Summary
De huidige methode maakt het mogelijk reproduceerbaar cryostaat opdeling van de kleine, moeilijk te beheren, weefsel stukken, zoals biopsieën en hersenen plakjes. Wij gebruiken een eenvoudige aluminium bevriezing stadium bij het verwerken van weefsel en een standaard cryostaat om routinematig produceren 5-10 micron seriële secties van 400 micron dikke sneden hersenen te vergemakkelijken.
Abstract
Veel onderzoek in de neurowetenschappen, evenals andere disciplines, te betrekken het bestuderen van kleine, maar macroscopische stukken of delen van weefsel die bewaard zijn gebleven, vers verwijderd of weggesneden maar bleef levensvatbaar, zoals in het stukje voorbereiding van het hersenweefsel. Latere microscopisch onderzoek van dit materiaal kan lastig zijn, omdat het weefsel monsters kunnen worden moeilijk te hanteren. Aangetoond hier is een methode voor het verkrijgen van dunne cryostaatcoupes van weefsel met een dikte die kan variëren +0,2 tot +5,0 mm. We routinematig geknipt 400 micron dikke Vibratome hersencoupes serieel in 50-10 micron coronale cryostaat secties. De schijfjes worden doorgaans het eerst gebruikt voor elektrofysiologie experimenten en vervolgens vereisen microscopische analyse van de cytoarchitecture van de regio waar de opnames werden waargenomen. We hebben geconstrueerd een eenvoudig apparaat dat gecontroleerde en reproduceerbare voorbereiding en positionering van het weefsel slice toelaat. Dit apparaat bestaat uit een cilinder 5 cm lang met een diameter van 1,2 cm, die dienst doet als een beslissing tot bevriezing podium voor de slice. Een ring schuift precies over de cilinder het verstrekken van muren rond de slice waardoor het weefsel te worden ondergedompeld in de vrieskou verbinding (bijv. LGO). Dit is dan snel bevroren met gemalen droog ijs en de daaruit voortvloeiende wafer kan eenvoudig worden positie voor cryostaat snijden. Dunne secties kunnen ontdooien gemonteerd op gecoate dia's te laten verdere studies moeten worden uitgevoerd, zoals diverse kleuringsmethoden, in situ hybridisatie, of immunohistochemie, zoals hier aangetoond.
Protocol
- Voorbereiden mal van tape voor oktober platform.
- Vul de vorm met oktober Freeze binnen de cryostaat of met behulp van gemalen droog ijs.
- Verwijder de tape van rond bevroren oktober platform.
- Lijn markeringen op bevriezing chucks and cryostaat montage fase en lock in Chuck.
- Doorsnede van oktober platform totdat het oppervlak is vlak.
- Verwijder dook oktober platform en leg ze op cryostaat bevriezing podium.
- Plaats weefselmonster (voorheen gecryopreserveerd met 30% glycerol of sucrose in PBS) in oktober
- Bereid bevriezing kolom met buitenste ring het projecteren van ongeveer 5 mm boven de bovenkant van kolom vormen goed voor oktober
- Zorgvuldig positie weefselmonster naar het centrum van invriezen kolom oppervlak en langzaam oktober tot goed gevuld is toe te voegen.
- Surround bevriezing kolom met gemalen droog ijs. Weefsel en de LGO moet volledig bevriezen binnen 20-60 seconden.
- Als voorbereiding op stijgingen van de temperatuur krijgt, kan de buitenste ring worden verwijderd terwijl het monster blijft bevroren.
- Schuif de steekproef uit het bevriezen kolom zijwaarts en plaats in de cryostaat.
- Plaats druppel oktober op het oppervlak van LGO-platform en positie monster (weefsel naar beneden) het toepassen van een stevige druk. Specimen zal snel bevriezen op oktober platform.
- Secure chuck op cryostaat montage podium met uitgelijnd merken.
- Doorsnede van oktober oppervlakkig om het weefsel monster.
- Dooi monteren dunne secties op glas dia's en op te slaan bevroren of op kamertemperatuur.
- Afweerreacties kan worden uitgevoerd voor tissue gemonteerd op glasplaatjes.
- Reagens wordt gebundeld op glijbaan, kan voorzichtig worden geschud, en kunnen worden gedekt als licht-gevoelig.
- Volgende fasen van de reactie zijn eenvoudig uit te voeren door het omkeren van afglijden in afvalbak, wicking de dia en daarna het toepassen van de volgende reagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier gepresenteerde biedt onderzoekers met een beknopte, gemakkelijk te volgen schetsen van hoe dun cryostaatcoupes van de kleine, moeilijk te beheren, weefsel stukken, zoals biopsieën en de hersenen plakjes voor verdere studies moeten worden uitgevoerd, zoals het verkrijgen van verschillende kleuringsmethoden, in situ hybridisatie, of immunohistochemie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O. C. T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
| Glycerol Solution | 30% Glycerol Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | 30% Sucrose Solution in PBS w/v |
References
- Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
- Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).
