Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis Published: May 23, 2010 doi: 10.3791/1949

Summary

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Abstract

Embryonale epitheliale cellen dienen als een ideaal model om de morfogenese bestuderen waar multi-cellulaire weefsels ondergaan veranderingen in hun geometrie, zoals veranderingen in de cel-cel-oppervlakte en hoogte, en waar cellen ondergaan mitose en migreren. Bovendien kan epitheliale cellen ook reguleren morfogenetische bewegingen in de aangrenzende weefsels

Protocol

Voordat u begint

  1. Synthetiseren afgedekt mRNA van gelineariseerde DNA template dat codeert voor het eiwit fluorescent gelabelde en te zuiveren mRNA door standaard werkwijzen (AmpliCap transcriptie kit; Epicentre Biotechnologie, Madison WI). mRNA hoeveelheden verdeeld moet worden voor een enkele keer gebruik in 0,2 ml centrifugebuis en opgeslagen bij -80 ° C.
  2. Standaardmethoden om eieren te verkrijgen, in-vitrofertilisatie, en verwijdering van het ei vacht zijn eerder twee beschreven. Een procedure om eieren te verkrijgen van een vrouwelijke kikker Xenopus laevis is aangetoond eerder 3. Onmiddellijk bevruchten eieren in vitro na hen van vrouwelijke kikkers met behulp van testes vroeger geïsoleerd van een mannelijke kikker. De-jelly eieren 20 minuten na de bevruchting en het injecteren mRNA, eiwit, DNA of dextran onmiddellijk om voldoende verspreiding van gemicroinjecteerd reagentia mogelijk te maken. Injecties meer dan 1 uur na de bevruchting vaak niet te diffunderen vanuit de injectieplaats.
  3. Eicel micro-injectie is eerder 4 aangetoond met behulp van een druk-ventiel gecontroleerd injector (PLI-100, Harvard Apparatus). Volgen een soortgelijke methode voor het injecteren van mRNA's in het dier halfrond van kikker embryo's bij de 1 - tot 4-cellig stadium. Overdracht bevruchte embryo's tot 3% Ficoll (Sigma, St. Louis MO) in 1x MBS (MBS-Ficoll) en microinject met het gewenste volume (2 tot 4 nl) van de afgetopte mRNA coderend voor GFP gericht op membraan (mem-GFP) of F -actine (MOE-GFP). Voor het verkrijgen van een gelijkmatige verdeling mRNA te injecteren 4 gelijke afstand van elkaar plaatsen in het dier paal. Embryo's kunnen blijven in MBS-Ficoll enkele uren, maar moet worden overgedragen aan 1 / 3 x MBS voor gastrulatie begint.

Benodigde materialen (items gemarkeerd met een * zijn weergegeven in figuur 1.):

  1. Dissectie stereomicroscoop met glasvezel-verlichting. Een gekoelde dissectie stadium is aanbevolen, maar is optioneel.
  2. Hair tools (haar mes en haar lus) *.
  3. Pincet (Dumont # 5 roestvrij staal; Fine Science Tools, Foster City, CA) *.
  4. Saline embryo gewijzigd Barth de cultuur van media (MBS, 88 mM NaCl, 2,4 mM NaHCO 3, 1 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,41 mM (CANO 3) 2, 0,82 mM MgSO 4, 10 mM HEPES (H3375, Sigma-Aldrich, St. Louis MO)).
  5. Danilchik's voor Amy explantatie cultuur media (DFA, 53 mM NaCl 2, 5 mM Na 2 CO 3, 4,5 mM Kalium gluconaat, 32 mM Natriumgluconaat, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4). Onder meer 0,1% Bovine serum albumine met DFA (BSA, A7906, Sigma-Aldrich). DFA moet steriel gefilterd, maar kan worden hoeveelheden verdeeld in 50 ml conische buizen en opgeslagen bij -20 ° C. Antibiotica en antimycotica (0,8% in media, A5955, Sigma-Aldrich) moet worden toegevoegd aan vers ontdooide DFA om bacteriële-of schimmelgroei te remmen.
  6. 60 of 100 mm petrischalen *.
  7. Grote cover glas, 45 bij 50 mm (12-544-F, # 1.5, Fisher Scientific, Hampton, NH) *.
  8. Kleine deksel glas, 24 bij 40 mm (12-544C, # 1,5; Fisher Scientific).
  9. Siliconenvet (High Vacuum, Dow Chemical) geladen in een injectiespuit 'breeuwen-gun "*.
  10. Aangepaste acryl kamers of nylon ringen (Small Parts Inc, Miramar, FL) *. Aangepaste kamers kunnen worden gefreesd in een Machine Shop van een 25 bij 50 bij 5 mm acryl blok aan een binnenste kamer, dat is 1,2 cm bij 2,8 cm te bieden. Deze kamer heeft een werkvolume van 1,68 ml. Optioneel nylon ringen kunnen worden geselecteerd in een verscheidenheid van grootte, geven we de voorkeur schaal die compatibel is met 18 mm diameter ronde dekglaasjes.
  11. Diamond potlood *.

Deel 1: Excisie van dierlijke cap explanten

  1. Cultuur's naar de gewenste fase 5 in 1 / 3 x MBS. De snelheid van ontwikkeling kan worden gecontroleerd met cultuur temperaturen tussen 15 en 21 ° C, zodat de experimenten kunnen worden gedaan op een geschikte tijd van de dag. Kamertemperatuur kan worden gebruikt, maar embryo's zal sneller ontwikkelen.
  2. Transfer embryo's DFA.
  3. Verwijder de vitelline membranen met behulp van een tang.
  4. Onder het ontleden stereomicroscoop, accijnzen een dier cap explantatie met behulp van haar-messen en haar-loops 6. Gebruik het haar-loop te ondersteunen of het embryo te houden op een plaats en het haar-mes om een ​​kleine incisie in het dier pool van de embryo's te maken. Gebruik herhaalde "flick-cuts" met de haren mes om een ​​360 ° incisie te maken om het dier dop ectoderm te verwijderen uit het embryo. Met de praktijk, kan men vlot bezuinigingen die resulteren in een minimale schade aan de explantatie of gelyseerde cellen in de marge (Fig. 2A).
  5. Herhaal stap 4 om accijnzen 3-4 dier cap explantaten en ga verder met deel 2. Men moet snel zijn tijdens het snijden explantaten, omdat ze de neiging hebben om bal te snel. Een gekoelde dissectie stadium kan vertragen het proces of als alternatief kun je minder explantaten.

Deel 2: Bereid kamers, belasting explantaten, en sluit de kamer voor de lange termijn de cultuur

  1. Gebruiksiliconenvet te lijmen of te verzegelen de acryl-kamer naar de grote dekglas.
  2. Om de hechting van explanten te reduceren tot het glas vacht het glas in de kamer met een niet-klevende ondergrond door het incuberen van de kamer voor 2 tot 4 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C met 1% BSA in 1 / 3 x MBS (BSA -MBS).
  3. Bereid kleine dekglaasje fragmenten (ongeveer 2 bij 8 mm) met behulp van een diamant potlood. Pre-coat fragmenten met BSA-MBS.
  4. Spoel BSA-MBS uit de kamer en vervang de media met DFA.
  5. Accijnzen dier cap explantatie (s) (Deel 1;. Afb. 2A) en transfer naar de kamer. Positie van elk explant met behulp van een haar-loop (met epitheellaag met uitzicht op de bodem van de kamer) en voorzichtig de explantatie vast te stellen in plaats met een glazen dekglaasje fragment bij kleine scharren van een hoog vacuüm vet (Fig. 2B). Wees zeer voorzichtig terwijl u op de dekglaasje, omdat te hoge druk kan gemakkelijk breken de explantatie. Meerdere explanten kan worden geladen in elke kamer op basis van de grootte van de kleine dekglaasje fragmenten gebruikt om de explantaten zijn plaats te houden. Met de praktijk tot 20 explanten kan worden geladen in de acryl kamer hier beschreven. Vul de kamers met DFA totdat zelfs met de opening aan de bovenkant. Gebruik siliconenvet naar de top van de kamer afdichting met de 24 met 40 mm dekglas. Toevoegen of verwijderen van DFA aan luchtbellen te verminderen in de verzegelde kamer en blot overloop uit de kamer.
  6. Deze afgesloten kamer zal op lange termijn de cultuur en live-imaging van dierlijke cap explanten door de grote, lagere glazen oppervlak van de kamer. Het is cruciaal om het onderste glazen oppervlak van de kamer vrij van vuil, vet, of media te houden voor later beeldvorming. Wij raden voorbereiding papieren handdoek bodem petrischalen op kamers te slaan als ze bereid zijn voor de beeldvorming.

Deel 3: Hoge-resolutie live-imaging confocale microscopie

Het protocol in deze sectie is speciaal ontwikkeld om een ​​confocale microscoop ter beschikking van onze lab (Leica TCS SP5, Leica Microsystems, Bannockburn IL) te gebruiken. Verschillende confocale microscopen kan verlangen lichte wijziging en we raden gebruikers volgen hun respectieve gebruiksaanwijzing.

  1. Power-up van de imaging-systeem, de microscoop podium te initialiseren, en zet lasers geschikt is voor fluoroforen, dat wil zeggen de Argon laser voor fluoresceïne of EGFP en 543 HeNe laser voor rhodamine of RFP.
  2. Plaats de tweekamerbehuizing de explantaten op de microscoop podium. Voorafgaand aan de positionering van de kamer een geschikte objectieve zet op zijn plaats. Wij raden u aan een hoge numerieke apertuur 20x lucht doelstelling (0.7 na) voor de eerste beeldvorming, wij raden using1.4 na 40x of 63x olie doelstellingen voor hoge resolutie imaging en het bijhouden van grote cel-velden. (Let op: Zodra immersie olie wordt toegepast om het doel te gebruiken voorzichtig bij het gebruik van een lucht-objectieve zodat je niet per ongeluk de doelstelling dip in de olie.) Gebruik kleine gewichten om de kamer plaats te houden.
  3. Gebruik bright-field of fluorescentie verlichting en de scherpstelling totdat u de apicale uiteinden van de oppervlakkige cellen. Wees voorzichtig om geen "crash" de doelstelling in de kamer basis. Voorkomen dat inclusief of het produceren van luchtbellen bij gebruik van de olie-immersie doelstellingen. Zodra de monsters worden gepositioneerd met behulp van de "grove" positionering-modus, ga naar de "fijne" positionering mode.
  4. Aanbevelingen voor het afstemmen van de confocale voor live beeldvorming:
    1. Laser vermogen moet zo laag mogelijk: 1) om te voorkomen dat bleken, 2) tot fototoxische effecten en 3) te voorkomen dat iedere onopzettelijke activering van de cel vorm veranderen 7 te voorkomen. Laser-benodigd vermogen varieert afhankelijk van de expressie niveau en type van de moleculaire verslaggevers, uitgedrukt in de embryo's.
    2. Gebruik een scan formaat van 1024 x 1024 pixels voor live beeldvorming omdat het zorgt voor een goede beeldresolutie. Als u zeer hoge framerate (minimum is 1,3 s voor ons systeem), gebruik dan scan formaat van 512 bij 512 pixels. Dit zal de beeldresolutie, maar kan nog steeds voldoende zijn om een ​​redelijke hoeveelheid informatie te halen.
    3. Pas het spectrale bereik van de emissie, dichroïsche, en excitatie filters naargelang het geval.
    4. Stel de confocale pinhole tussen 1 en 1,5 Airy-eenheden.
    5. Fotomultiplicator te krijgen moet worden bewaard bij een minimum aan geluid te verminderen nog voldoende signaal naar celstructuren en eiwit lokalisatie te identificeren.
    6. Pas het zwartniveau te compenseren op de achtergrond aan te passen aan de kwaliteit van de beelden te verbeteren.
    7. Stappen (1) tot (6) worden iteratief toegepast op de productie van de beste beeldkwaliteit mogelijk. Kwaliteit beelden moeten het oplossen van de structuur of gelokaliseerde eiwitten met pixel intensiteiten over een breed dynamisch bereik. Als kwantitatieve analyses zijn het doel er moet minimaal het aantal nul-intensiteit of verzadigd pixels.
    8. Stappen (1), (3), (5), en (6) moeten worden herhaald voor elke extra fluorescentie kanaal naar de beste beeldkwaliteit voor mogelijk te produceren.
    9. Wanneer imaging twee of fluorescerende probes is het belangrijk ervoor te zorgen dat er minimale spectrale doorbloeding van het ene eiwit om de emissie van een tweede eiwit spectra. Bleed-through kunnen worden getest door het verminderen van het laservermogen spannend de eerste eiwit en het observeren van het signaal geproduceerd in de golflengten die door het tweede eiwit. Spectral doorbloeding kan worden verminderd met een meer restrictieve keuze van filters of door vermindering van het laservermogen wordt gebruikt voor excitatie en het verhogen van de winst wordt gebruikt voor de detectie van de eerste eiwit.
  5. Met de confocale afgestemd met behulp van deze richtlijnen moet het mogelijk zijn om enkele beelden vast te leggen op een enkele scherptediepte in XY-modus (Fig. 3A).
  6. Indien men geïnteresseerd is in het verzamelen van time-lapse filmpjes van een dynamisch proces, zoals voorkomende vorm veranderen tijdens de celdeling contractie 7, moet men kiezen uit de volgende alternatieve confocale modes:
    1. XYT: Deze modus maakt het mogelijk om een ​​reeks beelden te verzamelen in de tijd, zonder de Z-plane. Wij gebruiken deze stand om de endogene schommelingen in de epitheliale cellen te observeren. Normaal gesproken hebben we elke 5 seconden een aan te schaffen frame over 20 minuten om de endogene variatie of vorm verandert veroorzaakt door externe stimulatie van epitheelcellen observeren. Keuze van frame-rate is volledig afhankelijk van wat men is geïnteresseerd in het observeren en hoe dynamisch het proces is.
    2. XYZ: Met behulp van deze modus, kunnen we een Z-serie stack te verzamelen door middel van epitheelcellen. Onze standaard instellingen voor Z-serie te verzamelen zijn 0,1 micrometer stappen over een bereik van 5 micrometer. Wij gebruiken deze modus om te bepalen of cytoskeletale veranderingen plaatsvinden alleen op een bepaalde posities, zoals op het niveau van de adherens kruispunten, overal of in de cel cortex.
    3. XZT (Fig. 3A '): Deze modus is vooral gebruikt om de snelle veranderingen in de apicale-basale organisatie van de cel in het epitheel te observeren. Deze modus is geliefd om zijn nut in bevestigt dat de XYT modus is een betrouwbare verslaggever van de veranderingen in de apicale cel domein en dat de confocale beeldacquisitie is niet drijven langs de Z-as.
    4. XYZT: Dit combineert XYZ en XYT modes. Deze modus kan een rijke details over de volledige apicale-basale dynamiek van het epitheel, maar is langzaam volledig beeld stacks te verwerven en kan ernstig verminderen levensvatbaarheid van de cellen als gevolg van fotobleken en fototoxische effecten.
  7. De beeldkwaliteit kan worden verbeterd in beperkte mate met behulp van een of een combinatie van de volgende vier benaderingen: 1) lijn gemiddeld, 2) lijn accumulatie, 3) frame gemiddeld, en 4) kader accumulatie. Deze gemiddelde modi voor het imago van acquisitie kan verbeteren de beeldkwaliteit, maar zal levensvatbaarheid van de cellen te verminderen en meer tijd nodig om beelden te verzamelen.
  8. Met alle instellingen zorgvuldig worden bijgesteld, verzamelen en afbeeldingen opslaan, Z-serie, en de tijd-serie data naar een externe harde schijf, USB-geheugenstick of netwerk aangesloten server.
  9. Zodra u uw experiment voltooid is, hoe lager de doelstelling voor de veiligheid, het reinigen van de olie uit het doel en de microscoop podium met lens papier, en power-down de confocale systeem.

Deel 4: Live-beeldvorming van F-actine microfilamenten

Zoals is opgenomen in deel 3, het membraan lokaliseren eiwit GFP-leden kan worden gebruikt om fluorescent label celmembranen. Live-beeldvorming van sub-cellulaire componenten wordt bereikt door met behulp van andere eiwitten. Een eiwit, zoals Moesin-GFP, dat een F-actine-bindende domein bevat, kan worden gebruikt voor het F-actine label in levende cellen. Vergelijkbare strategieën voor live-cell imaging en het verzamelen van time-lapse sequenties de procedures vermeld in deel 3. Live-imaging F-actine is meer microscopie vaardigheden dan imaging mem-GFP, omdat de structuren zijn fijner en strakker gelokaliseerd dan het membraan. Zo kan elke kleine belletjes in de immersie olie te produceren aberratie artefacten zoals wazig of variabele helderheid in het vastgelegde beeld. Bovendien kan elke kleine drift in het brandpunt of Z-plane oorzaak Moesin-GFP corticale label F-actine te verhuizen out-of-focus. Dus moet men opnieuw dubbele inspanningen om het podium, de Explantatie, en de kamer te stabiliseren, terwijl beeldvorming corticale F-actine en andere sub-cellulaire eiwitten. XY en XZT beelden die Moesin-GFP gelabelde F-actine worden getoond als voorbeelden (Fig. 3B en B ').

Deel 5: Image Analysis

Foto's en time-lapse sequenties die zijn verkregen uit de live-cell confocale sessie kan worden geanalyseerd om hypothesen met betrekking tot de vorm van wijzigingen of patronen van eiwit lokalisatie te testen. Het blote oog is vaak de beste tool voor kwalitatieve analyse, maar kan worden aangevuld of geautomatiseerd door beeldanalyse technieken om kwantitatieve gegevens te extraheren. Beeldgegevens van Leica confocale systemen kunnen worden opgeslagen in een open formaat, zoals. TIF-geformatteerde image-bestanden of een eigen. LIF formaat dat gedetailleerde informatie over de microscoop conditie tijdens de overname behoudt. Beide. TIF-en. LIF-bestanden kunnen direct worden geïmporteerd door een vrij beschikbare beeldanalyse-programma Image J (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Verenigde Staten, http://rsb.info.nih.gov/ij /, 1997-2009) gebruik van de Bio-formaten plug-in (Kevin Eliceiri, LOCI, Universiteit van Wisconsin, Madison, WI). In de volgende paragraaf bieden we twee voorbeelden om te illustreren hoe gebruikers kunnen kwantitatieve analyse van de confocale beeldgegevens te beginnen.

  1. Open een. TIF-of. LIF-bestand (Fig.4 A en A ') met behulp van Bestand> Openen
  2. Voorbeeld 1: Meet de cel oppervlakte van een epitheliale cel (Fig. 4B naar B''').
    1. Kies Gebied in ANALYZE> SET metingen zijn verricht.
    2. Selecteer polygoon-selectie tool van de Image J werkbalk en een overzicht van de cel.
    3. Open ROI Manager van ANALYZE> TOOLS> ROI MANAGER en het overzicht om het toe te voegen door te drukken op [control-t], dat is de snelkoppeling voor het toevoegen van een nieuwe "regio van belang" of ROI aan de ROI Manager. Het is belangrijk om deze selectie toe te voegen en op te slaan ROI-set, omdat je terug kunt gaan op een later tijdstip en maak een andere parameter metingen. Sets van de opgeslagen ROI (klik op "SAVE"), later herladen kan worden voor verdere analyse.
    4. Men kan herhalen stap (c) met een aantal cellen in een afbeelding en voeg de ROI om de ROI te Manager. Zodra een geregistreerde voldoende ROI heeft, Klik op "METEN" in ROI Manager. In het resultatenvenster, kan men nu de GEBIEDEN tegen de ROI. Afbeelding afmetingen hebben overeenkomstige waarden in de meting parameters.
  3. Voorbeeld 2: Meet de intensiteit van een celmembraan (Fig. 4C naar C''').
    1. Selecteer "Rechte lijn" tool van de Image J werkbalk en teken een lijn op het beeld dat loodrecht staat op de celmembraan van rente en kruist het membraan. Deze rechte lijn selectie is een ander type van ROI en kunnen te kunnen toevoegen aan ROI Manager als hierboven.
    2. Plot relatieve intensiteiten in willekeurige eenheden door ANALYSE> PLOT PROFIEL. Bewaar deze als afbeelding en als lijst van waarden door te klikken op SAVE en LIST> Bestand> Opslaan als, respectievelijk op het PLOT venster.
  4. Verschillende kwantitatieve metingen kunnen worden gemaakt met behulp van Image J, afhankelijk van de onderzoekers de belangen en welke hypothesen worden getest. Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Seattle, WA) of Sigma Plot (systat Software Inc, San Jose, CA) kan worden gebruikt om grafisch plotgegevens. Extra voorbeelden in beeldanalyse zijn eerder 7 gepresenteerd.

Figuur 1
Figuur 1. Benodigde materialen. A) Hulpmiddelen die nodig zijn voor de microchirurgie en de montage van de cultuur kamer. Petrischaal (een), grote dekglas (b), haar tools (c), diamant potlood (d), tang (e), siliconenvet "kitpistool" (f), nylon ring (g), en aangepaste acryl cultuur kamer (h). B) Close-up van het haar mes, en C) haar lus.

Figuur 2
Figuur 2. Excisie van dierlijke cap explantaten. A) Schematische voorstelling van microchirurgische manipulatie gebruikt om een ​​dier cap explantatie (d-, rug te verwijderen; v, ventrale, ah, dier halfrond; vh, plantaardige halfrond). B) Schematische voorstelling van explantatie (e) zich onder een dekglaasje fragment op zijn plaats gehouden door siliconen vet (en) met de apicale oppervlak apposed aan de BSA gecoat glas (g). De Explantatie is geplaatst, zodat de epitheellaag is het dichtst bij de microscoop doelstelling (m). C) Dierlijke cap explantatie (rode pijl) is gekweekt in DFA en gehuisvest in de acryl kamer (blauwe pijl) op een grote glazen dekglaasje (zwarte pijl) en zijn plaats gehouden door glazen dekglaasje fragment en siliconenvet.

Figuur 3
Figuur 3. Epitheelcellen geobserveerd met behulp van confocale microscoop. A) Een XY bekijken en een XZ (A ') visie van membraan lokaliseren GFP (mem-GFP) gelabeld epitheliale sheet. B) Een XY bekijken en XZ te bekijken (B ') van een Moesin-GFP gelabelde F-actine apicale cel cortex.

Figuur 4
Figuur 4. Image analyse met behulp van Image J. A) Original beeld van een membraan localiseren GFP-gelabelde cel vel. Een hoge resolutie te bekijken (A ') van de box inzet in (A) toont twee "regio-of-interest' of ROI. De gele-outline geeft de grens van een enkele cel geselecteerd met het gereedschap Veelhoek (zie kader B) en de groene lijn geeft het pad van een intensiteit profiel vertoont in een cel-cel grens geselecteerd met behulp van rechte lijn gereedschap (zie panel C). B ') Methode om de meting opties te selecteren en kies "Area" (B''). Zodra de ROI is geselecteerd kan worden opgeslagen in de ROI Manager (B'''). C ') De methode om de meting opties voor het profiel te selecteren nam. C'') Zodra de rechte lijn of gesegmenteerde lijn-tool wordt gekozen voor de intensiteit profiel langs het pad kan worden uitgezet met de "Plot profiel" commando. Een lijst van intensheid waarden kunnen ook worden opgeslagen in een spreadsheet leesbare vorm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben gepresenteerd experimentele protocollen regelmatig gebruikt in ons lab om de afbeelding dynamisch veranderende cytoskelet in de apicale cel cortex en oscillerende celmembranen van epitheelcellen in Xenopus embryo's. Men moet gebruiken deze protocollen als uitgangspunt voor live-imaging van epitheliale cellen vormen, optimalisatie van dit protocol is essentieel en een deel van de instellingen veranderen, afhankelijk van het type microscoop systeem een ​​heeft en de aard van de eiwitten die men geïnteresseerd is in de beeldvorming . Samen, het protocol stappen (explantatie isolatie, beeldvorming en visualisatie van de cellulaire en sub-cellulaire componenten, en kwantificatie methodologie) zorgen voor een uitgebreide procedure aan epitheliale morfogenese bestuderen.

Kritische aspecten te onthouden

  1. Het is belangrijk om kwalitatief hoogwaardige mRNA voor te bereiden op micro-injectie in embryo's. mRNA buizen zijn opgeslagen op ijs om degradatie te voorkomen. Een keer getest, worden de buizen opgeslagen in -80 ° C in kleinere porties om meerdere vries-dooi cycli te voorkomen.
  2. Het is essentieel om mRNA te injecteren in meerdere locaties een gelijkmatige verdeling van mRNA te verzekeren over een groot gebied van de cellen in het dier dop ectoderm.
  3. Toevoeging van antibiotica / antimycotische is essentieel voor de lange termijn de cultuur te ontmoedigen bacteriën en schimmelgroei.
  4. Zorg moet worden genomen terwijl u explantaten onder het dekglaasje fragmenten, omdat meer-dan-vereiste druk kan breken de explantaten.
  5. Terwijl de beeldvorming, optimale instellingen zijn essentieel voor maximale data te verzamelen met de best mogelijke beeldkwaliteit die endogene cel gedrag en eiwit dynamiek weerspiegelt. Het kiezen van optimale instellingen wordt geleverd met de praktijk en ervaring.
  6. Voor het analyseren van beelden die we raden ImageJ. ImageJ is een uitstekende open-source programma dat kan worden gedownload en aangepast met de toevoeging van op maat geschreven of gedownload macro's en plug-ins.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health (R01-HD044750), een carrière subsidie ​​van de National Science Foundation, en ondersteuning van de American Heart Association (Begin Grant-in-Aid). De auteurs danken Davidson Lab leden: HY Kim, M. von Dassow en J. Zhou (voor hulp met dagelijkse verantwoordelijkheden lab), en Lin Zhang voor haar hulp in de moleculaire biologie en synthetiseren van mRNA. Wij erkennen experimentele inspanningen van alle de kikker labo's (met name Ray Keller en Doug DeSimone's), die hebben bijgedragen aan een deel van dit protocol, door het ontwikkelen en testen van verschillende methoden door de jaren heen. Wij danken Richard Harland en John Wallingford voor hun vriendelijke gaven van mem-GFP en Moesin-GFP plasmiden respectievelijk.

References

  1. Ninomiya, H., Winklbauer, R. Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension. Nat Cell Biol. 10 (1), 61-61 (2008).
  2. Kay, B. K., Peng, H. B. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1991).
  3. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  4. Cohen, S., Au, S., Pante, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. , (2009).
  5. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Tables of Xenopus laevis (Daudin). , Elsevier North-Holland Biomedical Press. Amsterdam. (1967).
  6. Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53 (3), 163-163 (2002).
  7. Joshi, S. D., Dassow, M. von, Davidson, L. A. Experimental control of excitable embryonic tissues: three stimuli induce rapid epithelial contraction. Exp Cell Res. 316 (1), 103-103 (2010).

Tags

Developmental Biology epitheelcellen kikkers Xenopus laevis epitheel meercellige hoge-resolutie confocale microscopie dier cap explantatie embryo's
Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in<em> Xenopus laevis</em
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Joshi, S. D., Davidson, L. A.More

Joshi, S. D., Davidson, L. A. Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1949, doi:10.3791/1949 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter