fluorinert ट्यूब में बहने शुरू हो गया है, ऑनलाइन absorbance के मॉनीटर पर सुई के आंदोलन की निगरानी. एक बार सुई को स्थानांतरित करने के लिए, चार्ट आंदोलन पर स्थापित करने के लिए 60 की एक गति बारी शुरू होता है. मॉनिटर रिकॉर्ड 254 आयुध डिपो मुक्त 40S ribosomal सबयूनिट का पता लगाने और polyribosome परिसरों के माध्यम से जारी रखने के द्वारा पीछा सामग्री के साथ शुरू होगा . यदि आप शाही सेना या प्रोटीन विश्लेषण के लिए भागों इकट्ठा कर रहे हैं, आम तौर पर 0.2 मिनट भिन्न (1 एमएल) ले रहे हैं. शाही सेना के विश्लेषण के लिए भिन्न ट्यूबों युक्त (Invitrogen) Trizol, Phenol या एसडीएस / proteinase कश्मीर में सीधे एकत्र करना चाहिए, निष्कर्षण के पसंदीदा विधि पर निर्भर करता है.
- जब polyribosome प्रोफ़ाइल के अंत तक पहुँच गया है, बंद अपकेंद्रित्र ट्यूब Fluorinert के प्रवाह और बारी के absorbance / प्रतिदीप्ति मॉनिटर के चार्ट आंदोलन को रोकने.
- अपकेंद्रित्र ट्यूब से Fluorinert एक तेजी से सिरिंज में sucrose आकर्षित नहीं ट्यूब से सुनिश्चित करने के दर पर विपरीत दिशा में प्रवाह शुरू कर सिरिंज में वापस लेना. अपकेंद्रित्र ट्यूब खोल देना ट्यूब बेधनेवाला से, सुई कम, और ट्यूब हटा दें.
- दोहराएँ 5.8 के माध्यम से चरण प्रत्येक sucrose ढाल के लिए 5.5.
- जब सभी sucrose gradients का विश्लेषण किया गया है, नली से Fluorinert वापस वापस लेना सिरिंज में. Fractionator के प्रत्येक भाग बेकार शीर्ष पर स्थित नली सहित (ट्यूब बेधनेवाला और प्रवाह सेल) निकालें और पानी के साथ अच्छी तरह कुल्ला.
5. डेटा और भिन्न के संग्रह
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 ribosome निकालने के प्रतिनिधि ट्रेस खमीर BY4741 cycloheximide की उपस्थिति में तनाव (चटाई his3 Δ 1 leu2 Δ met15 0 0 ura3 Δ 0 Δ) से तैयार है . ribosomal निकालने fractionated था एक 47 7% sucrose ढाल का उपयोग और एक पंप सिरिंज एक यूवी डिटेक्टर से जुड़ी तंत्र का उपयोग कर विश्लेषण. Polyribosomes और 80, 60 और 40S ribosomes युक्त चोटियों संकेत कर रहे हैं.
Discussion
polyribosome प्रोफ़ाइल से प्राप्त जानकारी सेल के translational स्थिति में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. इसके अलावा, खुद ribosomal सब यूनिटों के विधानसभा की स्थिति 2 निर्धारित किया जा सकता है . उदाहरण के लिए halfmers या 80 और प्रोफ़ाइल पर सही करने के लिए एक मामूली कंधे के साथ बड़े चोटियों की उपस्थिति का संकेत करता है कि एक ही 40S 60 में शामिल होने का इंतजार कर सबयूनिट सबयूनिट. किसी भी जोड़ा cycloheximide या बढ़ाव के अन्य अवरोध करनेवाला के अभाव में प्रयोग प्रदर्शन से चलाने की दर है, जो इंगित करता है चाहे या नहीं बढ़ाव 3 बदल दिया है के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. भिन्न स्वयं एक विशिष्ट mRNA या भिन्न के उत्तरी या पश्चिमी सोख्ता द्वारा प्रोटीन ribosomal subpopulations के साथ सहयोग के बाद निर्धारण के लिए अभिकर्मकों के एक समृद्ध स्रोत रहे हैं. सक्रिय ribosomes के साथ जुड़े mRNAs का कुल पूल जुड़े 4 माइक्रोएरे या गहरी अनुक्रमण 5 विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है. प्रोटीन संघों भी 6 अभिकर्मक जोड़ने पार के उपयुक्त अलावा द्वारा स्थिर किया जा सकता है .
स्तनधारी कोशिकाओं से Polyribosome विश्लेषण भी स्थिर polysomes प्राप्त करने के लिए आवश्यक शर्तों की स्थापना में स्पष्ट कठिनाइयों के संदर्भ में एक अलग प्रोटोकॉल के रूप में उल्लेख के लायक है. साहित्य में रिपोर्ट बफर सिस्टम व्यापक रूप से चर रहे हैं 7-10, इस प्रकार सेल प्रकार lysis बफर के विशिष्ट अनुकूलन के लिए एक आवश्यकता हो सकता है, या यह भी उतना ही सुखद है कि बफर सिस्टम के साथ काम करने के लिए उत्सुक ध्यान के रूप में महत्वपूर्ण नहीं है ताजा lysates कम तापमान पर रखा. हमारे ज्ञान करने के लिए स्तनधारी polysome गठन को प्रभावित करने वाले मापदंडों के एक व्यवस्थित मूल्यांकन रिपोर्ट नहीं किया गया है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए इस विधि के प्रारंभिक आधार के लिए जॉन Woolford स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं, TGK GM057483 और AI076245 NIH द्वारा समर्थित है और पीआरसी GM77073 द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyallomer ultracentrifuge tube | Beckman Coulter Inc. | 326823 | 1 x 3.5 in. (25x89mm) |
| Fluorinert | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Cycloheximde | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 | Other strains work equally well |
References
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