Summary
O presente método permite criostato reprodutíveis corte de pequenas peças, difíceis de gerenciar, de tecidos, tais como biópsias e fatias de cérebro. Nós utilizamos um estágio de congelamento simples de alumínio para facilitar a manipulação de tecido e um criostato padrão para produzir seções rotineiramente micron 10/05 de série a partir de 400 micron fatias de cérebro de espessura.
Abstract
Muitas investigações em neurociência, assim como outras disciplinas, envolvem o estudo pequeno, ainda peças macroscópicas ou secções do tecido que foram preservados, recém-retirado, ou cortado, mas manteve viável, como em preparações fatia de tecido cerebral. Subseqüentes estudos microscópicos deste material pode ser um desafio, como as amostras de tecido pode ser difícil de manusear. Demonstrado aqui é um método para a obtenção de seções criostato fina de tecido com uma espessura que pode variar 0,2-5,0 mm. Rotineiramente cortar 400 micron fatias de cérebro de espessura Vibratome série em 50-10 micron seções criostato coronal. As fatias são normalmente utilizados pela primeira vez para experimentos de eletrofisiologia e, em seguida, exigem uma análise microscópica da citoarquitetura da região a partir do qual as gravações foram observados. Construímos um dispositivo simples que permite a preparação controlada e reprodutível e posicionamento da fatia de tecido. Este dispositivo consiste de um cilindro de 5 cm de comprimento com um diâmetro de 1,2 cm, que serve como um estágio de congelamento da fatia. Um anel confortavelmente desliza sobre as paredes do cilindro em torno do fornecimento de fatia permitindo que o tecido a ser imerso em composto de congelamento (por exemplo, OCT). Este é, então, rapidamente congelados em gelo seco esmagado eo wafer resultante pode ser facilmente para a posição de corte do criostato. Seções finas podem ser descongelar montado em lâminas revestidas para permitir que novos estudos a serem realizados, como vários métodos de coloração, hibridização in situ, ou imuno-histoquímica, como demonstrado aqui.
Protocol
- Prepare o molde da fita para a plataforma de outubro
- Preencha o molde com outubro Congelar dentro criostato ou usando gelo seco esmagado.
- Retire a fita em torno da plataforma outubro congelados.
- Alinhe as marcas de congelamento e chuck estágio criostato de montagem e fechamento de mandril.
- Secção da plataforma de outubro até a superfície é plana.
- Remover ressurgiu plataforma de outubro e coloque em criostato estágio de congelamento.
- Colocar a amostra de tecido (previamente criopreservados com glicerol 30% ou sacarose em PBS), em outubro
- Preparar a coluna de congelamento com anel externo projetando cerca de 5 mm acima do topo da coluna formando bem para outubro
- Atentamente a posição amostra de tecido para centro da superfície da coluna de congelamento e adicionar lentamente outubro até bem está cheia.
- Surround coluna congelando com gelo seco esmagado. Tecido e outubro deve congelar completamente dentro de 20-60 segundos.
- Com o aumento da preparação de temperatura, o anel externo podem ser removidos enquanto a amostra permanece congelado.
- Deslizar para os lados da amostra off coluna congelamento e coloque em criostato.
- Local de queda de outubro na superfície de outubro plataforma e espécime posição (tecido para baixo) aplicar uma pressão firme. Espécime vai congelar rapidamente na plataforma outubro
- Chuck seguro em criostato de montagem palco com marcas alinhadas.
- Secção através outubro superficial para a amostra de tecido.
- Descongelar montar seções finas em lâminas de vidro e armazenar congelados ou à temperatura ambiente.
- Immunoreactions pode ser realizada para o tecido montados em lâminas de vidro.
- Reagente é agrupada em slide, pode ser suavemente agitado, e pode ser coberto se sensível à luz.
- Fases posteriores da reação são facilmente realizados por deslize invertendo em recipiente de resíduos, wicking o slide, e então aplicar o reagente seguinte.
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Discussion
O protocolo apresentado aqui fornece aos pesquisadores uma concisa, fácil de seguir esboço de como obter seções criostato fina de pequenas peças, difíceis de gerenciar, de tecidos, tais como biópsias e fatias de cérebro de novos estudos a serem realizados, tais como vários métodos de coloração, hibridização in situ, ou imuno-histoquímica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O. C. T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
| Glycerol Solution | 30% Glycerol Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | 30% Sucrose Solution in PBS w/v |
References
- Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
- Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).
