Summary
Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.
Abstract
Embriyonik epitel hücreleri çok hücresel dokularda hücre yüzey alanı ve hücre yüksekliği değişiklikleri gibi kendi geometri değişiklikler, tabi burada morfolojilerinden okumak için ideal bir model olarak hizmet ve hücrelerin mitoz geçiren ve göç. Ayrıca, epitel hücreleri komşu dokulara morfogenetik hareketleri düzenleyen olabilir
Protocol
Başlamadan önce
- Standart yöntemler (Epicentre Biyoteknoloji, Madison, WI AmpliCap Transkripsiyon kiti), floresan tagged protein ve arındırır mRNA kodlama Lineerleştirilmiş DNA örneğinin kapaklı mRNA sentezlerler. mRNA tek seferlik kullanım için 0.2 ml santrifüj tüplerine aliquoted ve -80 ° C'de muhafaza edilmelidir
- Standart yöntemleri, in vitro fertilizasyon, yumurta elde etmek için yumurta kat kaldırılması ve daha önce 2 tarif edilmiştir . Xenopus laevis dişi kurbağanın yumurta elde etmek için bir prosedür daha önce 3 kanıtlanmıştır. In vitro yumurta, bir erkek kurbağanın daha önce izole testisler kullanarak dişi kurbağa alındıktan sonra hemen gübreleyin. De-jöle yumurta, 20 dakika sonrası döllenme ve mRNA, protein, DNA veya dekstran enjekte microinjected reaktifler yeterli difüzyon hemen izin verecek. Enjeksiyonlar 1 saatten fazla yazılan gübreleme genellikle enjeksiyon yerinde diffüz başarısız.
- Oosit mikroenjeksiyon bir basınç valf kontrollü enjektör (PLI-100, Harvard Apparatus) kullanarak daha önce 4 kanıtlanmıştır. 4-hücreli aşamaya - 1 kurbağa embriyoların hayvan yarımkürede mRNA'ların enjekte için benzer bir yöntem uygulayın. 1x MBS (MBS-Ficoll)% 3 Ficoll (Sigma, St Louis MO) döllenmiş embriyolar transfer ve membran (mem-GFP) veya F hedefleyen kapaklı mRNA kodlama GFP istenen hacmi (2 ila 4 nl) ile microinject -aktin (moe-GFP). Hayvan kutup 4 eşit aralıklı siteler bile dağıtım mRNA enjekte elde etmek için. Embriyolar MBS-Ficoll birkaç saat kalır, ancak 1 / 3 x MBS gastrulasyon başlamadan önce transfer edilmesi gerekir.
Gerekli malzemeler (* ile işaretlenmiş öğeler Şekil 1):
- Diseksiyon stereomikroskopta fiber optik aydınlatma. Soğutmalı bir diseksiyon sahne önerilir, ancak isteğe bağlıdır.
- Saç araçları (saç bıçak ve saç döngüsü) *.
- Forseps (Dumont # 5 paslanmaz çelik, Güzel Bilim Araçları, Foster City, CA) *.
- Modifiye Barth Kullanıcı Tuzlu embriyo kültür ortamı (MBS; 88 mM NaCl, 2.4 mM NaHCO 3, 1 mM KCl, 0.33 mM CaCl 2, 0.41 mM (Cano 3) 2, 0.82 mM MgSO 4, 10 mM HEPES (H3375, Sigma-Aldrich St Louis MO)).
- Danilchik Kullanıcı Amy eksplant kültür ortamı (DFA, 53 mM NaCl 2, 5 mM Na 2 CO 3, 4.5 mM Potasyum glukonat, 32 mM Sodyum glukonat, 1mm CaCl 2, 1mm MgSO 4). DFA (A7906, Sigma-Aldrich BSA) ile% 0.1 sığır serum albumin ekleyin. DFA süzülmüş steril olmalı, ancak 50 ml konik tüpler aliquoted ve -20 ° C'de saklanabilir Antibiyotikler ve antimiyotikler (% 0.8; medya A5955, Sigma-Aldrich), bakteri ve mantar üremesine engel taze çözülmüş DFA eklenmelidir.
- 60 veya 100 mm Petri kapları *.
- Büyük cam kapak 50 mm (12-544-F # 1.5; Fisher Scientific, Hampton, NH), 45 *.
- Küçük cam kapak, 40 mm ile 24 (12-544C, # 1.5 Fisher Scientific).
- Silikon gres (Yüksek Vakum, Dow Chemical) bir şırınga "doldurmayı-gun" yüklenen *.
- Özel akrilik odaları veya naylon pullar (Küçük Parça A.Ş., Miramar, FL) *. Özel odaları, 2.8 cm ile 1.2 cm bir iç oda sağlamak için 5 mm akrilik blok 50, 25 Makine Atölyesi öğütülmüş olabilir. Bu oda, 1.68 ml çalışma hacmine sahiptir. İsteğe bağlı naylon pullar, çeşitli boyutlarda seçilen olabilir; boyutları 18 mm çapında yuvarlak cam lamelleri ile uyumlu tercih.
- Elmas kalem *.
Bölüm 1: hayvan kap eksplant eksizyonu
- 1 / 3 x MBS istenilen aşamada 5 Kültür embriyolar. Gelişme oranı deneyler gün uygun bir zamanda yapılabilir ° C, böylece 15 ve 21 arasında kültür sıcaklıklarda kontrol edilebilir. Oda sıcaklığında olabilir ama embriyolar daha hızlı gelişecektir.
- DFA embriyo transferi.
- Vitellin membranlar forseps kullanarak çıkarın.
- Diseksiyon stereomikroskopta, tüketim altında bir hayvan kapağı eksplant saç bıçak ve saç-döngüler 6 kullanarak. Desteklemek ya da embriyoların hayvan kutup küçük bir kesi yapmak için bir embriyonun konumu ve saç-bıçak tutmak için saç döngüsünü kullanın. Saç bıçakla tekrar "hareketiyle keser" hayvan kap ektoderm embriyo kaldırmak için 360 ° kesi yapmak için kullanın. Uygulama ile, bir düzgün keser marjı eksplant veya parçalanmış hücreleri (Şekil 2A) en az zararla sonuçlanan yapabilirsiniz.
- Tüketim 3 ila 4 hayvan kap eksplantlar adım 4'ü yineleyin ve Bölüm 2 geçin. Eksplantlar kesim sırasında hızlı bir şekilde topu yukarı bir eğilim var biri, hızlı olmalıdır. Soğutmalı bir diseksiyon aşamada bu süreç yavaş olabilir veya alternatif olarak daha az eksplantlar yapabilirsiniz.
Bölüm 2: Uzun süreli kültür için hazırlayın odaları, yük eksplantlarında, ve mühür oda
- Kullanımsilikon tutkal gres veya akrilik odasına büyük cam kapak mühür.
- Yapışkan olmayan bir yüzey ile birlikte 2 ile 4 saat oda sıcaklığında veya 4 gece oda kuluçka odasının içinde cam cam kat eksplant yapışmasını azaltmak için ° C,% 1, 1 / 3 x MBS BSA (BSA -MBS).
- Elmas kalem kullanarak küçük lamel parçaları (8 mm yaklaşık 2) hazırlayın. BSA MBS Ön kat parçaları.
- BSA MBS odasından durulayın ve DFA ile medya değiştirin.
- Vergi hayvan kap eksplant (ler) (Bölüm 1; Şekil 2A) ve odasına transfer. Saç-loop (epitel tabakası odasının alt bakan) kullanarak her bir eksplant yerleştirin ve hafifçe yüksek vakum gres (Şekil 2B) küçük dabs tarafından düzenlenen bir cam lamel parçası ile eksplant düzeltmek. Aşırı basınç kolayca eksplant şut beri lamel basarken çok dikkatli olun. Birden fazla eksplantlar eksplantlar yerinde tutmak için kullanılan küçük bir lamel parçalarının büyüklüğüne göre her odasına yüklenebilir. Uygulama ile 20 kadar eksplantlar burada açıklanan akrilik odasının içine yüklenebilir. Üst açılış kadar hatta DFA odaları doldurun. 40 mm cam kapak ile 24 odasının üst mühür silikon gres kullanın. Odasından kapalı odası ve leke taşma hava kabarcıklarını azaltmak için DFA ekle veya kaldır.
- Bu kapalı oda, odanın geniş, alt cam yüzeye yoluyla hayvan kap eksplant uzun süreli kültür ve canlı görüntüleme sağlayacaktır. Daha sonra görüntüleme için pislik odasının alt cam yüzeyi, yağ, ya da medya tutmak için çok önemlidir. Biz görüntüleme için hazırlanan odaları saklamak için kağıt havlu oturaklı Petri yemekleri hazırlarken tavsiye ederiz.
Bölüm 3: Yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme konfokal mikroskobi
Bu bölümde yer alan protokol, bizim laboratuvar (Leica Microsystems, Bannockburn IL Leica TCS SP5) bir konfokal mikroskop kullanmak üzere geliştirilmiştir. Farklı konfokal mikroskoplar hafif bir değişiklik gerekebilir ve bu kullanıcıların kendi işletim yönergeleri izleyin.
- Power-up görüntüleme sistemi, mikroskop aşamasında başlatmak ve fluorophores için uygun lazerler açmak, floresein veya EGFP Argon lazer ve rodamin veya RFP 543 HeNe lazer yani.
- Odanın konut mikroskop sahneye eksplantlar yerleştirin. Önce odanın içine uygun bir amaç taşımak konumlandırma. Biz ilk görüntüleme için yüksek bir sayısal diyafram 20x hava hedefi (0.7 km) kullanmanızı tavsiye ederiz; yüksek çözünürlüklü görüntüleme için 40x veya 63x petrol hedefleri na using1.4 tavsiye ve büyük hücreli alanları izleme. (Not: yanlışlıkla petrol hedefi daldırma böylece bir hava amacı kullanırken bir kez immersiyon objektif kullanımı dikkatli uygulanır.) Odasının yerinde tutmak için küçük ağırlıklar kullanın.
- Yüzeysel hücrelerin apikal uçlarında görene kadar parlak bir alan ya da floresan aydınlatma kullanın ve odağı ayarlamak. Odasının temel amacı, "çarpışma" için dikkatli olun. Dahil veya immersiyon yağı hedefleri kullanarak hava kabarcıkları üreten kaçının. Örnekleri, "kaba" bir konumlandırma modu kullanılarak konumlandırılmış sonra, "ince" bir konumlandırma modu değiştirin.
- Canlı görüntüleme için konfokal ayarlama için öneriler:
- Lazer gücü mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır: 1) hücre şekil değişikliği 7 tetikleyen herhangi bir kaza sonucu önlemek için fototoksik etkileri, ve 3) engellemek için), 2 beyazlatma önlemek için. Lazer güç gereksinimi ekspresyon seviyesi ve embriyoların ifade moleküler gazetecilere türüne bağlı olarak değişir.
- Iyi görüntü çözünürlüğü sağlar canlı görüntüleme için 1024 1024 piksel tarama formatını kullanın. Çok yüksek kare hızı (bizim sistem için en az 1.3s) gerekiyorsa, 512 512 piksel tarama biçimi kullanabilirsiniz. Bu görüntü çözünürlüğünü azaltır, ancak yine de makul miktarda bilgi ayıklamak için yeterli olabilir.
- Emisyon, dikroik ve uyarma uygun şekilde filtre spektral aralığını ayarlayın.
- Airy 1 ile 1,5 birimlerine konfokal iğne deliği ayarlayın.
- Photomultiplier kazanç gürültüsünü azaltmak henüz hücre yapıları ve protein lokalizasyonu belirlemek için yeterli sinyal sağlamak için minimum düzeyde tutulmalıdır.
- Görüntü kalitesini artırmak için arka plan ayarlamak için ofset siyah seviyesini ayarlayın.
- (6) aracılığıyla Adımlar (1) iteratif mümkün olan en iyi kalitede görüntü üretmek için uygulanır. Kalite görüntüler, geniş bir dinamik aralık üzerinde piksel yoğunlukları ile yapısı veya lokalize proteinler çözmelidir. Kantitatif analizleri hedefi vardır, sıfır yoğunluğu ya da doymuş piksel minimum sayıda olmalıdır.
- Adımlar (1), (3), (5), ve (6) mümkün olan en kaliteli görüntü elde etmek, her ek floresan kanal için tekrar edilmesi gerekir.
- Görüntüleme iki veya flüoresan millerini minimum spektral kanama ile bir protein ikinci bir proteinin emisyon spektrumları olduğunu sağlamak için önemli olduğunda. Kanama, ilk protein heyecan verici lazer gücü azaltan ve ikinci protein tarafından kullanılan dalga boylarında üretilen sinyal gözlemleyerek test edilebilir. Spektral kanama yoluyla filtreleri daha fazla kısıtlayıcı bir seçim ya da uyarım için kullanılan lazer gücü azaltan ve ilk protein tespiti için kullanılan kazanç artan azalabilir.
- Bu yönergeleri kullanarak konfokal ayarlanmış ile XY modu (Şekil 3A) tek bir odak derinliği tek bir görüntü yakalamak için mümkün olmalıdır.
- Biri, hücre kasılması 7 sırasında şekil değişikliği gibi dinamik olarak oluşan bir sürecin zaman atlamalı filmleri toplama ilgilenen biri aşağıdaki alternatif konfokal modları arasından seçim vardır :
- XYT: Bu mod, bir Z-düzleminde değiştirmeden, zaman içinde bir dizi görüntüyü toplamak için izin verir. Biz epitel hücrelerinde endojen dalgalanmalar gözlemlemek için bu modu kullanın. Normalde, her 5 saniyede bir 20 dakika içinde epitel hücreleri dış stimülasyonu ile indüklenen endojen varyasyon veya şekil değişiklikleri gözlemlemek için bir çerçeve kazandırmak. Frame-rate seçimi bir gözlemleyerek ve ne kadar dinamik bir süreçtir ilgilenen tamamen bağımlı.
- XYZ: Bu modu kullanarak, epitel hücreleri ile tek bir Z-serisi yığını toplayabilirsiniz. Z-serisi toplamak için varsayılan ayarları, 5 mikron aralığında 0.1 mikron adımları. Biz sitoskeletal değişiklikler hücre korteks düzeyde adherens kavşaklar gibi sadece belirli bir pozisyon her yerde meydana gelen, ya da olup olmadığını belirlemek için bu modu kullanın.
- XZT (Şekil 3A): Bu mod genellikle epitel hücre apikal-bazal organizasyon hızlı değişimleri gözlemlemek için kullanılır. Bu mod, XYT modu konfokal görüntü elde etme, Z-ekseni boyunca sürüklenen değildir apikal hücre etki ve güvenilir bir muhabiri olduğunu teyit kendi programını popüler.
- XYZT: Bu XYZ ve XYT modları birleştirir. Bu mod, epitelin tam apikal-bazal dinamikleri zengin ayrıntıları, ancak yavaş, tam görüntü yığınlarının elde etmek ve ciddi nedeniyle hücre canlılığı photobleaching ve fototoksik etkilerini azaltabilir.
- Hattı ortalama, 2) çizgi birikimi, 3) çerçeve ortalama, ve 4) çerçeve birikimi 1): Görüntü kalitesi, bir ya da aşağıdaki dört yaklaşımların bir kombinasyonu kullanılarak sınırlı ölçüde geliştirilmiş olabilir. Bu görüntü elde etmek için ortalama modları görüntü kalitesini artırabilir ancak hücre canlılığını azaltır ve görüntüleri toplamak için daha fazla zaman gerektirecektir.
- Tüm ayarları dikkatli bir şekilde ayarlanabilir, toplamak ve bir harici sabit disk, USB memory stick ya da ağa bağlı sunucu görüntüler, Z-serisi ve zaman serisi verileri kaydetmek.
- Bir kez denemenizi tamamlamış, güvenlik için amaç düşük petrol ve objektif mercek kağıdı ile mikroskop aşamasında temiz ve güç aşağı konfokal sistem.
Bölüm 4: F-aktin mikrofilamentler Canlı görüntüleme
Bölüm 3'te görüldüğü gibi, membran lokalize protein mem-GFP floresan hücre zarları etiketlemek için kullanılan olabilir. Alt hücresel bileşenleri canlı görüntüleme, diğer proteinleri kullanılarak elde edilir. Moesin-GFP F-aktin bağlayıcı bir etki alanı içeren bir protein canlı hücreler F-aktin etiket kullanılabilir. Time-lapse dizileri canlı hücre görüntüleme ve toplama benzer stratejiler part 3 belirtilen prosedürleri izlemelidir. Canlı görüntüleme F-aktin yapıları zarı daha ince ve daha sıkı bir şekilde lokalize olduğundan görüntüleme mem-GFP daha mikroskopi becerilerini içerir. Örneğin, herhangi bir küçük kabarcıklar immersiyon yakalanan görüntüde bulanıklık veya değişken parlaklık sapması gibi eserler üretebilir. Ayrıca, fokal veya Z-düzleminde herhangi bir küçük sürüklenme moesin GFP odak-dışına taşımak için F-aktin kortikal etiketli neden olabilir. Böylece, bir aşamada, eksplant ve oda istikrara kavuşturmak için yeniden çift çabaları olmalıdır görüntüleme kortikal F-aktin ve diğer alt-hücresel proteinlerin. XY ve XZT moesin-GFP F-aktin etiketli gösteren görüntüler örnekleri (Şekil 3B ve B ') olarak gösterilmiştir.
Bölüm 5: Görüntü Analizi
Canlı hücre konfokal oturum elde edilen görüntüler ve zaman atlamalı dizileri protein localisation şekil değiştirir ya da desenler ile ilgili hipotezleri test etmek için analiz edilebilir. Çıplak gözle genellikle kalitatif analizi için en iyi araçtır ama artar veya kantitatif veri ayıklamak için görüntü analizi teknikleri kullanılarak otomatik hale getirilebilir. Leica konfokal sistemlerinden veri Resim TIF biçimlendirilmiş görüntü dosyaları ya da satın alma sırasında mikroskop durumu hakkında ayrıntılı bilgi koruyan özel bir LIF formatı gibi açık bir biçimde kaydedilebilir. . TI her ikisi deF ve. LIF dosyaları doğrudan serbestçe kullanılabilir bir görüntü analiz programı Image J (Rasband, WS, ImageJ, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, Maryland, ABD, http://rsb.info.nih.gov/ij alınabilir / 1997-2009) (Kevin Eliceiri, Loci, University of Wisconsin, Madison, WI), plug-in Bio-Formatları kullanarak. Aşağıdaki bölümde biz kullanıcılar konfokal görüntü verilerinin kantitatif analiz nasıl başlayabilir göstermek için iki örnek sunuyoruz.
- Herhangi bir TIF veya LIF dosya (Şekil 4 A ve A ') Dosya> AÇIK açın
- Örnek 1: B epitel hücre (Şekil 4B hücre alanını ölçün''').
- > SET ÖLÇÜMLER ANALYZE ALANI seçin.
- Resim J araç çokgen seçim aracını seçin ve hücre anahat.
- Aç ROI Manager> ARAÇLAR> ROI MÜDÜRÜ ANALYZE ve [kontrol-t] tuşuna basarak anahat eklemek, herhangi bir yeni "faiz bölge" veya yatırım getirisi ROI Yöneticisi eklemek için kısayol. Bu seçimi ve daha sonraki bir zamanda geri dönmek ve herhangi bir diğer parametre ölçümleri yapmak beri ROI-set kaydetmek için önemlidir. Kaydedilir ROI ("SAVE" butonuna tıklayınız) takımlar daha fazla analiz için daha sonra tekrar edilebilir.
- Bir adım bir görüntü hücrelerin herhangi bir sayı ile (c) tekrarlayın ve ROI Manager ROI'ler ekleyebilirsiniz. Bir kez kaydedilen yeterli ROI'ler, ROI Müdürü "ÖLÇÜ" tıklayın. Bulgular penceresinde, bir ROI'ler karşı ALANLARI görebilirsiniz. Resim boyutları, ölçüm parametreleri karşılık gelen değerler var.
- Örnek 2: C hücre zarı (Şekil 4C yoğunluğu ölçülür''').
- Resim J araç çubuğundan "Düz çizgi" aracını seçin ve ilgi hücre zarı dik ve membran haçlar resmin üzerine bir çizgi çizin. Bu düz hat seçimini ROI başka bir türüdür ve yukarıdaki gibi ROI Müdürü eklemek olabilir.
- ANALYZE> ARSA PROFİLİ keyfi birimleri göreli şiddetleri çizilir. Tıklayarak KAYDET ve LİSTESİ görüntü ve değerler listesi olarak kaydet> Ard> ARSA pencerede sırasıyla AS SAKLAYIN.
- Çeşitli kantitatif ölçümler araştırmacıların ilgilerine ve hipotezleri test edilmektedir Resim J bağlı olarak kullanılarak yapılabilir. Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Seattle, WA) veya Sigma Arsa (Systat Software Inc, San Jose, CA) grafiksel veri çizmek için kullanılabilir. Daha önce 7 görüntü analizi Ek örnekler sunulmuştur.
Şekil 1: Gerekli malzemeler . A) Araçlar kültür odasının mikrocerrahi ve montaj için gerekli. Petri kabı (a), büyük kapak kayma (b), saç araçları (c), elmas kalem (d), forseps (e), silikon gres "doldurmayı silah" (f), naylon yıkayıcı (g) ve özel akrilik kültürü odası (h). B) saç bıçak kapatın ve C) saç döngü.
Şekil 2 hayvan kap eksplant eksizyonu. A) bir hayvan kap eksplant (d, dorsal kaldırmak için kullanılan mikrocerrahi manipülasyon şematik; v, ventral; ah, hayvan yarımkürede; vh, bitkisel yarıküre). B) eksplant şematik (e), BSA kaplı cam (g) apposed apikal yüzey silikon gres (ler) tarafından düzenlenen bir lamel parçası altında konumlandırılmış. Eksplant epitel tabakası (m) mikroskop objektif yakın olduğunu, böylece bir konuma sahiptir. C) Hayvan kap eksplant (kırmızı ok) DFA kültürlü ve büyük bir cam lamel akrilik odası (mavi ok) (siyah ok) ev sahipliği ve cam lamel parçası ve silikon gres tarafından yerinde tutulur.
Şekil 3 Epitel hücreleri konfokal mikroskop kullanarak gözlenen. A) Bir XY görünümü ve membran lokalize GFP (mem-GFP) XZ (A ') görünümü etiketli epitel levha. B) bir moesin-GFP bir XY görünümü ve XZ görünümü (B) F-aktin apikal hücre korteks etiketli.
Şekil 4 Görüntü analizi Görüntü J. A membran lokalize GFP etiketli hücre levha) Orijinal görüntü kullanarak. (A) iç kutusunun yüksek çözünürlüklü görünümü (A ') iki "bölgelerinde-faiz" veya ROI'ler gösterir. Sarı-anahat çokgen aracının (bkz. B panelinden) ve yeşil hat kullanarak seçilen bir tek hücre sınır gösterir düz bir çizgi aracı (paneli C) kullanarak seçilen bir hücre-hücre sınır boyunca bir yoğunluk profili yolunu gösterir. Ölçüm seçenekleri seçin ve "Alan" (B''). Seçmek için B) Yöntem ROI seçildikten sonra ROI Yöneticisi (B'''). saklanabilir C ') yöntemi profil için ölçüm seçenekleri seçmek için aldı. C'') düz bir çizgi veya bölümlenmiş satırı aracı seçildikten sonra yol boyunca yoğunluk profili "Plot profili" komutu ile çizilebilir. Intens, listesiSığ değerleri de okunabilir bir elektronik tablo şeklinde kaydedilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz apikal hücre korteks ve Xenopus embriyolar epitel hücrelerinin hücre zarlarının salınan görüntü dinamik olarak değişen hücre iskeletinin laboratuvar düzenli olarak kullanılan deneysel protokolleri sundu. Bu protokolün optimizasyonu şarttır ve bazı ayarları bir mikroskop sistemi türüne bağlı olarak değişir ve proteinler bir tür görüntüleme ile ilgilenen; Bir epitel hücre şekilleri canlı görüntüleme için bir başlangıç noktası olarak bu protokoller kullanmanız gereken . Birlikte, protokol adımları (eksplant izolasyon, görüntüleme ve görselleştirme, hücresel ve hücre alt bileşenleri ve miktar metodolojisi) epitel morfolojilerinden çalışma için kapsamlı bir prosedür sağlar.
Hatırlanması gereken kritik yönleri
- Embriyolar içine mikro enjeksiyon için yüksek kaliteli mRNA hazırlamak için çok önemlidir. mRNA tüpler bozulmasını önlemek için buz üzerinde saklanır. Bir kez test tüpler -80 saklanır ° C daha küçük alikotları birden fazla donma-çözülme döngüsünden önlemek için.
- MRNA dağılımını hayvan kap ektoderm hücrelerinin büyük bir alan üzerinde sigortalamak için birden çok site içine mRNA enjekte etmek esastır.
- Antimikotik Toplama / antibiyotik bakteriyel ve fungal büyüme vazgeçirmek için uzun vadeli kültürü için önemlidir.
- Daha fazla gerekli basınç eksplantlar şut beri lamel parçalarının altında eksplantlar basarken dikkatli olmalı.
- Görüntüleme iken, en iyi ayarları endojen hücre davranışları ve protein dinamikleri yansıtan mümkün olan en iyi görüntü kalitesi ile maksimum veri toplamak için çok önemlidir. Optimum ayarları seçme, uygulama ve deneyimi ile geliyor.
- Görüntü analiz için şiddetle tavsiye ImageJ. ImageJ indirilen ve özel yazılı veya indirilen makro ve plug-in eklenmesi ile modifiye edilebilir mükemmel bir açık kaynak kodlu bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü (R01-HD044750), Ulusal Bilim Vakfı KARİYER hibe ve Amerikan Kalp Derneği (Başlangıç Hibe-in-Aid) destek tarafından desteklenmiştir. HY Kim, M. von Dassow ve J. Zhou (günlük laboratuvarı sorumlulukları ile ilgili yardım için) ve Lin Zhang, moleküler biyoloji ve sentezleme mRNA ona yardım için: Yazarlar Davidson Lab üyelerine teşekkür ederiz. Biz yıllar boyunca çeşitli yöntemler geliştirilmesi ve test ederek, bu protokol kısmı katkıda bulunmuştur kurbağa laboratuarları (özellikle Ray Keller ve Doug DeSimone) deneysel çabaları kabul etmiş oluyorsunuz. Richard Harland ve John Wallingford sırasıyla mem-GFP ve moesin-GFP plazmid tür hediyeler için teşekkür ederiz.
References
- Ninomiya, H., Winklbauer, R. Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension. Nat Cell Biol. 10 (1), 61-61 (2008).
- Kay, B. K., Peng, H. B. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1991).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Cohen, S., Au, S., Pante, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. , (2009).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Tables of Xenopus laevis (Daudin). , Elsevier North-Holland Biomedical Press. Amsterdam. (1967).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53 (3), 163-163 (2002).
- Joshi, S. D., Dassow, M. von, Davidson, L. A. Experimental control of excitable embryonic tissues: three stimuli induce rapid epithelial contraction. Exp Cell Res. 316 (1), 103-103 (2010).
