Dünnschnitt der Scheibe Vorbereitungen für die Immunhistochemie

Summary

Das vorliegende Verfahren ermöglicht reproduzierbare Kryostat Schnitte von kleinen, schwer zu verwalten, Gewebeteile, wie Biopsien und Hirnschnitten. Wir verwenden ein einfaches Aluminium Einfrieren der Bühne um die Behandlung von Gewebe-und ein Standard-Kryostat routinemäßig produzieren 5-10 Mikrometer Serienschnitte von 400 Mikrometer dicken Hirnschnitten zu erleichtern.

Abstract

Viele Untersuchungen in den Neurowissenschaften sowie anderen Disziplinen, auch mit der Analyse kleine, aber makroskopische Stücke oder Abschnitte von Gewebe, die erhalten wurden, frisch entfernt oder ausgeschnitten, aber lebensfähig gehalten, wie in Scheibe Vorbereitungen des Hirngewebes. Nachfolgende mikroskopische Untersuchungen dieses Materials kann eine Herausforderung sein, da die Gewebeproben kann schwierig zu handhaben. Hier gezeigt wird ein Verfahren zur Gewinnung dünne Kryostatschnitte des Gewebes mit einer Dicke von 0,2 bis 5,0 mm, die reichen können. Wir routinemäßig Schnitt 400 Mikron dick Vibratom Hirnschnitten seriell in 5-10 Mikrometer koronalen Kryostatschnitte. Die Scheiben sind in der Regel zunächst für Elektrophysiologie Experimente verwendet und dann verlangen, mikroskopische Analyse der Zytoarchitektur der Region, aus der die Aufnahmen wurden nicht beobachtet. Wir haben ein einfaches Gerät, das kontrollierte und reproduzierbare Herstellung und Positionierung der Gewebeschnitt erlaubt konstruiert. Dieses Gerät besteht aus einem Zylinder 5 cm in der Länge mit einem Durchmesser von 1,2 cm, die als Bühne für das Einfrieren der Scheibe dient. Ein Ring eng gleitet über den Zylinder bietet Mauern um die Scheibe so dass das Gewebe in dem Gefrierpunkt Verbindung eingetaucht werden (zB OCT). Dies ist dann schnell mit zerstoßenem Trockeneis eingefroren und die daraus resultierenden Wafer Position leicht für Kryostat Schnitte. Dünne Schnitte werden können Tau-montiert auf beschichtete Objektträger, damit weitere Untersuchungen durchgeführt, wie verschiedene Färbemethoden werden, in-situ-Hybridisierung oder Immunhistochemie, wie hier gezeigt.

Protocol

1. Bereiten Form von Band für die OCT-Plattform.
2. Fill Form mit Oktober Einfrieren des Kryostaten oder mit zerkleinertem Trockeneis.
3. Entfernen Sie das Klebeband aus der ganzen gefrorenen OCT-Plattform.
4. Richten Sie Markierungen auf dem Gefrierpunkt Spannfutter und Kryostat Montage der Bühne und Schloss im Futter.
5. Schnitt durch OCT-Plattform bis die Oberfläche ist flach.
6. Entfernen Sie tauchte OCT-Plattform und am Kryostaten Einfrieren der Bühne.
7. Legen Sie Gewebeprobe (bisher mit 30% Glycerin oder Saccharose in PBS kryokonserviert) in Oktober
8. Bereiten Sie das Einfrieren Spalte mit Außenring projizieren ca. 5 mm über der Oberseite der Säule bildet auch für Oktober
9. Vorsichtig Position Gewebeprobe in die Mitte der Gefrierpunkt Spalte Oberfläche und langsam Okt bis gut gefüllt ist.
10. Surround Einfrieren Spalte mit zerkleinertem Trockeneis. Tissue-und OCT sollte vollständig innerhalb 20-60 Sekunden einfrieren.
11. Als Vorbereitung Temperaturerhöhungen, kann der Außenring entfernt, während die Probe bleibt eingefroren werden.
12. Slide Probe aus dem Gefrierpunkt Spalte seitlich und in Kryostaten.
13. Legen drop der OCT auf der Oberfläche des OCT-Plattform und die Position Probe (Gewebe down) Anwendung festem Druck. Specimen wird schnell auf OCT-Plattform einfrieren.
14. Sichere Spannfutter auf Kryostat Montage der Bühne mit den Noten ausgerichtet.
15. Schnitt durch Oktober oberflächlich auf die Gewebeprobe.
16. Thaw montieren dünne Schnitte auf Objektträger und speichern gefroren oder bei Raumtemperatur.
17. Immunreaktionen können für das Tissue auf Glasträger montiert durchgeführt werden.
18. Reagenz wird auf Folie gebündelt, können leicht geschüttelt werden und kann gedeckt, wenn lichtempfindlichen werden.
19. Spätere Phasen der Umsetzung sind einfach durch Umdrehen Abgleiten in die Abfallbehälter durchgeführt, Feuchtigkeitsregulierung der Folie, und dann die Anwendung des nächsten Reagenz.

Discussion

Das Protokoll hier vorgestellten bietet den Forschern eine prägnante, leicht zu folgen skizzieren, wie dünn Kryostatschnitte von kleinen, schwer zu verwalten, Gewebeteile, wie Biopsien und Hirnschnitten für weitere Studien durchgeführt werden, wie erhalten verschiedenen Färbemethoden, in-situ-Hybridisierung oder Immunhistochemie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
O. C. T.	Ted Pella, Inc.	27050
Glycerol Solution			30% Glycerol Solution in PBS w/v
Sucrose Solution			30% Sucrose Solution in PBS w/v