Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis Published: May 23, 2010 doi: 10.3791/1949

DOI

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Sagar D. Joshi¹, Lance A. Davidson^1,2

¹Bioengineering, University of Pittsburgh, ²Developmental Biology, University of Pittsburgh

Summary

Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.

Abstract

Embrionale cellule epiteliali servire come un modello ideale per studiare la morfogenesi in cui multicellulari tessuti subiscono cambiamenti nella loro geometria, quali i cambiamenti nella zona delle cellule di superficie e altezza della cella, e dove le cellule subiscono mitosi e migrano. Inoltre, le cellule epiteliali possono anche regolare i movimenti morfogenetici nei tessuti adiacenti

Protocol

Prima di iniziare

1. Sintetizzare mRNA ricoperto da un modello di DNA linearizzato codifica per la proteina fluorescente tag e purificare l'mRNA con metodi standard (kit di Trascrizione AmpliCap; Biotecnologie Epicentre, Madison WI). mRNA deve frazionare per l'utilizzo sola volta in provette ml 0,2 centrifuga e conservati a -80 ° C.
2. Metodi standard per ottenere le uova, la fecondazione in vitro, e la rimozione del pelo dell'uovo sono state descritte in precedenza ^2. Una procedura per ottenere le uova da una rana Xenopus laevis femminile è stato dimostrato in precedenza ^3. Fertilizzare gli ovuli in vitro subito dopo aver ottenuto da loro le rane femmine con testicoli in precedenza isolato da una rana maschio. De-gelatina uova 20 minuti dopo la fecondazione e iniettare mRNA, proteine, DNA, o destrano immediatamente per consentire la diffusione sufficienti di reagenti microiniettati. Iniezioni di più di 1 ora dopo la fecondazione spesso non riescono a diffondere dal sito di iniezione.
3. Microiniezione dell'ovocita è stato dimostrato in precedenza ⁴ usando una pressione valvole controllato iniettore (PLI-100, Harvard Apparatus). Seguire un metodo simile per l'iniezione di mRNA nell'emisfero animale di embrioni di rana in 1 - a 4-celle palco. Trasferimento embrioni fecondati al 3% Ficoll (Sigma, St. Louis MO) a 1x MBS (MBS-Ficoll) e microinject con il volume desiderato (2 a 4 nl) di GFP ricoperto codifica mRNA bersaglio di membrana (mem-GFP) o F -actina (Moe-GFP). Per ottenere una buona ripartizione iniettare mRNA in 4 siti equidistanti nel polo animale. Gli embrioni possono rimanere in MBS-Ficoll per diverse ore, ma devono essere trasferiti ad 1 / 3 x MBS prima dell'inizio della gastrulazione.

Materiali necessari (elementi contrassegnati con * sono mostrati in Fig. 1.)

1. Stereomicroscopio dissezione con illuminazione a fibre ottiche. Una fase dissezione raffreddamento è consigliata, ma facoltativa.
2. Strumenti di capelli (capelli coltello e loop capelli) *.
3. Pinza (Dumont # 5 in acciaio inox; Strumenti Scienza raffinata, Foster City, CA) *.
4. Modificato Barth Saline embrione terreni di coltura (MBS, 88 mm di NaCl, 2,4 mM NaHCO _3, 1 mM KCl, 0,33 mM CaCl _2, 0,41 mm (CANO _{3) 2,} 0,82 mM MgSO _4, 10 HEPES mM (H3375, Sigma-Aldrich, St. Louis MO)).
5. Danilchik per Amy espianto cultura dei media (DFA, 53 mM NaCl _2, 5 mM Na ₂ CO _3, 4,5 mM gluconato di potassio, 32 mM di sodio gluconato, 1MM CaCl _2, 1 mm di MgSO _4). Includono 0,1% di albumina sierica bovina con DFA (BSA, A7906, Sigma-Aldrich). DFAE deve essere sterile filtrata, ma può essere aliquotare 50 ml provette coniche e conservati a -20 ° C. Antibiotici e antimicotici (0,8% in media; A5955, Sigma-Aldrich) dovrebbe essere aggiunto appena scongelati DFA per inibire la crescita batterica o fungina.
6. 60 o 100 capsule di Petri mm *.
7. Copertura in vetro di grandi dimensioni, 45 per 50 mm (12-544-F, # 1.5, Fisher Scientific, Hampton, NH) *.
8. Copertura di vetro, 24 per 40 mm (12-544C, # 1,5; Fisher Scientific).
9. Grasso al silicone (alto vuoto, Dow Chemical), caricato con una siringa "calafataggio-gun" *.
10. Personalizzati camere acrilico o rondelle in nylon (parti piccole Inc.; Miramar, FL) *. Camere personalizzato può essere macinato in un negozio Macchina da a 25 da 50 di 5 millimetri blocco acrilico per fornire una camera interna che è di 1,2 cm x 2.8 cm. Questa camera ha un volume di lavoro di 1,68 ml. Rondelle in nylon opzionali possono essere selezionati in una varietà di formati, noi preferiamo dimensioni compatibili con 18 mm di diametro coprioggetto di vetro circolare.
11. Matita diamante *.

Parte 1: escissione di espianti cappello animale

1. Cultura embrioni allo stadio desiderato ⁵ in 1 / 3 x MBS. Il tasso di sviluppo può essere controllata con temperature cultura tra i 15 ei 21 ° C in modo che la sperimentazione può essere fatto al momento opportuno della giornata. Temperatura ambiente possono essere utilizzati gli embrioni, ma si sviluppano più rapidamente.
2. Trasferimento degli embrioni a DFA.
3. Rimuovere le membrane vitellino con pinze.
4. Sotto la dissezione stereomicroscopio, accise uno espianto tappo animali con pelo-coltelli e capelli-loops ^6. Utilizzare i capelli-loop per sostenere o mantenere l'embrione in una posizione e il capello-coltello per fare una piccola incisione nel polo animale degli embrioni. Uso ripetuto "flick-tagli" con i capelli-coltello per fare una incisione a 360 ° per rimuovere il tappo ectoderma animale dall'embrione. Con la pratica, si possono effettuare tagli lisci che si traducono in un danno minimo per l'espianto o cellule lisate al margine (Fig. 2A).
5. Ripetere il punto 4 ad accisa 3 a espianti animali 4 tappo e procedere alla parte 2. Bisogna essere veloci durante il taglio espianti, poiché hanno la tendenza a palla velocemente. Una fase dissezione raffreddato può rallentare il processo o, in alternativa è possibile effettuare un minor numero di espianti.

Parte 2: Preparare camere, gli espianti di carico, e sigillare la camera a lungo termine cultura

1. Usograsso al silicone per incollare o sigillare la camera di acrilico al vetro di copertura di grandi dimensioni.
2. Per ridurre l'adesione di espianti al cappotto di vetro il vetro all'interno della camera con un non-adesivo substrato incubando la camera da 2 a 4 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C con 1% BSA in 1 / 3 x MBS (BSA -MBS).
3. Preparare frammenti coprioggetto piccoli (circa 2 da 8 mm) utilizzando una matita diamante. Pre-coat frammenti con BSA-MBS.
4. Sciacquare BSA-MBS dalla camera e sostituire il supporto con il DFAE.
5. Accise animale tappo espianto (s) (Part 1;. Fig. 2A) e il trasferimento alla camera. La posizione di ogni espianto usando un capello ad anello (con strato epiteliale di fronte al fondo della camera) e delicatamente fissare l'espianto in posizione con un frammento di vetro coprioggetti detenuti da piccoli tocchi di grasso alto vuoto (Fig. 2B). State molto attenti quando si preme il coprioggetto in quanto una pressione eccessiva può facilmente distruggere l'espianto. Espianti multipli possono essere caricati in ciascuna camera in base alle dimensioni dei frammenti coprioggetto piccolo utilizzato per contenere il espianti in posizione. Con la pratica fino a 20 espianti possono essere caricati nella camera di acrilico qui descritto. Riempire le camere con DFAE fino anche con l'apertura in alto. Utilizzare grasso al silicone per sigillare la parte superiore della camera con i 24 per 40 mm di vetro di copertura. Aggiungere o rimuovere DFA per ridurre le bolle d'aria nella camera stagna e di overflow macchia dalla camera.
6. Questa camera stagna permetterà lungo termine cultura e live-imaging di espianti tappo animale attraverso la grande superficie di vetro inferiore della camera. È fondamentale mantenere la superficie di vetro inferiore della camera priva di sporco, grasso, o supporti per l'imaging più tardi. Si consiglia di preparare piatti di carta asciugamano fondo Petri per memorizzare le camere in quanto sono pronti per l'imaging.

Parte 3: alta risoluzione live-immagini di microscopia confocale

Il protocollo in questa sezione è stato sviluppato per utilizzare un microscopio confocale a disposizione il nostro laboratorio (Leica TCS SP5, Leica Microsystems, Bannockburn IL). Diversi microscopi confocale può richiedere leggera modifica e si consiglia agli utenti di seguire le loro istruzioni per l'uso rispettivi.

1. Accendere il sistema di imaging, inizializzare la fase microscopio, e attivare laser appropriato per fluorofori, ovvero il laser Argon per fluoresceina o EGFP e 543 HeNe laser per rodamina o RFP.
2. Posizionare la custodia ad una camera la espianti sul palco microscopio. Prima del posizionamento della camera di spostare un obiettivo appropriato in posizione. Si consiglia di utilizzare un elevato apertura numerica 20x obiettivo aria (0,7 na) per l'imaging iniziale; si consiglia using1.4 na obiettivi olio 40x o 63x per l'imaging ad alta risoluzione e tracciamento a grandi cellule-campi. (Nota: l'olio di immersione Una volta che è applicato alla cautela utilizzare obiettivo quando si usa un obiettivo d'aria in modo da non immergere inavvertitamente l'obiettivo con l'olio.) Usare piccoli pesi per tenere la camera in posizione.
3. Usa campo chiaro o fluorescenza illuminazione e la messa a fuoco fino a vedere le estremità apicale delle cellule superficiali. Fare attenzione a non "crash" l'obiettivo alla base della camera. Evitare di includere o la produzione di bolle d'aria durante l'utilizzo degli obiettivi di olio da immersione. Una volta che i campioni sono posizionati utilizzando la modalità "grossolano" posizionamento, passare alla modalità "fine" di posizionamento.
4. Raccomandazioni per la messa a punto confocale per l'imaging dal vivo:
   1. Potenza del laser deve essere mantenuto il più basso possibile: 1) evitare l'imbiancamento, 2) per prevenire gli effetti fototossiche, e 3) per evitare qualsiasi accidentale attivazione di cambiare la forma delle cellule ^7. Laser di potenza richiesta varia a seconda del livello di espressione e il tipo di giornalisti molecolare espresso negli embrioni.
   2. Utilizzare un formato di scansione di 1024 x 1024 pixel per immagini dal vivo in quanto fornisce una buona risoluzione dell'immagine. Se avete bisogno di frame rate molto alto (minimo è 1.3s per il nostro sistema), quindi utilizzare il formato di scansione di 512 x 512 pixel. Ciò consentirà di ridurre la risoluzione delle immagini, ma può ancora essere sufficiente per estrarre quantità ragionevole di informazioni.
   3. Regolate l'intervallo spettrale dell'emissione, dicroiche, eccitazione e filtri a seconda dei casi.
   4. Regolare il foro stenopeico confocale compreso tra 1 e 1,5 unità di Airy.
   5. Guadagno fotomoltiplicatore devono essere mantenuti ad un livello minimo per ridurre il rumore ancora fornire segnali sufficienti per identificare le strutture cellulari e la localizzazione delle proteine.
   6. Regolare il livello del nero di offset per regolare il fondo per migliorare la qualità delle immagini.
   7. Passi (1) a (6) sono applicati iterativamente per produrre la migliore qualità di immagine possibile. Immagini di qualità dovrebbe risolvere la struttura o le proteine ​​localizzate con intensità di pixel su una vasta gamma dinamica. Se le analisi quantitative sono l'obiettivo ci dovrebbe essere un numero minimo di zero intensità o pixel saturi.
   8. Passi (1), (3), (5), e (6) deve essere ripetuta per ogni ulteriore canale di fluorescenza per produrre la migliore qualità di immagine per possibili.
   9. Quando due immagini o sonde fluorescenti, è importante per garantire che non è minimo sanguinare-through spettrale da una proteina di spettri di emissione di una seconda proteina. Bleed-through può essere testata attraverso la riduzione della potenza del laser emozionante la prima proteina e osservando il segnale prodotto nelle lunghezze d'onda utilizzata dalla seconda proteina. Bleed-through spettrale può essere ridotta con maggiori possibilità di scelta restrittiva di filtri o riducendo la potenza del laser utilizzato per l'eccitazione e di aumentare il guadagno per il rilevamento della prima proteina.
5. Con il sintonizzati confocale utilizzando queste linee guida dovrebbe essere possibile catturare singole immagini ad una profondità focale singolo in modalità XY (Fig. 3A).
6. Se uno è interessato a raccogliere filmati time-lapse di un processo dinamico che si verificano come cambiano forma durante la contrazione delle cellule ^7, si deve scegliere tra le seguenti modalità alternative confocale:
   1. XYT: questa modalità permette di raccogliere una serie di immagini nel tempo, senza cambiare la Z-plane. Noi utilizziamo questa modalità per osservare le fluttuazioni endogene nelle cellule epiteliali. Normalmente, noi acquisiamo un fotogramma ogni 5 secondi più di 20 minuti per osservare variazioni endogene o cambia forma indotta dalla stimolazione esterna delle cellule epiteliali. Scelta di frame-rate è completamente dipendente da ciò che si è interessato a osservare e come dinamica del processo.
   2. XYZ: Usando questa modalità, si può raccogliere una sola serie Z pila attraverso le cellule epiteliali. Le nostre impostazioni predefinite per la raccolta della serie Z sono passi di 0,1 micron in un intervallo di 5 micron. Noi utilizziamo questa modalità per determinare se i cambiamenti del citoscheletro si verificano solo a un determinate posizioni, come ad esempio a livello delle giunzioni adherens, o ovunque nel corteccia cellulare.
   3. XZT (Fig. 3A '): Questa modalità è utilizzata principalmente per osservare i cambiamenti rapidi nel apicale-basale organizzazione di cellule a livello dell'epitelio. Questa modalità è molto popolare per la sua utilità nel confermare che la modalità XYT è un reporter affidabile di cambiamenti nel dominio apicale delle cellule e che l'acquisizione delle immagini confocale non vadano alla deriva lungo l'asse Z.
   4. XYZT: Questa modalità combina XYZ e XYT. Questa modalità in grado di fornire dettagli in tonalità sul pieno apicale-basale dell'epitelio dinamiche, ma è lento ad acquisire l'immagine full stack e può seriamente ridurre la vitalità cellulare grazie alla photobleaching ed effetti fototossico.
7. La qualità dell'immagine può essere migliorata in misura limitata, utilizzando uno o una combinazione dei quattro seguenti approcci: 1) una media di linea, 2) accumulo di linea, 3) media fotogrammi, e 4) accumulo di frame. Queste modalità media per l'acquisizione di immagini in grado di migliorare la qualità delle immagini, ma ridurre la vitalità cellulare e richiedono più tempo per raccogliere le immagini.
8. Con tutte le impostazioni accuratamente regolato, raccogliere e salvare le immagini, Z-serie e serie temporali di dati su un disco rigido esterno, server USB memory stick, o collegati in rete.
9. Una volta che siete aver completato l'esperimento, abbassare l'obiettivo per la sicurezza, pulito l'olio l'obiettivo e la fase di microscopio con carta per lenti e spegnimento del sistema confocale.

Parte 4: Live-imaging di F-actina microfilamenti

Come è stato dimostrato nella parte 3, la localizzazione delle proteine ​​di membrana mem-GFP può essere usato per etichettare fluorescente membrane cellulari. Live-imaging di sub-cellulare componenti è ottenuta utilizzando altre proteine. Una proteina come moesina-GFP che contiene un F-actina-dominio di legame può essere usato per etichettare F-actina in cellule vive. Strategie simili per i live-cell imaging e raccolta di time-lapse sequenze di seguire le procedure descritte nella parte 3. Live-immagini di F-actina coinvolge competenze microscopia più di immagini mem-GFP in quanto le strutture sono più fini e più strettamente localizzata rispetto alla membrana. Per esempio, tutte le bolle piccole nell'olio immersione può produrre artefatti aberrazione come sfocatura o la luminosità variabile nella immagine catturata. Inoltre, la sua deriva piccolo focale o Z-plane può causare moesina GFP-etichettata corticale F-actina di spostare fuori fuoco. Quindi, si dovrebbe essere ri-raddoppiare gli sforzi per stabilizzare il palco, l'espianto e la camera mentre l'imaging corticale F-actina e di altri sub-cellulare delle proteine. XY e immagini che mostrano XZT moesina GFP-etichettata F-actina sono mostrati come esempi (Fig. 3 B e B ').

Parte 5: Image Analysis

Immagini e time-lapse sequenze ottenute dal vivo di cellule sessione confocale possono essere analizzati al fine di verificare le ipotesi riguardanti i cambiamenti di forma o di modelli di localizzazione delle proteine. Occhio nudo è spesso il migliore strumento per l'analisi qualitativa, ma può essere aumentata o comunque automatizzati con tecniche di analisi d'immagine per estrarre i dati quantitativi. I dati delle immagini da Leica sistemi confocale può essere salvato in un formato aperto come. File immagine in formato TIF o un proprietario. LIF formato che mantiene le informazioni dettagliate sulle condizioni microscopio durante l'acquisizione. Entrambe le cose. TIF e. LIF file possono essere importati direttamente da un liberamente disponibile J analisi delle immagini immagine del programma (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij /, 1997-2009) con il Bio-formati plug-in (Kevin Eliceiri, LOCI, University of Wisconsin, Madison, WI). Nella sezione seguente offriamo due esempi per illustrare come gli utenti possano iniziare l'analisi quantitativa dei dati di immagine confocale.

1. Aprire qualsiasi file. TIF o. LIF (Fig. 4 A e A ') utilizzando File> Apri
2. Esempio 1: Misura l'area delle celle di una cellula epiteliale (Fig. 4B a B''').
   1. Scegli Campo in ANALYZE> MISURE SET.
   2. Seleziona poligono strumento di selezione dalla barra degli strumenti J Immagine, e delineare la cellula.
   3. Aprire Gestione del ROI da analisi> Strumenti> Gestione ROI e aggiungere il contorno ad esso premendo [controllo-t], che è la scorciatoia per l'aggiunta di qualsiasi "regione di interesse" nuovi o ROI al Manager ROI. E 'importante aggiungere questa selezione e salvare il ROI-set in quanto è possibile tornare indietro in un secondo momento e apportare eventuali misure di altro parametro. Imposta di ROI salvati (cliccare su "SAVE") può essere ricaricato in seguito per ulteriori analisi.
   4. Si può ripetere il punto (c) con qualsiasi numero di cellule in un'immagine e aggiungere il ROI al ROI Manager. Una volta che uno ha ROI sufficiente registrato, Clicca su "misura" ROI Manager. Nella finestra dei risultati, si possono ora vedere le AREE contro il ROI. Dimensioni dell'immagine sono valori corrispondenti a parametri di misurazione.
3. Esempio 2: Misurare l'intensità di una membrana cellulare (Fig. 4C a C''').
   1. Selezionare "Retta" strumento dalla barra degli strumenti J Immagine, e tracciare una linea sull'immagine che è perpendicolare alla membrana cellulare di interesse e attraversa la membrana. Questa selezione retta è un altro tipo di ROI e può essere aggiungere al ROI Manager come sopra.
   2. Plot intensità relative in unità arbitrarie da ANALYZE PLOT PROFILO>. Salva come immagine e come elenco di valori da SAVE clic e LIST> Archivio> Registra come rispettivamente sulla finestra PLOT.
4. Diverse misurazioni quantitative possono essere effettuate utilizzando J immagine a seconda degli interessi dei ricercatori 'e quali ipotesi sono in fase di test. Plot Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Seattle, WA) o Sigma (SYSTAT Software Inc., San Jose, CA) possono essere usati per tracciare i dati graficamente. Ulteriori esempi di analisi delle immagini sono stati presentati in precedenza ^7.

Figura 1. Materiali richiesti. A) Strumenti necessari per la microchirurgia e l'assemblaggio della camera di cultura. Scatola di Petri (a), slip cover di grandi dimensioni (b), strumenti di capelli (c), diamante matita (d), pinze (e), grasso al silicone "pistola per silicone" (f), la rondella in nylon (g), e la cultura in acrilico su misura camera (h). B) primo piano del coltello capelli, e C) ciclo dei capelli.

Figura 2. Escissione di espianti cap animali. A) Schema di manipolazione microchirurgica utilizzata per rimuovere un espianto tappo animale (d, dorsale, v, ventrale, ah, animali dell'emisfero; vh, vegetale emisfero). B) Schema di espianto (e) posizionato sotto un frammento coprioggetto tenuto da grasso al silicone (s) con la superficie apicale apposto al vetro rivestito BSA (g). L'espianto è posizionato in modo lo strato epiteliale è più vicino all'obiettivo microscopio (m). C) Animal tappo espianto (freccia rossa) è colto in DFA e ospitato nella camera di acrilico (freccia blu) su un coprioggetto di vetro di grandi dimensioni (freccia nera) e tenuto in posizione da frammenti di vetro coprioggetti e grasso al silicone.

Figura 3. Cellule epiteliali osservato con microscopio confocale. A) Un punto di vista XY e un (A ') vista XZ di membrana localizzazione GFP (mem-GFP) etichettati foglio epiteliale. B) Un punto di vista XY e XZ vista (B ') di un moesina GFP-etichettata F-actina corteccia apicale delle cellule.

Figura 4. Analisi delle immagini con Image J. A) Immagine originale di un foglio di localizzare membrana cellulare GFP etichettati. Una visione ad alta risoluzione (A ') della finestra di inserto in (A) mostra due "aree d'interesse" o ROI. Il giallo-outline indica il confine di una singola cella selezionata con lo strumento poligono (vedi pannello B) e la linea verde indica il percorso di un profilo di intensità in una cellula-cellula confine selezionato con lo strumento in linea retta (vedi pannello C). B ') per selezionare le opzioni di misura e scegliere "Area" (B''). Una volta che il ROI è selezionato può essere memorizzata in Gestione ROI (B'''). C ') Il metodo per selezionare le opzioni di misura per il profilo preso. C'') Una volta che la linea retta o strumento a riga di segmentato è scelto il profilo dell'intensità lungo il percorso può essere tracciata con il "profilo Plot" comando. Un elenco di Intenslità valori possono anche essere salvati in un formato leggibile foglio di calcolo.

Discussion

Abbiamo presentato protocolli sperimentali usati regolarmente nel nostro laboratorio di citoscheletro immagine che cambiano dinamicamente nella corteccia cellula apicale e oscillante membrane cellulari delle cellule epiteliali in embrioni di Xenopus. Si dovrebbe utilizzare questi protocolli come punto di partenza per il live-imaging delle forme delle cellule epiteliali, ottimizzazione di questo protocollo è essenziale e alcune delle impostazioni cambia a seconda del tipo di sistema microscopio si ha e il tipo di proteine ​​si è interessati nella diagnostica per immagini . Insieme, i passi protocollo (isolamento espianto, l'imaging e la visualizzazione di componenti cellulari e sub-cellulare, e la metodologia di quantificazione) fornisca una procedura completa per lo studio della morfogenesi epiteliale.

Aspetti critici da ricordare

1. E 'importante preparare alta qualità mRNA per la micro-iniezione in embrioni. tubi di mRNA vengono memorizzati sul ghiaccio per evitare il degrado. Una volta testato, i tubi sono conservati in -80 ° C in piccole aliquote per evitare più cicli gelo-disgelo.
2. E 'essenziale per iniettare mRNA in più siti per assicurare una distribuzione uniforme di mRNA in un grande campo di cellule nel ectoderma tappo animale.
3. L'aggiunta di antibiotico / antimicotico è essenziale per la cultura lungo termine per scoraggiare la crescita di batteri e funghi.
4. Si deve prestare attenzione mentre si tiene premuto espianti sotto i frammenti coprioggetto da più-che-richiesto pressione può rompere il espianti.
5. Mentre l'imaging, le impostazioni ottimali sono essenziali per raccogliere i dati con la massima qualità d'immagine migliore possibile, che riflette i comportamenti delle cellule endogene e dinamiche delle proteine. La scelta di impostazioni ottimali viene fornito con pratica ed esperienza.
6. Per analizzare le immagini si consiglia di ImageJ. ImageJ è un eccellente strumento open-source che può essere scaricato e modificato con l'aggiunta di macro personalizzate-scritto o scaricato e plug-in.