Summary
هذه المقالة يوضح الأزهار وتراجع طريقة
Abstract
القدرة على إدخال جينات أجنبية إلى كائن حي هو الأساس للبيولوجيا الحديثة والتكنولوجيا الحيوية. في النموذج النباتات المزهرة
Protocol
أولا الزهور وتراجع تحويل thaliana Arabidopsis
- ما يقرب من 1 الشهر قبل التحول ، وعلى زرع بذور Arabidopsis 4-8 القدور (5 الأواني بوصة مربعة) مع ما يقرب من 10-15 النباتات في وعاء. للنباتات ذات الخصوبة الطبيعية ، 4 والأواني من النباتات في بناء البلازميد يكون كافيا. إذا كان على المرء أن تحويل Arabidopsis متحولة مع انخفاض الخصوبة ، وزيادة عدد من الأواني وفقا لذلك.
- تزرع النباتات تحت ظروف قياسية (16 ساعة ضوء و 8 ساعة مظلمة عند 22 درجة مئوية). إذا تزرع النباتات تحت أقصر يوم أو انخفاض درجة الحرارة ، وسوف يستغرق وقتا أطول لزهرة وأطول لتكون جاهزة للتحول. حسن النية رعاية النباتات النباتات ضمان صحي ، وهما أمران أساسيان لتحقيق التحول الناجح.
- عندما انسحب النباتات عادل وبدأت زهرة. وهم الآن على استعداد للتحول. لزيادة كفاءة التحول ، 3-4 أيام قبل عملية التحول ، وتقليم قبالة براعم الإزهار الرئيسية في أقرب وقت لديهم لتشجيع تشكيل انسحب تبادل لاطلاق النار أكثر الثانوي. المياه والنباتات في اليوم قبل التحول. هذا يضمن أن التربة ولن امتصاص الكثير من وسائل الاعلام تسلل خلال غمس - نباتية.
- قبل يومين من التحول ، وتطعيم LB 40ml تحتوي على مضادات حيوية مناسبة (في حالة pTSO2 : : المكتب المركزي للاحصاءات ، 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين) مع الأجرعية المورمة GV3101 سلالة تحمل pTSO2 : GUS بناء. غير المستنسخة في المكتب المركزي للاحصاءات التي تمتلك ناقلات pBIN20 NPTII الجين الذي يمنح مقاومة الكاناميسين 3 : pTSO2 :. تنمو بين عشية وضحاها في حاضنة تهتز في 28-30 درجة مئوية.
- في اليوم التالي ، 8ml نقل الثقافة بين عشية وضحاها إلى 400ml من LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين. تنمو بين عشية وضحاها في حاضنة تهتز في 28-30 درجة مئوية.
- في يوم من التحول ، عندما OD 600 من ثقافة الأجرعية تصل 0.8 تقريبا (600 OD بين 0.5 to1 مقبولة) ، وتدور باستمرار بين عشية وضحاها في الثقافة الأجرعية لمدة 8 دقائق في 5000rpm.
- Resuspend الكرية الأجرعية في 1 لتر (لتر) من وسائل الاعلام التسلل (10MM MgCl 2 ، 5 ٪ سكروز ، 0.44mM 6 benzyladenine (BA) ، 0.3 ٪ silwet L - 77 ، 1X Gamborg ق فيتامين حل تعقيمها والمياه). وسيلة لا بد من تعقيمها لكنه يحتاج إلى بذل الطازجة. صب 1 المتوسطة L تسلل الأجرعية المحتوية على طبق (مثل 8 "X15" X2 "طبق زجاج بيركس).
- عكس وعاء (النباتات لن تسقط) وتراجع جميع الأجزاء الهوائية من النباتات الى حل التسلل ، وعقد لمدة 5 دقائق وعاء واحد في وقت واحد. في حين تغمر جميع الأجزاء الهوائية من النبات في المتوسط التسلل ، وتجنب ترك التربة امتصاص أي من وسائل الاعلام للحد من عمليات التسلل من فرص نمو الفطريات في التربة.
- بعد غمس ، ومكان كل الأواني انخفض الى جانبهم على عدة طبقات من منشفة ورقية في الدرج. والمناشف الورقية وتمتص كمية وصول وسائل الاعلام التسلل. غطاء علبة مع غلاف بلاستيكي لضمان ارتفاع نسبة الرطوبة. مكان الدرج في غرفة نمو النبات.
- في اليوم التالي ، إزالة التفاف البلاستيك والمناشف الورقية ، وأواني مكان في وضع مستقيم. لا مياه هذه المحطات لمدة أربعة إلى خمسة أيام. بعد ذلك ، والمحافظة على النباتات عادة حتى وضعوا بذور وجمع البذور بكميات كبيرة.
- صب لوحات (150x15mm طبق بتري) مع MS المتوسطة يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين (الوزن Murashige 2.2g الملح وسكوغ القاعدية دون فيتامين يذوب في 500 مل من الحموضة ، والمياه إلى 5.8 مع هيدروكسيد الصوديوم 1M ، إضافة 4 غرام آغار ، الأوتوكلاف ، باردة و إضافة إلى الكاناميسين 50 ميكروغرام / مل التركيز النهائي). وتحفظ لوحات في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.
- لتحديد المقاومة للمضادات الحيوية للنباتات المعدلة وراثيا ، ويحتاج المرء إلى شاشة 20000 البذور في الحد الأدنى. 0.1 جرام من بذور حوالي 5000. وزن وتقدير كمية من البذور.
- تعقيم البذور بغسلها في 15 مل أنبوب فالكون الايثانول مع 70 ٪ لمدة 30 ثانية. تغسل بماء معقم البذور مرة واحدة. نقع البذور لمدة 30 ثانية في محلول يحتوي على التخفيف من متجر 01:10 التبييض اشترى 5 ٪ (كلوروكس). شطف البذور مع الماء المعقم 3-6 مرات. في هود العقيمة ، انتشر نحو 5000 ماصة البذور على كل لوحة (الكاناميسين) MS ، بذور بالتساوي على لوحة ، وختم الشريط مع لوحات 3M Micropore لتجنب التلوث.
- احتضان لوحات في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 3-4 أيام ، ثم نقل إلى غرفة لوحات (يمكن أن يكون نمو النبات نفس الغرفة). بعد حوالي 14 يوما والشتلات الخضراء المعدلة وراثيا ولكن يبقى منها غير المعدلة وراثيا هي تحول شاحبة ويموتون. نقل الشتلات المعدلة وراثيا في التربة عن طريق إبطاء سحب جذور الخروج من المتوسط ووضعتها في التربة.
II. دراسة pTSO2 : أنماط التعبير GUS
- حصاد pTSO2 : شتلات GUS المعدلة وراثيا ووضعها في البرد الأسيتون 90 ٪ في قارورة زجاجية أو أنابيب التلألؤ microfugeأن يتم الاحتفاظ على الجليد. ويمكن أيضا لوحات microtiter البوليسترين (لا البولي بروبلين) يمكن استخدامه إذا كان أحد بتحليل عدد كبير من العينات.
- بعد أن يتم حصاد جميع العينات ، ضع قارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. خلال هذا الوقت تشكل الطازجة العازلة دون تلطيخ X - الحلاوة (0.2 ٪ تريتون X - 100 ، 4 العازلة 50mM NaHPO pH7.2 ، 2mm والبوتاسيوم فيروسيانيد البوتاسيوم 2mm و، فيري سيانيد) ومكان على الجليد.
- إزالة الأسيتون من العينات وإضافة العازلة تلطيخ.
- تشكل الأشعة الحلاوة حل تلطيخ (0.2 ٪ تريتون س 100 ، 4 50mM NaHPO 2mm والبوتاسيوم الاحتياطي pH7.2 ، فيروسيانيد البوتاسيوم 2mm و، فيري سيانيد ، 2mm وX - الحلاوة). إزالة البقع من عينات عازلة وإضافة العازلة التي تحتوي على تلطيخ X - الحلاوة للعينات.
- اختراق العينات تحت فراغ لمدة 15 إلى 20 دقيقة. الافراج عن فراغ ببطء والتحقق من أن جميع العينات تغرق تحت سطح الحل تلطيخ. إذا لزم الأمر ، كرر تسلل حتى تغرق جميع العينات بعد إصدارها الفراغ.
- احتضان عينات في 37 درجة مئوية خلال الليل في المنطقة العازلة تلطيخ مع x - الحلاوة.
- إزالة عينات من الحاضنة وإزالة البقع العازلة. غسل العينات في سلسلة متعاقبة من الإيثانول (20 ٪ ، 35 ٪ والايثانول 50 ٪) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة كل تغيير.
- إصلاح الأنسجة في تثبيتي FAA (الإيثانول 50 ٪ ، 5 ٪ فورمالدهايد وحامض الخليك 10 ٪ ، وبقية الماء) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة FAA وإضافة الإيثانول 70 ٪. عند هذه النقطة يمكن أن يكون تصور وتصوير الأنسجة تحت المجهر تشريح مجهزة بكاميرا رقمية. أما اللون الأزرق الداكن يدل حيث يتم التعبير عن TSO2 (الشكل 1). بدلا من ذلك ، يمكن تخزينها في الأنسجة 4 درجات مئوية لمشاهدتها لاحقا.
الشكل 1 pTSO2 : : المكتب المركزي للاحصاءات في التعبير الشتلات المعدلة وراثيا (A) ، والجذور الجانبية (B) ، وقمة الجذر (C). علما بأن TSO2 المروج نشطة للغاية في الأنسجة الشباب والانقسام. نمط التعبير متفرقة هو موضح في (C) هو نموذجي من الجينات التي أعرب عنها في مراحل معينة دورة الخلية.
ممثل النتائج
عندما يوظف بشكل صحيح ، يجب أن تكون كفاءة التحول نحو 0،1-0،2 ٪. في كلمة أخرى ، ينبغي للمرء الحصول على الشتلات وراثيا عن طريق الفحص 5-10 كل بذور 5000. في المتوسط ، يمكن الحصول على حوالي 100 المعدلة وراثيا عن طريق تحويل خطوط 4 أحواض النباتات البرية من نوع.
لشتلات المعدلة وراثيا تحتوي على pTSO2 : تم العثور على 3 GUS بناء ، واللون الأزرق الداكن يعكس GUS النشاط في خلايا نشطة بما في ذلك تقسيم يترك الشباب ، وقمة اطلاق النار ، وقمة الجذر ، والجذر الوحشي primordia (الشكل 1) : نمط غير موحدة متفرقة هو سمة من دورة الخلية مرحلة محددة التعبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تحديد كفاءة التحول العديد من العوامل المختلفة ، التي تناقش أدناه :
- صحة النباتات وسنهم وذات أهمية قصوى. واحد تقريبا في الشهر إنتاج المصانع القديمة العديد من البراعم الزهرية غير ناضجة مثالية. وسوف يطلق النار على التشذيب قبالة الأولية لتشجيع تبادل لاطلاق النار الثانوية تشكيل أيام 3-4 قبل التحول زيادة كفاءة التحول. وسوف أقدم النباتات تؤدي إلى transformants ولكن بسعر أقل.
- خصوبة النباتات هو المهم. إذا كان على المرء أن تحويل المسوخ مع انخفاض الخصوبة ، وسوف تكون هناك حاجة إلى الكثير من النباتات لغمس.
- يعتبر 0.3 ٪ Silwet L - 77 السطحي في المخزن تسلل الأساسية.
- وينبغي أن غمس مرة في وسائل الاعلام ان تكون على الاقل تسلل 5 دقائق.
- للحد من التلوث الفطري ، ينبغي اتخاذ احتياطات عدة. أولا ، يحتاج المرء لتجنب امتصاص التربة من وسائل الاعلام تسلل سقي النباتات / التربة قبل يوم واحد التسلل. لا غمر التربة في وسائل الإعلام التسلل. الثانية ، وإزالة الغطاء البلاستيك ومنشفة ورقية في غضون 24 ساعة بعد التسلل للحد من الرطوبة. ثالثا ، لا محطات المياه حتى 5 أيام بعد تسلل.
اعتمادا على بناء البلازميد محددة ، قد طرق اختيار النباتات المعدلة وراثيا تختلف. إذا متجه بلازميد يحمل بار (bialaphos أسيتيل) علامة الجينات المقاومة لمنح غلوفوسنات الأمونيوم ، ويمكن للمرء أن المصنع مباشرة البذور في التربة دون أي تعقيم البذور. بخاخ واحد ثم الشتلات مع 1:1000 غلوفوسنات الأمونيوم المخفف (الاسم التجاري : النهاية ، والحرية ، أو اشعال) مرة واحدة كل بضعة أيام لتحديد مقاومة للشتلة.
لتلطيخ GUS ، فمن المهم أن الحصاد الأنسجة في الأسيتون على الثلج والبرد تبقي كل الحلول لتجنب أي تدهور. المخازن المؤقتة مع وبدون تلطيخ X - الحلاوة يحتاج إلى بذل الطازجة ، وإن كان من الممكن أن يتم حل سهم لكل مكون وتخزينها في وقت سابق (أنظر أدناه). فيروسيانيد البوتاسيوم وفيري سيانيد سامة ، وينبغي التعامل معها بحذر. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه من المهم عدم احتضان النسيج في 37 درجة مئوية في المنطقة العازلة مع تلوين X - الحلاوة لمدة أطول من 1-2 أيام لأن الأنسجة يمكن أن تبدأ في التدهور و / أو نمط تلطيخ قد تصبح منتشرة جدا خلال فترة طويلة حضانات . أخيرا ، وتركيزات أعلى حديدي فيروسيانيد إعطاء أدنى مستوى تلطيخ عموما ، ولكن أكثر خصوصية. 2mm وX - Glux يعمل بشكل جيد بالنسبة لمعظم التطبيقات ، ولكن بتركيزات قد تحتاج إلى تعديل لتلبية احتياجات معينة. X - الحلاوة مكلفة. وينبغي الاضطلاع بها في تلطيخ أحجام ضئيلة.
حلول الأسهم التي يمكن إجراؤها في وقت مبكر :
10 ٪ تريتون X - 100 (المخزنة في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر)
0.5 M NaHPO 4 العازلة (pH7.2) (المخزنة في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر)
فيروسيانيد البوتاسيوم 100 ملم (مخزن في الظلام في 4 درجات مئوية لعدة أشهر)
فيري سيانيد البوتاسيوم 100 ملم (مخزن في الظلام في 4 درجات مئوية لعدة أشهر)
يرصد 100 ملم x - الغلوكوز (5 - 4 - برومو كلورو - 3 - indolyl الملح cyclohexamine β - D - غلوكورونيد) في ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF) وتخزينها في -20 درجة مئوية في أنابيب ملفوفة البربون. فإنه يستمر لعدة أشهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر تشون وانغ لبناء pTSO2 : GUS والصور في الشكل 1 ، ديتليف يجل لتقاسم بروتوكول GUS - مضمونة ، Sijacic Paja ، وكورتني Hollender للتعليقات مفيدة. ويدعم البحوث في المختبر Z. L ق من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (وIOB0616096 MCB0744752). معتمد جزئيا ZL من جامعة ميريلاند محطة التجربة الزراعية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzyladenine | Sigma-Aldrich | 852430 | |
| Silwet-77 | Crompton Corp. | Toxic, wear gloves | |
| Murashige and Skoog Basal medium (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| Gamborg’s vitamin solution 1000X | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt | Biosynth International, Inc | B-7300 | Toxic, light sensitive keep in the dark |
| Micropore 3M Tape | Fisher Scientific | 19027761 |
References
- Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).
- Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).
