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Biology

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis Published: May 23, 2010 doi: 10.3791/1949

Summary

Xenopus embrionárias epitélios são um sistema modelo ideal para estudar os comportamentos das células, como o desenvolvimento de polaridade e mudar de forma durante a morfogênese epitelial. Histologia tradicional de amostras fixa é cada vez mais sendo complementado por live-célula de imagem confocal. Aqui nós demonstrar os métodos para isolar os tecidos de rã e visualizar ao vivo as células epiteliais e seus citoesqueleto usando live-célula microscopia confocal.

Abstract

Embrionárias células epiteliais servir como um modelo ideal para estudar a morfogênese em tecidos multicelulares sofrer alterações em sua geometria, tais como mudanças na área da superfície celular e altura da célula, e onde as células sofrem mitose e migram. Além disso, as células epiteliais também podem regular os movimentos morfogenéticos em tecidos adjacentes

Protocol

Antes de começar

  1. Sintetizar mRNA capped do modelo linearizado de DNA que codifica a proteína fluorescente etiquetado e mRNA purificar por métodos padrão (AmpliCap kit de transcrição; Biotecnologias Epicentro, Madison WI). mRNA devem ser aliquotado para utilização única vez em 0,2 ml tubos de centrifugação e armazenadas a -80 ° C.
  2. Métodos padronizados para obtenção dos ovos, fertilização in vitro, e remoção da camada de ovos foram descritos anteriormente 2. Um procedimento para obtenção dos ovos de Xenopus laevis um sapo fêmea tem sido demonstrado anteriormente 3. Fertilizar óvulos in vitro imediatamente após obtê-los de rãs fêmeas utilizando testes previamente isolados de uma rã macho. De-geléia ovos 20 minutos após a fertilização e injetar mRNA, proteínas, DNA, ou dextran imediatamente para permitir a difusão suficiente de reagentes microinjeção. Injeções de mais de 1 hora após a fertilização muitas vezes não conseguem difusa no local da injecção.
  3. Microinjeção oócito tem sido demonstrada previamente 4 utilizando uma pressão da válvula controlada injector (PLI-100, Harvard Apparatus). Seguir um método similar para injetar mRNAs no hemisfério animal de embriões da rã no 1 - para 4 células palco. Transferência de embriões fecundados para Ficoll 3% (Sigma, St. Louis MO) em 1x MBS (MBS-Ficoll) e microinject com o volume desejado (2-4 nl) de GFP capped mRNA codificação alvejado a membrana (mem-GFP) ou F -actina (moe-GFP). Para obter uma distribuição uniforme injetar mRNA em 4 locais igualmente espaçados no pólo animal. Embriões podem permanecer na MBS-Ficoll por várias horas, mas precisam ser transferidos para 1 / 3 x MBS antes do início da gastrulação.

Materiais necessários (itens marcados com * são mostrados na Figura 1.)

  1. Estereomicroscópio com dissecção de fibra ótica de iluminação. A fase de dissecção refrigeração é recomendada, mas opcional.
  2. Ferramentas de cabelo (faca de cabelo e laço de cabelo) *.
  3. Fórceps (Dumont # 5 em aço inoxidável; Ferramentas Ciência Fine, Foster City, CA) *.
  4. Modificado Barth media embrião Saline cultura (MBS, 88 mM NaCl, 2,4 mM NaHCO 3, 1 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,41 mM (Cano 3) 2, 0,82 mM MgSO 4, 10 HEPES mM (H3375, Sigma-Aldrich, St. Louis MO)).
  5. Danilchik para Amy explante cultura da mídia (DFA; 53 mM NaCl 2, 5 mM Na 2 CO 3, 4,5 mM gluconato de potássio, 32 mM gluconato de sódio, CaCl 2 1 mM, 1mM MgSO 4). Incluem 0,1% de soro albumina bovina com DFA (BSA; A7906, Sigma-Aldrich). DFA deve ser estéril, mas pode ser filtrada alíquota de 50 ml tubos cônicos e armazenadas a -20 ° C. Antibióticos e antimicóticos (0,8% nos meios de comunicação; A5955, Sigma-Aldrich) deve ser adicionado ao DFA recém-descongelado para inibir o crescimento de bactérias ou fungos.
  6. 60 ou 100 milímetros placas de Petri *.
  7. Tampa de vidro grande, 45 por 50 mm (12-544-F, # 1.5; Fisher Scientific, Hampton, NH) *.
  8. Tampa de vidro pequena, 24 por 40 mm (12-544C, # 1,5; Fisher Scientific).
  9. Silicone graxa (alto vácuo, a Dow Chemical) carregado em uma seringa "calafetagem-gun" *.
  10. Personalizado câmaras acrílico ou anilhas de nylon (Small Parts Inc., Miramar, FL) *. Câmaras personalizado pode ser moído em uma Oficina a partir de um 25 por 50 por 5 milímetros bloco de acrílico para fornecer uma câmara interna que é de 1,2 cm por 2,8 cm. Esta câmara tem um volume de trabalho de 1,68 ml. Arruelas de nylon opcional pode ser selecionado em uma variedade de tamanhos, nós preferimos dimensões compatíveis com 18 mm de diâmetro lamínulas de vidro circular.
  11. Lápis de diamante *.

Parte 1: Excisão de explantes cap animais

  1. Cultura de embriões ao estágio desejado 5 em MBS 1 / 3 x. A taxa de desenvolvimento pode ser controlada com temperaturas cultura entre 15 e 21 ° C para que os experimentos podem ser feitos em um momento conveniente do dia. Temperatura ambiente pode ser usado, mas os embriões se desenvolverão mais rapidamente.
  2. Transferência de embriões para DFA.
  3. Remover membranas vitelínico usando uma pinça.
  4. Sob a dissecar estereomicroscópio especiais de consumo, um explante cap animal usando facas e hair-cabelo-loops 6. Use o cabelo loop-para apoiar ou segurar o embrião em uma posição e os cabelos faca para fazer uma pequena incisão no pólo animal do embriões. Uso repetido "flick-cortes", com o cabelo faca para fazer uma incisão de 360 ​​° para remover a tampa de animais ectoderma do embrião. Com a prática, pode-se fazer cortes suaves que resultam em danos mínimos ao explante ou células lisadas na margem (Fig. 2A).
  5. Repita o passo 4 para extirpar 3-4 explantes cap animal e prosseguir para a Parte 2. É preciso ser rápido durante o corte explantes, uma vez que eles têm uma tendência a bola rapidamente. A fase de dissecção resfriado pode retardar o processo ou, alternativamente, você pode fazer explantes menos.

Parte 2: Prepare câmaras, explantes de carga, e selar a câmara para a cultura a longo prazo

  1. Usograxa de silicone para colar ou vedar a câmara de acrílico para a tampa de vidro de grandes dimensões.
  2. Para reduzir a aderência de explantes para o revestimento de vidro o vidro dentro da câmara com um substrato não-adesivo, incubando a câmara de 2 a 4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C com BSA 1% em 1 / 3 x MBS (BSA -MBS).
  3. Prepare fragmentos lamela pequena (cerca de 2 por 8 mm) usando um lápis de diamante. Pré-revestimento com fragmentos BSA-MBS.
  4. Enxágüe BSA-MBS da câmara e substituir a mídia com DFA.
  5. Consumo de animais cap explante (s) (Part 1;. Fig 2A) e transferência para a câmara. Posição de cada explante usando um fio de cabelo-loop (com camada epitelial de frente para o fundo da câmara) e gentilmente corrigir o explante no lugar com um fragmento de lamela de vidro detidos por pinceladas pequenas de graxa de alto vácuo (Fig. 2B). Tenha muito cuidado ao pressionar a lamela desde a pressão excessiva pode facilmente quebrar o explante. Explantes múltiplas podem ser carregados em cada câmara com base no tamanho dos fragmentos de lamela pequena usada para manter os explantes no lugar. Com a prática até 20 explantes podem ser carregados para dentro da câmara de acrílico aqui descritas. Preencher as câmaras com DFA até mesmo com a abertura no topo. Use graxa de silicone para selar o topo da câmara com os 24 por 40 tampa de vidro mm. Adicionar ou remover DFA para reduzir bolhas de ar na câmara selada e estouro blot da câmara.
  6. Esta câmara selada permitirá que a cultura a longo prazo e ao vivo de imagens de explantes cap animal através da grande superfície de vidro, mais baixa da câmara. É crucial para manter a superfície inferior da câmara de vidro livres de sujeira, graxa, ou a mídia para imagens mais tarde. Recomendamos preparar papel-toalha pratos fundo Petri para armazenar câmaras como eles estão preparados para a imagem latente.

Parte 3: alta resolução de imagens ao vivo de microscopia confocal

O protocolo nesta seção foi desenvolvida para uso de um microscópio confocal disponíveis para o nosso laboratório (Leica TCS SP5; Leica Microsystems, Bannockburn IL). Diferentes microscópios confocal pode exigir ligeira modificação e recomendamos os usuários seguem suas instruções respectivas.

  1. Power-up do sistema de imagem, inicializar o estágio do microscópio, e ligue lasers apropriados para fluoróforos, ou seja, o laser de argônio para fluoresceína ou EGFP e 543 laser HeNe para rodamina ou RFP.
  2. Coloque a caixa de uma câmara explantes para o palco microscópio. Antes de posicionar a câmara mover um objetivo apropriado para o lugar. Recomendamos usar uma alta abertura numérica objetivo 20x de ar (0,7 na) para geração de imagens inicial; recomendamos using1.4 nd objetivos óleo 40x ou 63x para imagens de alta resolução e monitoramento de grandes células-campos. (Nota: óleo de imersão Uma vez que é aplicada ao cuidado use objetivo ao utilizar um objetivo de ar para que você não inadvertidamente o objetivo mergulho no óleo.) Use pequenos pesos para manter a câmara no lugar.
  3. Use brilhante-campo ou de fluorescência iluminação e ajustar o foco até que você veja as extremidades apicais das células superficiais. Tenha cuidado para não "crash" o objectivo para a base da câmara. Evitar a inclusão ou a produção de bolhas de ar quando se utiliza os objetivos de imersão em óleo. Depois que as amostras são posicionados usando o modo de posicionamento "grosseiro", mude para o modo de posicionamento "fino".
  4. Recomendações para ajustar a imagem ao vivo confocal para:
    1. Potência do laser deve ser mantido o mais baixo possível: 1) para prevenir branqueamento, 2) para evitar efeitos fototóxicos, e 3) para evitar o seu accionamento acidental da mudança de células forma 7. Laser power-requisito varia dependendo do nível de expressão e do tipo de repórteres molecular expressa em embriões.
    2. Use um formato de digitalização de 1024 por 1024 pixels para imagens ao vivo, pois proporciona uma resolução de imagem boa. Se você precisa de taxa de quadros muito elevados (mínimo é de 1.3s para o nosso sistema), então usar o formato de digitalização de 512 por 512 pixels. Isto irá reduzir a resolução da imagem, mas ainda pode ser suficiente para extrair quantidade razoável de informações.
    3. Ajuste a faixa espectral da emissão, dicróicas e excitação filtros conforme o caso.
    4. Ajustar o pinhole confocal para entre 1 e 1,5 unidades de Airy.
    5. Ganhar fotomultiplicador devem ser mantidos a um nível mínimo para reduzir o ruído ainda fornecer sinal suficiente para identificar as estruturas celulares e localização de proteínas.
    6. Ajustar o nível de preto offset para ajustar o fundo para melhorar a qualidade das imagens.
    7. Etapas (1) a (6) são aplicados iterativamente para produzir a imagem de melhor qualidade possível. Imagens de qualidade deve resolver a estrutura de proteínas ou localizada, com intensidades de pixels em uma ampla faixa dinâmica. Se as análises quantitativas são o objetivo deve haver número mínimo de zero intensidade ou pixels saturados.
    8. Passos (1), (3), (5), e (6) precisa ser repetido para cada canal adicional de fluorescência para produzir a imagem de melhor qualidade para possíveis.
    9. Quando duas imagens ou sondas fluorescentes é importante para garantir que não é mínimo sangramento através do espectro de uma proteína para uma segunda proteína espectros de emissão. Sangrar-through pode ser testado, reduzindo a potência do laser emocionante a primeira proteína e observando o sinal produzido nos comprimentos de onda usados ​​pela segunda proteína. Sangramento através espectrais podem ser reduzidos com mais opções restritivas de filtros ou reduzindo a potência do laser usado para a excitação e aumentando o ganho utilizado para a detecção da proteína em primeiro lugar.
  5. Sintonizado com o confocal usando estas diretrizes, deve ser possível para capturar imagens únicas, a uma profundidade focal único em modo XY (Fig. 3A).
  6. Se alguém está interessado em colecionar filmes time-lapse de um processo que ocorre de forma dinâmica, como mudar de forma durante a contração das células 7, um tem que escolher entre os modos alternativos seguintes confocal:
    1. XYT: Este modo permite coletar uma série de imagens ao longo do tempo, sem alterar a Z-plano. Nós usamos esse modo de observar as flutuações endógenas nas células epiteliais. Normalmente, nós adquirimos um quadro a cada 5 segundos durante 20 minutos para observar a variação endógena ou muda de forma induzida por estimulação externa de células epiteliais. Escolha de frame-rate é completamente dependente do que se está interessado em observar e como o processo é dinâmico.
    2. XYZ: Usando este modo, podemos coletar uma pilha Z-série única através de células epiteliais. As nossas configurações padrão para coletar Z-série são passos de 0,1 mM em um intervalo de 5 mm. Usamos este modo para determinar se as mudanças do citoesqueleto estão ocorrendo somente em uma determinadas posições, como ao nível das junções aderentes, ou em qualquer parte do córtex celular.
    3. XZT (Fig. 3A): Este modo é usado principalmente para observar as mudanças rápidas na organização apical-basal da célula do epitélio. Este modo é popular por sua utilidade na confirmação de que o modo de XYT é um repórter confiável de mudanças no domínio célula apical e que a aquisição de imagem confocal não está à deriva ao longo do eixo Z.
    4. XYZT: Este combina modos XYZ e XYT. Este modo pode fornecer detalhes ricos sobre o total apical-basal dinâmica do epitélio, mas é lento para adquirir pilhas de imagens completo e pode reduzir drasticamente a viabilidade celular devido à fotodegradação e ação fototóxica.
  7. A qualidade da imagem pode ser melhorada de forma limitada usando um ou uma combinação dos quatro seguintes abordagens: 1) uma média de linha, 2) acumulação de linha, 3) média de frame, e 4) acumulação frame. Estes modos de média para a aquisição de imagens pode melhorar a qualidade de imagem, mas vai reduzir a viabilidade celular e requerem mais tempo para recolher imagens.
  8. Com todas as configurações cuidadosamente ajustada, recolher e guardar as imagens, Z-série, e de séries temporais de dados para um disco rígido externo, servidor de memória USB-stick, ou ligado à rede.
  9. Uma vez que você tiver concluído sua experiência, menor o objetivo para a segurança, limpar o óleo do objetivo e da fase microscópio com lente de papel, e poder-down o sistema confocal.

Parte 4: Live-imagem da F-actina microfilamentos

Como foi mostrado na Parte 3, a membrana localizar proteínas mem-GFP pode ser usado para fluorescente rótulo membranas celulares. Ao vivo imagens de sub-componentes celulares é conseguido através de outras proteínas. Uma proteína, tais como moesin-GFP que contém um domínio de F-actina de ligação pode ser usado para rotular F-actina em células vivas. Estratégias semelhantes para live-célula de imagem e coleção de lapso de tempo sequências de seguir os procedimentos descritos na parte 3. Live-imagem F-actina envolve habilidades mais do que imagens de microscopia mem-GFP, porque as estruturas são mais finas e mais bem localizada do que a membrana. Por exemplo, qualquer pequenas bolhas no óleo de imersão pode produzir artefatos de aberração, como desfoque ou brilho variável na imagem capturada. Além disso, qualquer movimento pequeno no focal ou Z-plano pode causar moesin-GFP rotulados cortical F-actina para sair de foco. Assim, deve-se redobrar os esforços para estabilizar o estágio, o explante, ea câmara, enquanto imagem cortical F-actina e outros sub-celular de proteínas. XY e XZT imagens mostrando moesin-GFP rotulados F-actina são mostrados como exemplos (Fig. 3B e B ').

Parte 5: Análise de Imagem

Imagens e time-lapse seqüências obtidas a partir da sessão ao vivo de células confocal pode ser analisado a fim de testar hipóteses sobre a forma muda ou padrões de localização de proteínas. A olho nu muitas vezes é a melhor ferramenta para a análise qualitativa, mas pode ser aumentada ou automatizado por meio de técnicas de análise de imagem para extrair dados quantitativos. Dados de imagem a partir de sistemas Leica confocal podem ser salvos em um formato aberto como. TIF arquivos de imagem formatado ou um proprietário. Formato LIF que retém informações detalhadas sobre a condição microscópio durante a aquisição. Ambos. TIF e arquivos. LIF podem ser importados diretamente por uma imagem J análise livremente disponível Imagem programa (Rasband, WS, ImageJ, EUA National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA, http://rsb.info.nih.gov/ij /, 1997-2009) usando os formatos de Bio-plug-in (Kevin Eliceiri, LOCI, University of Wisconsin, Madison, WI). Na seção seguinte, oferecemos dois exemplos para ilustrar como os usuários podem começar a análise quantitativa de dados de imagem confocal.

  1. Abra qualquer. TIF ou arquivo. LIF (Fig.4 A e A ') utilizando FILE> OPEN
  2. Exemplo 1: Medir a área de células de uma célula epitelial (Fig. 4B para B''').
    1. Selecione AREA em ANALYZE MEDIÇÕES> SET.
    2. Selecione polígono seleção de ferramenta da barra de ferramentas Image J, e esboço da célula.
    3. Gerente de ROI aberto das ANALYZE> Ferramentas> Gerenciador de ROI e adicione o contorno para que pressionando [controle-t], que é o atalho para a adição de qualquer "região de interesse" novo ou ROI para o Gerenciador de ROI. É importante adicionar essa seleção e salvar ROI-set, pois você pode voltar mais tarde e fazer as medições outro parâmetro. Conjuntos de ROIs salvo (clique em "SAVE") pode ser recarregado depois para análise posterior.
    4. Pode-se repetir o passo (c) com qualquer número de células em uma imagem e adicionar o ROIs de ROI Manager. Uma vez que se ROIs suficiente gravado, clique em "MEDIDA" em ROI Manager. Na janela de resultados, pode agora ver as áreas contra os ROIs. Dimensões da imagem têm valores correspondentes em parâmetros de medição.
  3. Exemplo 2: Medir a intensidade de uma membrana celular (Fig. 4C para C''').
    1. Selecione "Straight line" ferramenta da barra de ferramentas Image J, e desenhar uma linha na imagem que é perpendicular à membrana celular de interesse e atravessa a membrana. Esta seleção linha reta é um outro tipo de ROI e pode ser adicionar ao ROI Manager como acima.
    2. Plot intensidades relativas em unidades arbitrárias por analisar o perfil PLOT>. Salvar como imagem e como lista de valores clicando em Salvar e LISTA> FILE> SAVE AS, respectivamente, sobre a janela PLOT.
  4. Várias medições quantitativas podem ser feitas usando J Imagem dependendo dos interesses dos pesquisadores e que as hipóteses estão sendo testadas. Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Seattle, WA) ou Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA) pode ser usado para plotar os dados graficamente. Exemplos adicionais em análise de imagem têm sido apresentadas anteriormente 7.

Figura 1
Figura 1. Materiais necessários. A) Ferramentas necessárias para a microcirurgia e montagem da câmara de cultura. Placa de Petri (a), lamínula grandes (b), ferramentas de cabelo (c), diamante lápis (d), fórceps (e), graxa de silicone "pistola" (f), nylon arruela (g), e da cultura de acrílico personalizada câmara (h). B) Close-up da faca de cabelo, e C) loop de cabelo.

Figura 2
Figura 2. Excisão de explantes cap animal. A esquemática) de manipulação microcirúrgica usado para remover um explante cap animal (d, dorsal; v, ventral; ah, animal hemisfério; vh, vegetal hemisfério). B) Esquema do explante (e) posicionado sob um fragmento de lamínula mantido no lugar por graxa de silicone (s) com a superfície apical apposed ao vidro revestido BSA (g). O explante é posicionado de forma a camada epitelial é a mais próxima a objetiva do microscópio (m). C) Animal cap explante (seta vermelha) é cultivada em DFA e alojados em câmara acrílica (seta azul) em uma lamela de vidro de grandes dimensões (seta preta) e mantido no lugar por um vidro fragmento de lamela e graxa de silicone.

Figura 3
Figura 3. Células epiteliais observado usando microscópio confocal. A) Uma visão XY e XZ uma visão (A ') da membrana GFP localização (mem-GFP) marcada folha epiteliais. B) Uma visão XY e XZ view (B ') de um moesin-GFP rotulados F-actina córtex célula apical.

Figura 4
Figura 4. Análise de imagem usando o Image J. A) Imagem original de uma folha de localização GFP membrana celular rotulados. Uma visão em alta resolução (A ') da caixa de inserção de (A) mostra duas "regiões de interesse" ou ROIs. O contorno amarelo indica o limite de uma única célula selecionada usando a ferramenta polígono (veja o painel B) ea linha verde indica o caminho de um perfil de intensidade em um limite de célula-selecionado usando ferramenta de linha reta (veja o painel C). Método B ') para selecionar as opções de medição e escolha "Área" (B''). Uma vez que o ROI é selecionado pode ser armazenado no Gerenciador de ROI (B'''). C) O método para selecionar as opções de medição para o perfil tomou. C'') Uma vez que a linha reta ou ferramenta de linha segmentada é escolhido o perfil de intensidade ao longo do caminho podem ser plotados com o "Plot perfil" de comando. A lista dos intensdade valores também podem ser salvos em forma de planilha legível.

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Discussion

Nós apresentamos protocolos experimentais usados ​​regularmente em nosso laboratório para citoesqueleto imagem dinamicamente mudando no córtex celular apical e oscilantes membranas celulares das células epiteliais em embriões Xenopus. Deve-se usar estes protocolos como ponto de partida para geração de imagens ao vivo de formas de células epiteliais; otimização deste protocolo é essencial e algumas das configurações irá mudar, dependendo do tipo de sistema de microscópio tem uma e do tipo de proteínas é um interessado em imagens . Juntas, as etapas do protocolo (isolamento de explantes, imagem e visualização de componentes celulares e sub-celular, e da metodologia de quantificação) estabeleça um amplo estudo de morfogênese epitelial.

Aspectos críticos para lembrar

  1. É importante preparar alta qualidade mRNA para micro-injeção em embriões. tubos de mRNA são armazenados em gelo para evitar a degradação. Uma vez testados, os tubos são armazenados em -80 ° C em alíquotas menores para evitar múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento.
  2. É essencial para injetar mRNA em vários sites para assegurar a distribuição uniforme do mRNA ao longo de um grande campo de células do ectoderma cap animal.
  3. Adição de antibiótico / antimicótico é essencial para a cultura a longo prazo para desencorajar o crescimento de bactérias e fungos.
  4. Cuidados devem ser tomados enquanto pressiona explantes sob os fragmentos de lamínulas uma vez que mais do que o exigido pressão pode esmagar os explantes.
  5. Enquanto imagem, configurações ideais são essenciais para coletar dados com a máxima qualidade de imagem possível que reflete comportamentos endógena e dinâmica de proteínas. Escolhendo configurações ideais vem com a prática e experiência.
  6. Para analisar imagens recomendamos ImageJ. ImageJ é uma ferramenta open-source excelente que pode ser baixado e modificado com a adição de macros personalizadas escrito ou baixado e plug-ins.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por um dos Institutos Nacionais de Saúde (R01-HD044750), uma doação de CARREIRA do National Science Foundation e apoio da American Heart Association (Começando Grant-in-aid). Os autores agradecem membros Davidson Lab: HY Kim, M. e J. von Dassow Zhou (para ajudar com as responsabilidades do laboratório por dia), e Lin Zhang por sua assistência em biologia molecular e síntese de mRNA. Reconhecemos os esforços experimentais de todos os laboratórios de sapo (especialmente Ray Keller e Doug DeSimone), que têm contribuído para alguma parte deste protocolo, através do desenvolvimento e teste de vários métodos ao longo dos anos. Agradecemos a Richard Harland and John Wallingford para os presentes o seu tipo de mem-GFP e GFP moesin-plasmídeos, respectivamente.

References

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Joshi, S. D., Davidson, L. A.More

Joshi, S. D., Davidson, L. A. Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1949, doi:10.3791/1949 (2010).

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