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Biology

花香浸改造拟南芥检查 pTSO2:β-葡萄糖醛酸酶报告基因的表达

doi: 10.3791/1952 Published: June 11, 2010

Summary

本文介绍了花卉浸方法

Abstract

一个有机体,引入外源基因的能力,是现代生物学和生物技术的基础。在该模型中的开花植物

Protocol

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一,花香拟南芥的转化

  1. 改造前约1个月,大约有10-15%的盆栽植物拟南芥种子播撒到4至8盆(5平方英寸的花盆)。与正常生育的植物,4盆植物每质粒的构建就足够了。如果一个人改造拟南芥突变生育率下降,增加相应的盆数。
  2. 植物生长标准条件下(16小时光照,8小时黑暗,在22 ° C)。如果较短的一天或更低的温度下生长的植物,他们将需要更长的时间,花和更长的改造做好准备。良好的植物护理,确保健康的植物,这是成功转型的关键。
  3. 当植株只是狂奔,并开始开花。他们现在准备转型。为了提高转换效率,改造前的3-4天,剪掉主花序芽,尽快为他们狂奔,以鼓励更多中学拍摄形成。植物浇水改造前的一天。这确保土壤不会吸收太多渗透媒体在花香浸。
  4. 改造前两天,接种40毫升含有适当的抗生素的LB农杆菌菌株GV3101中携带的pTSO2(pTSO2情况下的 GUS,50微克/ ml卡那霉素:)::GUS的构造。 pTSO2::GUSpBIN20载体,拥有NPTII基因,赋予抗卡那霉素3克隆。在摇床过夜增长在28-30 ° C。
  5. 翌日,转移到含有50微克/ ml卡那霉素LB400毫升8毫升过夜培养。在摇床过夜增长在28-30 ° C。
  6. 在转型的一天,当外径 600农杆菌文化达到约0.8( 外径 600 0.5 TO1之间是可以接受的),降速在8分钟在5000RPM农杆菌过夜培养。
  7. 在1升悬浮农杆菌渗透介质颗粒(升)(10MM氯化镁2,5%的蔗糖,0.44mM 6 benzyladenine(BA),0.3%silwet L - 77,1X Gamborg的维生素解决方案和灭菌水)。媒介并不需要进行高压灭菌,但需要作出新鲜。成菜(如8“X15”X2“硼硅玻璃盘),倒入1升农杆菌渗透介质。
  8. 反转锅(植物不会脱落)和渗透液浸所有的植物地上部分,一锅煮5分钟举行一次。虽然植物的地上部分是渗透液中浸泡,避免让土壤浸泡渗透媒体,以减少对土壤真菌生长的机会。
  9. 浸渍后,放在几层纸巾蘸盆就在自己身边,在一个托盘。纸巾浸泡渗透媒体的访问量。封面用保鲜膜,以确保高湿度的托盘。放置到植物生长室的托盘。
  10. 翌日,除去保鲜膜和纸巾,和地方盆直立。不要将这些植物的水为四,五个多天。之后,维持植物正常,直到他们种子,并收集散装种子。
  11. MS培养基中含有50微克/ ml卡那霉素(重量2.2克Murashige和Skoog不含维生素基底盐倒入板(150x15mm培养皿),1M氢氧化钠溶解在500毫升的水,pH值至5.8,加4革兰氏琼脂,高压灭菌,冷却和添加卡那霉素50μg/ ml的终浓度)。板都保持在4℃直至需要。
  12. 要选择抗生素耐药性的转基因植物,需要至少20000种子屏幕。 0.1克约5000种子。重量和估计的金额的种子。
  13. 他们用70%乙醇30秒15毫升猎鹰管清洗消毒种子。用无菌水冲洗种子一次。包含商店买来的,5%漂白水(Clorox公司)1:10稀释的溶液中浸泡30秒的种子。无菌水冲洗3至6倍的种子。在无菌罩,吸管约5000到每个MS板(卡那霉素)的种子,传播的种子均匀板,微孔3M胶带密封板,以避免污染。
  14. 孵育板在4 ° C在3-4天的黑暗,然后转板一腔(可能是相同的植物生长室)。经过约14天,转基因苗保持绿色,但非转基因​​的脸色苍白,奄奄一息。放缓拉根从中长期放置在土壤中,转基因苗转移到土壤。

二。检查pTSO2::GUS表达模式

  1. 收获pTSO2::GUS转基因苗,他们在寒冷的90%丙酮在玻璃闪烁瓶或离心管保存在冰上。聚苯乙烯微孔板(聚丙烯),也可以使用,如果有大量的样品进行分析。
  2. 所有样品都收获后,在室温下放置20分钟的小瓶。在这段时间内没有X - Gluc(0.2%Triton X - 100,50mm的NaHPO PH7.2缓冲4,2MM亚铁氰化钾,2MM钾铁氰化钾),并置于冰上新鲜的染色缓冲。
  3. 从样本中删除丙酮和添加染色缓冲。
  4. X - Gluc染色的溶液(0.2%的Triton X - 100,4 NaHPO 50mm的缓冲液PH7.2,2MM钾亚铁氰化物,2mm的铁氰化钾,采用2mm x - gluc) 。从样品中取出染色缓冲和添加样品含有X - Gluc染色缓冲。
  5. 下15至20分钟的真空渗透的样品。慢慢松开真空和验证,所有样品染色溶液的表面之下下沉。如有必要,重复,直到所有样本下沉渗透,被释放后的真空。
  6. 孵育在37 ° C与X - Gluc染色缓冲过夜。
  7. 从孵化器中取出样品取出染色缓冲。在连续乙醇系列清洗样品在室温(20%,35%和50%的乙醇)改变每次30分钟。
  8. 在FAA固定液(50%乙醇,5%的甲醛,10%的醋酸,其余水)为30分钟,在室温下的组织修复。删除美国联邦航空局(FAA)​​和添加70%的乙醇。此时组织可配备一台数码相机在解剖显微镜下可视化和拍照。深蓝色的颜色表示 TSO2是表示(图1) 。另外,组织可存放在4 ° C以供日后观赏。

    图1
    图1 pTSO2::GUS 基因在转基因苗(一),(二)侧根,并根尖(C)。请注意,TSO2发起人是非常年轻和分裂组织中的积极。 (C)所示的零星的表达模式是在特定的细胞周期基因表达的典型。

代表性的成果

如果做得正确,转化效率约为0.1-0.2%。换句话说,应该得到筛查每5000种子5-10转基因苗。平均,约100个​​转基因株系可转化野生型植株的4盆。

对于转基因苗含有pTSO2::GUS基因构建3,深蓝色的色调反映了GUS活性,是在积极的分裂中的细胞,包括嫩叶,茎尖,根尖和侧根原基(图1)。非均匀的零星模式的特点是细胞周期阶段的具体体现。

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Discussion

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转化效率是由许多不同的因素,下面讨论的:

  1. 植物的健康和他们的年龄是最重要的。约一个月的老厂生产大量未成熟的花芽,是理想的。修剪主芽,以鼓励中学改造前3-4天拍摄形成会增加转化效率。老厂将产生转化,但在较低的利率。
  2. 生育的植物是重要的。如果一个人改造与生育率下降的突变体,植物将需要更多的浸渍。
  3. 0.3%Silwet L - 77渗透缓冲区中的表面活性剂被认为是必不可少的。
  4. 渗透媒体浸泡时间应至少5分钟。
  5. 为了减少真菌污染,应采取一些预防措施。首先,需要浇水的植物/土壤渗透前一天浸泡渗透介质,以避免土壤。不要淹没的土壤渗透媒体。其次,在24小时内删除渗透,以减少水分后的塑料盖和纸巾。第三,不要自来水厂,直到渗透后5天。

根据特定的质粒构建,转基因植物的选择方法可能有所不同。如果一个质粒载体进行大律师公会(bialaphos乙酰转移酶)标记基因抗草胺膦,可以直接种植在土壤中的种子,没有任何消毒种子。一个然后喷洒1:1000稀释草胺膦(商品名:终曲,自由,或Ignite)的幼苗每隔几天来选择抗苗。

GUS染色,重要的是要在丙酮在冰上收获的组织和所有的解决方案保持冷,以避免任何退化。和没有X - Gluc染色缓冲区的需求,取得了新的,虽然可以为每个组件的股票解决方案和存储时间提前(见下文)。亚铁氰化钾和赤血是有毒的,应谨慎处理。此外,它非常重要孵化组织在37 ° C,因为该组织在与X - Gluc染色缓冲区超过1-2天就可以开始恶化和/或染色模式可能成为在漫长的孵化过于分散。最后,较高的含铁和亚铁氰化钾浓度,降低整体染色的水平,但更具体。采用2mm x - Glux作品对于大多数应用,但可能需要对某些需要调整的浓度。 X - Gluc是昂贵的。染色应在最短的卷进行。

股票可以提前解决方案:

10%的Triton X - 100(在室温下储存几个月)
0.5 M的NaHPO 4缓冲液(PH7.2)(在室温下保存数个月)
100毫米亚铁氰化钾(存储在4 ° C几个月在黑暗中)
100毫米的铁氰化钾(保存在4 ° C几个月在黑暗中)
100毫米x - Gluc(5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基β- D -葡糖苷酸cyclohexamine盐)是在二甲基甲酰胺(DMF),并储存在-20 ° C包裹在锡箔管。它持续了好几个月。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们感谢春新王建设pTSO2::GUS和图1,德特勒夫威格尔的照片分享有益的意见的GUS万无一失的协议,帕哈Sijacic和考特尼荷伦德。 Z. L S实验室的研究是由美国国家科学基金会(IOB0616096和MCB0744752)的支持。 ZL是由美国马里兰大学农业试验站的部分支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-benzyladenine Sigma-Aldrich 852430
Silwet-77 Crompton Corp. Toxic, wear gloves
Murashige and Skoog Basal medium (MS) Sigma-Aldrich M5519
Gamborg’s vitamin solution 1000X Sigma-Aldrich G1019
X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt Biosynth International, Inc B-7300 Toxic, light sensitive keep in the dark
Micropore 3M Tape Fisher Scientific 19027761

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References

  1. Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
  2. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, (6), 735-735 (1998).
  3. Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18, (2), 350-350 (2006).
花香浸改造<em>拟南芥</em>检查<em> pTSO2:β-葡萄糖醛酸酶</em>报告基因的表达
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Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::β-glucuronidase Reporter Gene Expression. J. Vis. Exp. (40), e1952, doi:10.3791/1952 (2010).More

Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::β-glucuronidase Reporter Gene Expression. J. Vis. Exp. (40), e1952, doi:10.3791/1952 (2010).

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