Summary
Это видео демонстрирует технику для извлечения ДНК из видов микробов резидентом в задней кишке термитов. Подготовка слайд мокрыми гору, которая полезна для визуализации сообщества кишечнике микробные иллюстрируется также и тур по богатых видами среды кишечника дается.
Abstract
Термиты являются одними из немногих животных, как известно, способность существовать исключительно за счет потребления древесины. Термита тракта кишки содержит плотные и богатые видами микробной популяции, что способствует деградации лигноцеллюлозы преимущественно в ацетат, основным питательным веществом заправки термитов метаболизм (Odelson и Breznak, 1983). В рамках этих микробных популяций бактерии, археи метаногенных, а в некоторых («нижнее») термитов, эукариотических простейших. Таким образом, термиты отлично предметов исследования для изучения взаимодействия между видов микроорганизмов и многочисленных биохимических функций, которые они выполняют в пользу хозяина. Видовой состав микробных популяций в борьбе с термитами кишки, а также ключевые гены, вовлеченные в различные биохимические процессы были изучены с использованием молекулярных методов (Кудо и др., 1998;. Шмит-Вагнера и др., 2003;. Salmassi & Лидбеттер, 2003). Эти методы зависят от добычи и очистки высококачественных нуклеиновых кислот из термита среде кишечника. Добыча методике, описанной в этом видео представляет собой модифицированный составления протоколов, разработанных для добычи и очистки нуклеиновых кислот из проб окружающей среды (Мор и др., 1994;. Berthelet и др., 1996;. Парди и др., 1996;. Salmassi & Лидбеттер, 2003;. Оттесен и др. 2006), и он производит ДНК от термитов кишке материала, пригодного для использования в качестве шаблона для полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Protocol
Процедурные резюме для борьбы с термитами целом кишки экстракции ДНК:
- Холод термитов на льду, удалить кишечник использованием стерильного пинцета и стабилизировать кишки образцы в буфере.
- Однородный образцов в PVPP / SDS / фенола буфера.
- Извлечение и очистить ДНК из сырой лизат использованием Qiagen DNeasy столбцов.
Протокол:
- На льду, удалить внутренности от работника касты термитов использованием стерильных щипцов.
- Сразу передачи кишки и содержимое стерильным, нуклеазы без трубки, содержащей 50 мкл ледяной 1x молекулярной биологии классе TE буфера (1 мМ Трис-HCl, 0,1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Замораживание образцов при -20 ° С, или перейти непосредственно с гомогенизации.
- Передача кишки образцов и буфер для стерильной, нуклеазы, свободных 2 мл винта ограничен трубки с предустановленной 500 мг стерильной циркония / диоксид кремния бисером (0,1 мм) и 700 мкл буфера TE 1x, содержащей 1% вес / polyvinylpolypyrrolidone (PVPP ).
- Добавить 50 мкл 20% додецилсульфата натрия (SDS) и 500 мкл фенола в пробах.
- Однородный (шарик бить) на максимальных настройках с использованием трех циклов 30 гомогенизации сек и 30 сек охлаждение на льду.
- Осадка нерастворимого материала в течение 1 мин при 8000 х г.
- Purify 300-мкл аликвоты водный (верхний) слой с Qiagen DNeasy столбцов с помощью метода, описанного на сырую очистки лизата.
- Количественно содержание нуклеиновых кислот и заморозить образцы при -20 ° C для дальнейшего использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По нашему опыту, ДНК, извлеченной из микробных сообществ древесных видов термитов кормления, как nevadensis Zootermopis является достаточно чистым для шаблона ПЦР после одного раунда добычи и очистки. Однако, некоторые термиты, такие как мусор грудью и почвы вскармливание вид может иметь более высокую концентрацию гуминовых кислот в их содержимого кишечника и может потребоваться дополнительная очистка кишечника ДНК микроорганизмов. Суммарный выход ДНК из кишки 5 рабочих З. nevadensis находится в диапазоне 10-30 мкг. Для борьбы с термитами видов значительно меньше или больше этого вида, больше или меньше образцы могут быть необходимы для получения такого же количества ДНК.
Этот метод может быть легко адаптирован, чтобы выделения РНК. Для экстракции РНК, заменить 1x RNAprotect Бактерии реагента из Qiagen (catlog нет. 76506) для ледяной TE буфера, описанных в пункте 2 протокола. Qiagen RNeasy реагентов и столбцов (catlog нет. 74104) должны быть использованы вместо DNeasy процедуру очистки, описанной выше. Как ДНК, могут быть очищены от RNAprotect стабилизированного образцов и всего в 300 мкл ок. 700 мкл водного слоя, полученное на шаге 7 требуется для очистки нуклеиновых кислот, этот метод может быть использован для получения ДНК и РНК в параллельном с одного образца.
Эти методы зависят от добычи и очистки высококачественных нуклеиновых кислот из термита среде кишечника. Добыча методике, описанной в этом видео представляет собой модифицированный составления протоколов, разработанных для добычи и очистки нуклеиновых кислот из проб окружающей среды (Море и др., 1994;. Berthelet и др., 1996;. Парди и др., 1996;. Salmassi & Лидбеттер, 2003;. Оттесен и др. 2006), и он производит ДНК от термитов кишке материала, пригодного для использования в качестве шаблона для полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
| TE | Buffer | Sigma-Aldrich | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
| zirconia/silica beads | Supplies | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reagent | Sigma-Aldrich | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
| SDS | Reagent | Sigma-Aldrich | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
| Phenol | Reagent | Sigma-Aldrich | 77607 | TE-saturated, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Tool | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1 M soln. of NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |
References
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
