Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis Published: May 23, 2010 doi: 10.3791/1949

DOI

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Sagar D. Joshi¹, Lance A. Davidson^1,2

¹Bioengineering, University of Pittsburgh, ²Developmental Biology, University of Pittsburgh

Summary

Xenopus embryonalen Epithelien sind ein ideales Modellsystem, um die Zelle Verhaltensweisen wie Polarität Entwicklung und Formänderung beim epithelialen Morphogenese zu studieren. Traditionelle Histologie des festen Proben wird zunehmend durch Live-Cell-konfokale Bildgebung ergänzt. Hier zeigen wir Methoden, um Frosch Gewebe zu isolieren und zu visualisieren leben Epithelzellen und deren Zytoskelett mit Live-cell konfokalen Mikroskopie.

Abstract

Embryonale Epithelzellen dienen als ideales Modell, um Morphogenese Studie, in der multi-Zellgewebe Veränderungen in ihrer Geometrie, wie Veränderungen in der Zelle Oberfläche und Zellenhöhe unterziehen, und wo Zellen durchlaufen Mitose und Migration. Darüber hinaus können Epithelzellen regulieren auch morphogenetischen Bewegungen in benachbarte Gewebe

Protocol

Bevor Sie beginnen

1. Synthesize capped mRNA von linearisierten DNA-Template-Kodierung der fluoreszenzmarkierten Protein und reinigen mRNA durch Standardverfahren (AmpliCap Transcription Kit, Epicentre Biotechnologies, Madison WI). mRNA sollte einziges Mal Gebrauch in 0,2 ml Röhrchen aliquotiert und bei -80 ° C.
2. Standard-Methoden, um Eier zu erhalten, in-vitro-Fertilisation, und die Entfernung des Eimantel wurden bisher ² beschrieben. Ein Verfahren, um Eier aus einer Xenopus laevis weiblichen Frosch zu erhalten hat sich gezeigt, früher ^3. Düngen Eier in vitro unmittelbar nach deren Gewinnung von weiblichen Frösche mit Hoden zuvor isoliert von einem männlichen Frosch. De-Gelee Eier 20 Minuten nach der Befruchtung und injizieren mRNA, Protein-, DNA oder Dextran sofort, damit eine ausreichende Diffusion von mikroinjiziert Reagenzien. Injektionen mehr als 1 Stunde nach der Befruchtung oft nicht von der Injektionsstelle diffundieren.
3. Oocyte Mikroinjektion wurde bisher ⁴ mit einem Druck-Ventil-Injektor (PLI-100, Harvard Apparatus) nachgewiesen. Befolgen Sie eine ähnliche Methode zur Injektion von mRNAs in das Tier Hemisphäre Froschembryonen an der 1 - bis 4-Zellen-Stadium. Transfer befruchteten Embryonen auf 3% Ficoll (Sigma, St. Louis MO) in 1x MBS (MBS-Ficoll) und microinject mit dem gewünschten Volumen (2 bis 4 nl) der begrenzten mRNA GFP gezielt auf die Membran (mem-GFP) oder F -Aktin (moe-GFP). Um eine gleichmäßige Verteilung injizieren mRNA bei 4 gleichmäßig verteilt Standorten in den animalen Pol. Embryonen können in MBS-Ficoll für mehrere Stunden bleiben, müssen aber auf 1 / 3 x MBS vor der Gastrulation beginnt übertragen werden.

Benötigte Materialien (Artikel * gekennzeichneten Felder sind in Abb. 1 dargestellt.)

1. Dissection Stereomikroskop mit Glasfaser-Beleuchtung. Eine gekühlte Dissektion der Bühne wird empfohlen, aber optional.
2. Haar-Tools (Haar Messer und Haar Schleife) *.
3. Pinzetten (Dumont Nr. 5 Edelstahl; Fein Science Tools, Foster City, CA) *.
4. Geändert Barths Saline Embryo Kulturmedien (MBS, 88 mM NaCl, 2,4 mM NaHCO _3, 1 mM KCl, 0,33 mM CaCl _2, 0,41 mM (CaNO _{3) 2,} 0,82 mM MgSO _4, 10 mM HEPES (H3375, Sigma-Aldrich, St. Louis MO)).
5. Danilchik ist für Amy Explantation Kulturmedien (DFA, 53 mM NaCl _2, 5 mM Na ₂ CO _3, 4,5 mM Kalium Gluconat, 32 mM Natriumgluconat, 1mM CaCl _2, 1 mM MgSO _4). Include 0,1% Rinderserumalbumin mit DFA (BSA; A7906, Sigma-Aldrich). DFA müssen steril gefiltert, kann aber in 50 ml konische Röhrchen aliquotiert und bei -20 ° C. Antibiotika und Antimykotika (0,8% in den Medien; A5955, Sigma-Aldrich) sollten frisch aufgetauten DFA hinzugefügt werden, um Bakterien oder Pilzen hemmen.
6. 60 oder 100 mm Petrischalen *.
7. Große Deckglas, 45 von 50 mm (12 bis 544-F, # 1,5; Fisher Scientific, Hampton, NH) *.
8. Kleine Deckglas, 24 x 40 mm (12-544C, # 1,5; Fisher Scientific).
9. Silikonfett (High Vacuum, Dow Chemical) in eine Spritze "Abdichten-gun" geladen *.
10. Benutzerdefinierte Acryl Kammern oder Nylon-Unterlegscheiben (Small Parts Inc.; Miramar, FL) *. Benutzerdefinierte Kammern können in einer Dreherei aus einem 25 werden um 50 gefräst um 5 mm Acryl-Block zu einer inneren Kammer, die 1,2 cm um 2,8 cm bereitzustellen. Diese Kammer hat ein Arbeitsvolumen von 1,68 ml. Optional Nylonscheiben kann in einer Vielzahl von Größen gewählt werden, wir bevorzugen Größen mit 18 mm Durchmesser runde Deckgläschen.
11. Diamant Bleistift *.

Teil 1: Exzision von tierischen Kappe Explantate

1. Kultur Embryonen, um die gewünschte Stufe ⁵ in 1 / 3 x MBS. Die Geschwindigkeit der Entwicklung kann mit der Kultur Temperaturen zwischen 15 und 21 ° C, so dass die Experimente zu einem geeigneten Zeitpunkt des Tages getan werden kann, gesteuert werden. Raumtemperaturen können verwendet werden, aber die Embryonen schneller entwickeln.
2. -Embryonen zu DFA.
3. Entfernen vitelline Membranen mit einer Pinzette.
4. Unter dem Stereomikroskop seziert, Verbrauchssteuern ein Tier Kappe Explantat mit Haar-Messer und Haar-Schlaufen ^6. Verwenden Sie das Haar-Schleife zu unterstützen oder halten Sie die Embryos bei einer Position und das Haar-Messer einen kleinen Einschnitt in den animalen Pol des Embryos zu machen. Verwenden Sie wiederholt "Flick-Schnitte" mit dem Haar-Messer, um eine 360 ​​°-Schnitt machen, um das Tier Kappe Ektoderm aus dem Embryo zu entfernen. Mit etwas Übung kann man machen, glatte Schnitte, die sich in minimalen Schäden an dem Explantat oder lysierten Zellen am Rand (Abb. 2A).
5. Wiederholen Sie Schritt 4 bis Verbrauchsteuern 3 bis 4 Tieren Kappe Explantate und fahren Sie mit Teil 2. Man muss schnell sein beim Schneiden Explantate, da sie eine Tendenz zur Kugel schnell haben. Eine gekühlte Dissektion Stufe kann langsam den Prozess oder alternativ können Sie weniger Explantate zu machen.

Teil 2: Bereiten Kammern, Last Explantate und Abdichtung der Kammer für die langfristige Kultur

1. VerwendungSilikonfett zu kleben oder Siegel der Acryl-Kammer zu den großen Deckglas.
2. Um die Haftung der Explantate auf das Glas Mantel reduzieren das Glas in der Kammer mit einem nicht klebenden Substrat durch Inkubation der Kammer für 2 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C mit 1% BSA in 1 / 3 x MBS (BSA -MBS).
3. Bereiten Sie kleine Deckglas Fragmente (ca. 2 von 8 mm) mit einem Diamant-Bleistift. Pre-coat-Fragmente mit BSA-MBS.
4. Spülen BSA-MBS aus der Kammer und ersetzen Sie die Medien mit DFA.
5. Excise Tier Kappe Explantation (n) (Teil 1;. Abb. 2A) und den Transfer in die Kammer. Position jedes Explantat mit einem Haar-Schleife (mit Epithelschicht mit Blick auf den Boden der Kammer) und schonend fixieren dem Explantat in Ort mit einem Deckglas-Fragment durch kleine Tupfer Hochvakuumfett (Abb. 2B) statt. Seien Sie sehr vorsichtig, während Sie das Deckglas seit übermäßigen Druck leicht zerbrechen kann das Explantat. Mehrere Explantate können in jeder Kammer von der Größe der kleinen Deckglas Fragmente verwendet werden, um die Explantate in Position zu halten Basis geladen werden. Mit etwas Übung bis zu 20 Explantaten in die Acryl-Kammer hier beschriebenen geladen werden. Füllen Sie die Kammern mit DFA, bis auch die Öffnung an der Spitze. Verwenden Sie Silikonfett an die Spitze der Kammer mit dem 24-Dichtung von 40 mm Deckglas. Hinzufügen oder Entfernen von DFA, um Luft-Blasen in der verschlossenen Kammer und blot Überlauf aus der Kammer zu reduzieren.
6. Das abgedichtete Kammer wird langfristig Kultur und Live-imaging tierischen Kappe Explantate durch die großen, unteren Glasoberfläche der Kammer zu ermöglichen. Es ist entscheidend, um die untere Glasfläche der Kammer frei von Schmutz, Fett, oder Medien für die spätere Bildgebung zu halten. Wir empfehlen Herstellung von Papier-Handtuch Talsohle Petrischalen mit den Kammern speichern, wie sie für die Bildgebung vorbereitet sind.

Teil 3: Hochauflösende Live-imaging konfokale Mikroskopie

Das Protokoll in diesem Abschnitt wurde entwickelt, um einem konfokalen Mikroskop zur Verfügung, um unserem Labor (Leica TCS SP5; Leica Microsystems, Bannockburn IL) zu verwenden. Verschiedene konfokalen Mikroskopen unter Umständen geringfügig verändert und wir empfehlen Benutzern folgen ihren jeweiligen Betriebsanleitung.

1. Schalten Sie den Imaging-System, initialisieren Sie die Mikroskoptisch, und schalten Sie Lasern geeignet für Fluorophore, dh der Argon-Laser für Fluorescein oder EGFP und 543 HeNe-Laser für Rhodamin oder RFP.
2. Legen Sie die Zweikammergehäuse die Explantate auf dem Mikroskoptisch. Vor der Positionierung der Kammer zu bewegen ein geeignetes Ziel einrastet. Wir empfehlen die Verwendung einer hohen numerischen Apertur 20x Luft Ziel (0,7 na) für die erste Bildgebung, wir empfehlen using1.4 na 40x oder 63x Öl Ziele für hochauflösende Bildgebung und-verfolgung großen Zell-Felder. (Anmerkung: Sobald Immersionsöl ist, um das Ziel mit Vorsicht angewendet werden, wenn mit einem Luft-Ziel, so dass Sie nicht versehentlich dip dem Ziel in das Öl.) Verwenden Sie kleine Gewichte an die Kammer in Position zu halten.
3. Verwenden Sie Hellfeld-oder Fluoreszenz-Beleuchtung und stellen Sie den Fokus, bis Sie die apikalen Enden der oberflächlichen Zellen zu sehen. Achten Sie darauf, "Crash" das Ziel, in die Kammer Basis. Vermeiden Sie mit oder die Herstellung von Luftblasen bei der Verwendung der Ölimmersionsobjektive. Sobald die Proben positioniert sind, mit der "groben" Positionier-Modus, um die "fine" Positionier-Modus zu ändern.
4. Empfehlungen für die Optimierung der konfokalen für Live-Imaging:
   1. Laserleistung sollte so gering wie möglich gehalten werden: 1) zu verhindern, Bleichen, 2) auf phototoxische Effekte und 3) zu verhindern, um einen versehentlichen Auslösung der Zellform ändern ^{7 zu} verhindern. Laser-Power-Anforderung variiert abhängig von der Expression und der Art der molekularen Reporter in die Embryonen zum Ausdruck gebracht.
   2. Verwenden Sie ein Scan-Format von 1024 x 1024 Pixel für Live-Bildgebung, da es gute Bildauflösung bietet. Wenn Sie sehr hohe Bildrate (Minimum 1,3 s für unser System) benötigen, dann verwenden Sie Scan-Format von 512 x 512 Pixel. Dadurch verringert sich die Bildauflösung, kann aber immer noch ausreichen, um angemessene Menge an Informationen zu extrahieren.
   3. Passen Sie den Spektralbereich der Emission, dichroitische und Anregungsfilter als angemessen.
   4. Passen Sie die konfokale Blende zwischen 1 und 1,5 Airy-Einheiten.
   5. Photomultiplier gewinnen muss auf einem minimalen Niveau gehalten werden, um Lärm zu reduzieren noch genügend Signal an Zellstrukturen und Proteinlokalisierung identifizieren.
   6. Stellen Sie den Schwarzwert-Offset, um den Hintergrund anpassen, um die Qualität der Bilder zu verbessern.
   7. Schritte (1) bis (6) werden iterativ angewendet zu produzieren die beste Bildqualität möglich. Bildqualität sollten lösen die Struktur oder lokalisierte Proteine ​​mit Pixel-Intensitäten über einen breiten dynamischen Bereich. Wenn quantitative Analysen das Ziel sind, sollte eine minimale Zahl von Null-Intensität oder gesättigten Pixel betragen.
   8. Schritte (1), (3), (5) und (6) müssen für jedes zusätzliche Fluoreszenz-Kanal wiederholt werden, um die beste Bildqualität für möglich zu produzieren.
   9. Bei der Abbildung zwei oder fluoreszierenden Sonden ist es wichtig, sicherzustellen, dass es minimale spektrale Durchschlagen von einem Protein zu einem zweiten Proteins Emissionsspektren. Bleed-Through kann durch die Reduzierung der Laserleistung spannend das erste Protein und beobachtet das Signal in den Wellenlängen von der zweiten Protein verwendet, geprüft werden. Spectral Durchschlagen kann mit restriktiver Wahl von Filtern oder durch eine Verringerung der Laserleistung zur Anregung verwendet und erhöht die Verstärkung für den Nachweis des ersten Proteins verringert werden.
5. Mit der konfokalen abgestimmt mit diesen Richtlinien sollte es möglich sein, einzelne Bilder zu einem einzigen Schärfentiefe im XY-Betrieb (Abb. 3A) zu erfassen.
6. Wenn man beim Sammeln Zeitraffer-Filme von einem dynamisch auftretenden Prozess wie Formänderung beim Zelle Kontraktion ⁷ interessiert ist, muss man aus der folgenden alternativen konfokalen Modi wählen:
   1. XYT: Dieser Modus erlaubt es, eine Serie von Bildern im Laufe der Zeit sammeln, ohne Änderung der Z-Ebene. Wir verwenden diesen Modus, um die endogene Schwankungen in den Epithelzellen zu beobachten. Normalerweise, so erwerben wir ein Bild alle 5 Sekunden über 20 Minuten, um endogene Variation oder Formveränderungen durch externe Stimulation von Epithelzellen induziert beobachten. Wahl der Framerate ist völlig davon abhängig, was man bei der Beobachtung und wie dynamisch der Prozess interessiert.
   2. XYZ: In diesem Modus können wir eine einzige Z-Serie Stack durch Epithelzellen sammeln. Unsere Standard-Einstellungen, um Z-Serie sammeln 0,1 &mgr; Schritten über einen Bereich von 5 um. Wir verwenden diesen Modus, um festzustellen, ob Zytoskelett-Änderungen sind nur in einem bestimmten Positionen, wie zum Beispiel auf der Ebene der adherens Kreuzungen auftretenden, oder überall in der Zelle Kortex.
   3. Xzt (Abb. 3A): Dieser Modus ist vor allem zur raschen Veränderungen in der apikal-basalen Organisation der Zelle in das Epithel zu beobachten. Dieser Modus ist für seine Nützlichkeit beliebt in der Bestätigung, dass die XYT Modus ein zuverlässiger Reporter von Änderungen in der apikalen Zell-Domain und die konfokale Bildaufnahme nicht driftet entlang der Z-Achse ist.
   4. Xyzt: Dies kombiniert XYZ und XYT Modi. Dieser Modus kann bieten eine reichhaltige Informationen über die volle apical-basalen Dynamik des Epithels, ist aber langsam auf volle Bildstapeln erwerben und stark reduzieren können die Lebensfähigkeit der Zellen aufgrund von Ausbleichen und phototoxische Effekte.
7. 1) Linie Mittelung, 2) Linie Akkumulation, 3) Frame-Averaging und 4) Rahmen Akkumulation: Die Bildqualität kann in begrenztem Umfang durch eine oder eine Kombination aus den folgenden vier Ansätze verbessert werden. Diese Mittelung Modi für die Bildaufnahme können die Bildqualität verbessern, sondern wird die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren und mehr Zeit in Anspruch, um Bilder zu sammeln.
8. Mit allen Einstellungen sorgfältig eingestellt, sammeln und speichern Bilder, Z-Serie, und von Zeitreihen-Daten auf eine externe Festplatte, USB-Memory-Stick, oder Network-Attached-Server.
9. Sobald Sie haben Ihr Experiment abgeschlossen ist, geringer ist die Zielsetzung für Sicherheit, Reinigung des Öls aus dem Ziel und dem Mikroskoptisch mit Objektiv Papier und Power-Down der konfokalen System.

Teil 4: Live-Darstellung von F-Aktin-Mikrofilamente

Wie in Teil 3 gezeigt wurde, die Membran lokalisiert Protein mem-GFP kann verwendet werden, um Fluoreszenz-Label Zellmembranen werden. Live-Darstellung von sub-zellulären Komponenten ist durch die Verwendung anderer Proteine ​​erreicht. Ein Protein, wie Moesin-GFP, dass ein F-Aktin-bindende Domäne enthält, kann verwendet werden, um F-Aktin in lebenden Zellen zu markieren. Ähnliche Strategien für Live-Cell-Imaging und Sammlung von Zeitraffer-Sequenzen folgen Sie den Anweisungen in Teil 3 beschrieben. Live-Imaging-F-Aktin ist mehr Mikroskopie Fähigkeiten als Imaging-mem-GFP, da die Strukturen sind feiner und dicht lokalisiert als die Membran. Zum Beispiel kann eine kleine Bläschen im Immersionsöl produzieren Aberration Artefakte wie Unschärfe oder variable Helligkeit in das aufgenommene Bild. Darüber hinaus kann jeder kleinen Drift in den Mittelpunkt oder Z-Ebene führen Moesin-GFP-markierten kortikalen F-Aktin zu bewegen out-of-focus. So sollte man re-Doppel-Bemühungen auf die Bühne, das Explantat und der Kammer zu stabilisieren, während Bildgebung kortikaler F-Aktin und andere sub-zellulären Proteinen. XY und xzt Bilder zeigen Moesin-GFP-markierten F-Aktin sind als Beispiele (Abb. 3B und B ') gezeigt.

Teil 5: Image Analysis

Bilder und Zeitraffer-Sequenzen aus dem Live-Zelle konfokalen Session erhalten kann analysiert werden, um Hypothesen über die Form ändert oder Muster von Protein-Lokalisierung zu testen. Die mit bloßem Auge ist oft das beste Tool für die qualitative Analyse kann aber erweitert oder automatisiert werden durch Bildanalyse Techniken, um quantitative Daten zu extrahieren. Bilddaten von Leica konfokale Systeme können in ein offenes Format wie. TIF formatiert Bilddateien oder ein proprietäres. LIF-Format, das detaillierte Informationen über das Mikroskop Zustand während der Akquisition behält gespeichert werden. Sowohl als auch. TIF und. LIF-Dateien können direkt von einem frei verfügbaren Bildanalyse-Programm Image J (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij importiert werden /, 1997-2009) mit dem Bio-Formate Plug-in (Kevin Eliceiri, LOCI, University of Wisconsin, Madison, WI). Im folgenden Abschnitt bieten wir Ihnen zwei Beispiele zu illustrieren, wie Anwender könnten quantitative Analyse der konfokalen Bilddaten beginnen.

1. Öffnen Sie eine beliebige. TIF oder. LIF-Datei (Abb. 4 A und A ') mit Datei> Öffnen
2. Beispiel 1: Messen Sie die Zellfläche einer Epithelzelle (Abb. 4B B''').
   1. Wählen Bereich in ANALYZE> SET MESSUNGEN.
   2. Wählen Sie Polygon-Werkzeug aus dem Bild J-Symbolleiste, und stellen Sie die Zelle.
   3. Öffnen ROI Manager von ANALYZE> Extras> ROI MANAGER und fügen Sie den Überblick, um es durch Drücken von [Strg-T], welche ist die Abkürzung für das Hinzufügen einer neuen "region of interest" oder ROI auf die ROI-Manager. Es ist wichtig, diese Auswahl zu erweitern und speichern ROI-setzen, da Sie wieder gehen können zu einem späteren Zeitpunkt und zu einem anderen Parameter-Messungen. Setzt der gespeicherten ROIs (klicken Sie auf "SAVE") können später zur weiteren Analyse geladen werden.
   4. Man kann Schritt (c) mit einer beliebigen Anzahl von Zellen in einem Bild zu wiederholen und fügen Sie die ROIs zur ROI-Manager. Sobald eine ausreichende ROIs aufgezeichnet wurde, klicken Sie auf "MEASURE" in ROI Manager. Im Fenster Ergebnisse kann man nun die Flächen vor der ROIs. Bild Dimensionen haben die entsprechenden Werte in der Mess-Parameter.
3. Beispiel 2: Messung der Intensität einer Zellmembran (Abb. 4C C''').
   1. Wählen Sie "Straight Line"-Tool aus dem Bild J-Symbolleiste, und ziehen Sie eine Linie auf das Bild, die senkrecht zur Zellmembran von Interesse und überquert die Membran. Diese Gerade Auswahl ist eine andere Art von ROI und kann auf ROI-Manager werden hinzugefügt wie oben.
   2. Plot relativen Intensitäten in willkürlichen Einheiten von ANALYZE> PLOT PROFILE. Speichern Sie diese als Bild und als Liste der Werte, indem Sie SAVE und LIST> Datei> Speichern unter bzw. auf dem PLOT-Fenster.
4. Verschiedene quantitative Messungen können mit Image J in Abhängigkeit von den Forschern die Interessen und welche Hypothesen werden derzeit getestet werden. Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Seattle, WA) oder Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA) verwendet, um Daten grafisch Handlung werden. Weitere Beispiele in der Bildanalyse wurden bisher ⁷ dargestellt.

Abbildung 1. Benötigte Materialien. A) Werkzeuge für die Mikrochirurgie und die Montage der Kultur Kammer benötigt. Petrischale (a), große Deckglas (b), Haar-Tools (c), Diamant-Bleistift (d), Pinzette (e), Silikonfett "Kartuschenpistole" (f), Nylon Unterlegscheibe (g) und benutzerdefinierte Acryl Kultur Kammer (h). B) Close-up der Haare Messer, und C) Haar-Schleife.

Abbildung 2. Excision tierischen Kappe Explantate. A) Schematische Darstellung der mikrochirurgischen Manipulation verwendet werden, um ein Tier Kappe Explantation (d, dorsal zu entfernen; v, ventral; ah, Tier Hemisphäre; vh, pflanzliche Hemisphäre). B) Schematische Darstellung der Explantation (e) unter einem Deckglas-Fragment an Stelle von Silikonfett (s) statt mit der apikalen Oberfläche apposed der BSA beschichteten Glas (g) positioniert. Das Explantat wird so positioniert, die Epithelschicht der Mikroskop-Objektiv (m) am nächsten liegt. C) Animal Kappe Explantation (roter Pfeil) ist in DFA kultiviert und beherbergte in den Acryl-Kammer (blauer Pfeil) auf einem großen Deckglas (schwarzer Pfeil) und in Position gehalten durch Deckglas-Fragment und Silikonfett.

Abbildung 3. Epithelzellen beobachtet mit Hilfe der konfokalen Mikroskop. A) Ein XY-Ansicht und eine XZ (A ') Angesichts der Membran lokalisiert GFP (mem-GFP) epithelialen Blatt gekennzeichnet. B) Ein XY-Ansicht und XZ-Ansicht (B ') eines Moesin-GFP-markierten F-Aktin Apikalzelle Kortex.

Abbildung 4. Bildanalyse mit Hilfe von Image J. A) Original-Bild von einer Membran lokalisiert GFP-markierten Zelle Blatt. Ein hoher Auflösung betrachten (A ') der Box Einschub in (A) zeigt zwei "Regionen-of-interest" oder ROIs. Die gelb-outline gibt an der Grenze eine einzelne Zelle ausgewählt mit dem Polygon-Werkzeug (siehe Abbildung B) und die grüne Linie zeigt den Weg von einer Intensität Profil über einen Zell-Zell-Grenze gewählt mit Geraden-Tool (siehe Abb. C). B ') Methode zur Messung Optionen und wählen Sie "Area" (B''). Nachdem die ROI ausgewählt ist, kann in der ROI-Manager (B'''). gespeichert werden C ') Die Methode der Messung Optionen für das Profil zu wählen hat. C'') Nach der Geraden oder segmentierte Tool gewählt wird die Intensität entlang der Pfad kann mit dem "Plot-Profil"-Befehl aufgezeichnet werden. Eine Liste der intensITY Werte können auch in ein Tabellenkalkulationsprogramm Form gespeichert werden.

Discussion

Wir haben experimentelle Protokolle regelmäßig in unserem Labor zu Bild dynamisch verändernden Zytoskeletts in der apikalen Zell-Kortex und oszillierenden Zellmembranen von Epithelzellen in Xenopus Embryonen verwendet präsentiert. Man sollte diese Protokolle als Ausgangspunkt für die Live-Darstellung von Epithelzellen Formen verwenden; Optimierung dieses Protokoll ist wichtig, und einige der Einstellungen ändern, abhängig von der Art des Mikroskop-System man hat und die Art der Proteine ​​ist man in der Bildgebung interessiert . Gemeinsam bieten das Protokoll Schritte (Explantation Isolation, Bildverarbeitung und Visualisierung von zellulären und sub-zellulären Komponenten und Quantifizierung Methodik) ein umfassendes Verfahren zur epithelialen Morphogenese zu studieren.

Kritische Aspekte zu erinnern,

1. Es ist wichtig, qualitativ hochwertige mRNA für die Mikro-Injektion in Embryonen vorzubereiten. mRNA Rohre werden auf Eis gelagert, um den Abbau zu vermeiden. Einmal getestet, werden die Rohre in -80 ° C in kleinere Portionen zu mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden.
2. Es ist wichtig, mRNA in mehrere Sites zu injizieren, um eine gleichmäßige Verteilung der mRNA über einen großen Bereich von Zellen in der Tier-cap Ektoderm zu versichern.
3. Die Zugabe von Antibiotikum / Antimykotikum ist für die langfristige Kultur unerlässlich, Bakterien-und Pilzwachstum zu verhindern.
4. Es muss darauf geachtet, während Sie Explantate unter dem Deckglas Fragmente seit mehr-als-erforderlichen Druck der Explantate zerschlagen werden kann.
5. Während Imaging, sind die optimalen Einstellungen notwendig, um eine maximale Daten mit der bestmöglichen Bildqualität, die zelleigene Verhaltensweisen und Protein Dynamik spiegelt sammeln. Die Wahl optimalen Einstellungen kommt mit der Praxis und Erfahrung.
6. Zur Analyse Bilder, die wir empfehlen ImageJ. ImageJ ist ein ausgezeichneter Open-Source-Tool, das heruntergeladen und kann geändert werden mit der Zugabe von speziell geschriebenen oder heruntergeladen werden Makros und Plug-Ins.