Summary
Настоящий метод позволяет воспроизводимых криостат секционирования маленький, трудно в управлении, тканевой части, такие как биопсия и мозг ломтиками. Мы используем простой этап замораживания алюминия для облегчения обработки ткани и стандартных криостате в плановом порядке выпускать 5-10 микрон серийных срезов от 400 микрон ломтики мозга.
Abstract
Многие исследования в области неврологии, а также других дисциплин, связаны с изучением небольшой, но макроскопические части или участки тканей, которые сохранились, только что удален, или вырезали но сохранил жизнеспособным, как и в часть подготовки ткани головного мозга. Последующие микроскопические исследования этого материала может быть сложным, так как образцы тканей может быть трудно справиться. Продемонстрированный здесь метод получения тонких срезов тканей криостат с толщиной, которая может варьироваться от 0.2-5.0 мм. Мы регулярно вырезать 400 микрон ломтики мозга Vibratome серийно в 5-10 микрон корональные разделы криостата. Ломтиками, как правило, впервые использован для проведения экспериментов электрофизиологии, а затем требуют микроскопического анализа cytoarchitecture региона, из которого записи не наблюдалось. Мы построили простое устройство, которое позволяет контролировать и воспроизводимые подготовки и позиционирование ткани срез. Это устройство состоит из цилиндра 5 см в длину при диаметре 1,2 см, который служит замораживание почву для среза. Кольцо плотно скользит по цилиндр предоставления стены вокруг среза позволяет ткани, которая будет погружена в замораживании соединения (например, в октябре). Это потом быстро замороженные с дробленым сухой лед и в результате пластины можно легко позиции для криостата секционирования. Тонкие разделов могут быть оттепели монтажа на покрытие слайды, чтобы дальнейшие исследования должны быть выполнены, например, различные методы окрашивания, на месте гибридизация, или иммуногистохимии, как показано здесь.
Protocol
- Подготовка формы с магнитной ленты для платформы октября
- Заполните форму с октября Замораживание в криостате или с использованием дробленого сухого льда.
- Удалите ленту с замороженными вокруг платформы октября
- Совместите метки на замораживание патрон и криостат монтажа сцены и блокировки в патроне.
- Раздел по октябрь платформу, пока поверхность плоская.
- Удалить всплыли октября платформы и место на этапе замораживания криостата.
- Место образец ткани (ранее криоконсервированных с 30% глицерина или сахарозы в PBS) в октябре
- Подготовка замораживания колонки с внешним кольцом выступающие примерно на 5 мм выше верхней части рулевой колонки формирования хорошо октября
- Осторожно установите образец ткани на центр замерзания поверхности колонки и медленно добавить октября, пока хорошо не будет заполнен.
- Объемного замораживания колонку с дробленым сухим льдом. Ткани и октябре должна полностью заморозить в течение 20-60 секунд.
- В качестве подготовки повышение температуры, внешнее кольцо может быть удален в то время как образец остается замороженным.
- Слайд образца от замерзания в сторону колонны и место в криостате.
- Место капли октября на поверхности октября платформы и положение образца (ткань вниз) применения фирмы давление. Образцы быстро заморозить на платформу октября
- Безопасные патрон на криостате монтаж сцены с марками выровнены.
- Раздел по октябрь поверхностно ткани образца.
- Оттепель гору тонких срезов на предметные стекла и хранить замороженные или при комнатной температуре.
- Immunoreactions может быть выполнена для ткани установлены на стеклах.
- Реагент в пул на слайде, можно мягко взволнованным, и могут быть охвачены, если светочувствительные.
- Последующие этапы реакции легко осуществляется путем обращения в слайд отходов сосуда, влагу слайд, а затем нанесением следующего реагента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь предоставляет исследователям краткой, простой в последующей схема того, как для получения тонких срезов криостат мелких, трудно в управлении, тканевой части, такие как биопсия и мозг ломтиками для дальнейших исследований должны быть выполнены, например, различные методы окрашивания, на месте гибридизация, или иммуногистохимии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O. C. T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
| Glycerol Solution | 30% Glycerol Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | 30% Sucrose Solution in PBS w/v |
References
- Scoutern, C. W., O'Connor, R., Cunningham, M. Perfusion fixation of research animals. Microsc. Today. 14, 26-33 (2006).
- Cunningham, M. G., Connor, C. M., Zhang, K., Benes, F. M. Diminished serotonergic innervation of adult medial prefrontal cortex after 6-OHDA lesions in the newborn rat. Brain Res. Dev. Brain Res. 157, 124-131 (2005).
