Bloemen-dip Transformatie van Arabidopsis thaliana Om te onderzoeken PTSO2:: β-glucuronidase Reporter Gene Expression

Summary

Dit artikel illustreert de bloemen-dip methode van

Abstract

De mogelijkheid om vreemde genen te introduceren in een organisme is de basis voor de moderne biologie en biotechnologie. In het model bloeiende plant

Protocol

I. Bloemen-dip transformatie van Arabidopsis thaliana

1. Ongeveer een maand voorafgaand aan de transformatie, zaaien Arabidopsis zaden op 4-8 potten (5 inch vierkante potten) met circa 10-15 planten per pot. Voor installaties met een normale vruchtbaarheid, zal vier potten van planten per plasmideconstruct voldoende zijn. Als men aan mutant Arabidopsis te transformeren met een verminderde vruchtbaarheid, toename van het aantal potten dienovereenkomstig.
2. De planten worden geteeld onder standaard condities (16 uur licht en 8 uur donker bij 22 ° C). Als planten worden geteeld onder korter dag of lagere temperatuur, zullen ze meer tijd nodig om te bloeien en langer om klaar te zijn voor transformatie. Een goede plant zorg zal zorgen voor een gezonde planten, die essentieel zijn voor succesvolle transformatie.
3. Als de planten zijn net geschroefd en begonnen te bloeien. Ze zijn nu klaar voor de transformatie. Ter verhoging van efficiëntie van de omzetting, 3-4 dagen voor de transformatie, trim uit de belangrijkste bloeiwijze scheuten zodra ze met bouten aan meer secundaire schieten oprichting te bevorderen. Water de planten op de dag voor transformatie. Dit zorgt ervoor dat de grond niet zal genieten van al te veel infiltratie van de media tijdens de bloemen-dompelen.
4. Twee dagen voorafgaand aan de transformatie, enten 40ml LB met de juiste antibiotica (in het geval van pTSO2:: GUS, 50 ug / ml kanamycine) met Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 het dragen van de pTSO2:: GUS bouwen. De pTSO2:: GUS is gekloneerd in de vector die pBIN20 NPTII gen dat resistentie verleent tegen kanamycine ³ bezit. Grow 's nachts in een incubator te schudden bij 28-30 ° C.
5. De volgende dag, overdracht 8 ml van de overnacht cultuur in 400 ml van LB met 50 ug / ml kanamycine. Grow 's nachts in een incubator te schudden bij 28-30 ° C.
6. Op de dag van transformatie, toen de OD ₆₀₀ van de Agrobacterium cultuur ongeveer 0,8 (OD ₆₀₀ tussen 0,5 tot1 zijn acceptabel) bereikt, spin down van de Agrobacterium 's nachts cultuur op gedurende 8 minuten bij 5000rpm.
7. Resuspendeer de Agrobacterium pellet in een L (liter) van infiltratie media (10mm MgCl _2, 5% sacharose, 0.44mM 6-benzyladenine (BA), 0,3% silwet L-77, 1x Gamborg s vitamine oplossing en geautoclaveerd water). Het medium hoeft niet te worden geautoclaveerd, maar moet worden gemaakt vers zijn. Giet de 1 L Agrobacterium-bevattend medium infiltratie in een schaal (zoals 8 "x15" x2 "Pyrex glazen schaal).
8. Keer de pot (planten zullen niet vallen) en alle bovengrondse delen van de planten in de infiltratie-oplossing dip, houdt u gedurende 5 minuten een pot per keer. Terwijl alle bovengrondse delen van de plant zijn ondergedompeld in de infiltratie medium, vermijden dat grond te dringen tot een van de infiltratie media om kans op schimmelgroei te verminderen op de bodem.
9. Na het dompelen, plaats alle gedompeld potten op hun kant op meerdere lagen papier handdoek in een lade. De papieren handdoeken genieten van toegang hoeveelheid infiltratie media. Dek de bak af met plasticfolie om te hoge luchtvochtigheid zorgen. Plaats de lade weer in de groei van planten kamer.
10. Op de volgende dagen, rechtop verwijder het plastic omhulsel en papieren handdoekjes, en plaats potten. Niet water deze planten voor vier tot vijf dagen. Daarna, normaal onderhoud van de planten tot ze set zaden en het verzamelen van zaden in bulk.
11. Giet platen (150x15mm petrischaal) met MS medium dat 50 ug / ml kanamycine (gewicht 2.2g Murashige en Skoog basale zout zonder vitamine, los op in 500 ml water, pH op 5,8 met 1M NaOH, voeg 4 gram agar, autoclaaf, koel en Voeg Kanamycine tot 50 ug / ml uiteindelijke concentratie). Platen zijn bewaard in 4 ° C totdat het nodig is.
12. Te selecteren voor de antibiotica-resistente transgene planten, moet men tot 20.000 zaden scherm minimum. 0,1 gram is ongeveer 5000 zaden. Gewicht en een schatting van de hoeveelheid zaden.
13. Steriliseren zaden door was ze in 15 ml Falcon buis met 70% ethanol gedurende 30 seconden. Was de zaden met steriel water een keer. Week de zaden voor 30 seconden in een oplossing die 1:10 verdunning van de winkel koopt 5% bleekmiddel (Clorox). Spoel zaden met steriel water drie tot zes keer. In steriele kap, pipet ongeveer 5000 zaden op elke MS (Kanamycine) plaat, verspreid de zaden gelijkmatig over de plaat, afdichting van de platen met Micropore 3M tape om besmetting te voorkomen.
14. Incubeer de platen bij 4 ° C in het donker voor 3-4 dagen, vervolgens over de platen op een kamer (kan dezelfde plantengroei kamer zijn). Na ongeveer 14 dagen, transgene zaailingen blijven groen, maar de niet-transgene die draaien bleek en sterven. Breng de transgene zaailingen aan de bodem door het vertragen van het trekken van de wortels uit de medium en plaatste ze in de bodem.

II. Het onderzoeken van pTSO2:: GUS expressie patronen

1. Oogst pTSO2:: GUS transgene zaailingen en leg ze in koud 90% aceton in een glazen scintillatieflesje of microfugebuizen buizendie worden bewaard op ijs. Polystyreen microtiterplaten (niet polypropyleen) kan ook worden gebruikt als een analyseert een groot aantal monsters.
2. Nadat alle monsters worden geoogst, plaatst u de flacons bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Gedurende deze tijd maken verse vlekken buffer zonder x-Gluc (0,2% Triton x-100, 50 mM NaHPO ₄ Buffer pH7.2, 2mm kaliumferrocyanide, 2mm kaliumferricyanide) en leg ze op ijs.
3. Verwijder aceton van de monsters en voeg de vlekken buffer.
4. Make-up x-Gluc kleuroplossing (0,2% Triton x-100, 50 mM NaHPO ₄ Buffer pH7.2, 2mm kaliumferrocyanide, 2mm kaliumferricyanide, 2mm x-Gluc). Haal de vlekken buffer van de monsters en voeg de vlekken buffer met x-Gluc om de monsters.
5. Infiltreren in de monsters onder vacuüm gedurende 15 tot 20 minuten. Langzaam los van de stofzuiger en controleer of alle monsters zinken onder de oppervlakte van de kleuroplossing. Indien nodig, herhaal infiltratie totdat alle monsters zinken nadat het vacuüm wordt losgelaten.
6. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende de nacht in de kleuring buffer met x-Gluc.
7. Verwijder de monsters van incubator en verwijder vlekken buffer. Was de monsters in opeenvolgende series ethanol (20%, 35% en 50% ethanol) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten elke wijziging.
8. Bevestig de weefsels in FAA fixatief (50% ethanol, 5% Formaldehyde, 10% azijnzuur, rest water) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de FAA en voeg 70% ethanol. Op dit punt de weefsels kunnen worden gevisualiseerd en gefotografeerd onder een dissectiemicroscoop uitgerust met een digitale camera. Een donkere blauwe kleur geeft aan waar TSO2 wordt uitgedrukt (figuur 1). Als alternatief kunnen de weefsels worden opgeslagen bij 4 ° C om later te bekijken.
   
   
   Figuur 1 pTSO2:.: GUS-expressie in transgene zaailingen (A), laterale wortels (B), en wortel tip (C). Merk op dat TSO2 promotor is zeer actief bij jonge en delende weefsels. De sporadische expressiepatroon getoond in (C) is typerend voor genen die tot expressie in bepaalde fasen van de celcyclus.

Representatieve resultaten

Wanneer correct gedaan, moet transformatie-efficiëntie ongeveer 0,1-0,2%. In een ander woord, moet men krijgen 50-10 transgene zaailingen door het screenen van elke 5000 zaden. Gemiddeld, kan ongeveer 100 transgene lijnen worden verkregen door het transformeren van 4 potten van in het wild-type planten.

Voor transgene zaailingen met de pTSO2:: GUS construct ^3, donker blauwe kleur weerspiegelt GUS activiteit is te vinden in actief delende cellen ook jonge blaadjes, schieten apex, wortel tip, en de laterale wortel primordia (figuur 1). De niet-uniforme sporadisch patroon is kenmerkend voor fase van de celcyclus-specifieke expressie.

Discussion

De efficiëntie van de transformatie wordt bepaald door veel verschillende factoren, die hierna worden besproken:

1. De gezondheid van de planten en hun leeftijd zijn van primair belang. Ongeveer een maand oude planten produceren van tal van onvolwassen bloemen knoppen zijn ideaal. Knippen uit primaire scheuten naar secundair scheutvorming 3-4 dagen aan te moedigen voor de transformatie zal toenemen transformatie-efficiëntie. Oudere planten zullen aanleiding geven tot transformanten, maar tegen een lager tarief.
2. Vruchtbaarheid van de planten is belangrijk. Als men naar mutanten te transformeren met een verminderde vruchtbaarheid, zal veel meer planten nodig om te dippen.
3. 0,3% Silwet L-77 oppervlakte-actieve stof in infiltratie buffer is van essentieel belang geacht.
4. Dompelen tijd in de media infiltratie moet minstens 5 minuten.
5. Ter beperking van schimmel besmetting moet met een aantal voorzorgsmaatregelen worden genomen. Ten eerste moet men de bodem te vermijden van te genieten van infiltratie media door het besproeien van de planten / bodem een ​​dag voor infiltratie. Niet onderdompelen in de bodem infiltratie media. Ten tweede, verwijder het plastic deksel en een papieren handdoek binnen 24 uur na de infiltratie van vocht te verminderen. Ten derde, geen waterplanten tot 5 dagen na de infiltratie.

Afhankelijk van de specifieke plasmide bouwen, kan de selectie methoden van transgene planten variëren. Als een plasmide vector draagt ​​de balie (bialaphos acetyltransferase) marker-gen resistentie tegen glufosinaat-ammonium, kan men direct de zaden in de bodem, zonder de sterilisatie van zaden. Men dan sprays de zaailingen met 1:1000 verdund glufosinaat-ammonium (commerciële naam: Finale, Liberty, of Ignite) een keer om de paar dagen om te kiezen voor resistente zaailingen.

Voor GUS kleuring, is het belangrijk om weefsel oogst in aceton op ijs en alle oplossingen koud om degradatie te voorkomen houden. De kleuring buffers met en zonder X-Gluc moet worden gemaakt fris, hoewel de voorraad oplossing voor elk onderdeel kan worden gemaakt en van tevoren opgeslagen (zie hieronder). Kaliumferrocyanide en ferricyanide zijn giftig en moeten met zorg worden behandeld. Daarnaast is het is belangrijk om niet aan het weefsel incuberen bij 37 ° C in de kleuring buffer met X-Gluc langer dan 1-2 dagen, omdat het weefsel kan beginnen en / of de kleuringspatroon verslechteren kan te diffuus geworden tijdens de lange incubatie . Tot slot, hogere Ferri en ferrocyanide concentraties geven lagere totale kleuring niveau, maar meer specificiteit. 2mm x-Glux werkt goed voor de meeste toepassingen, maar de concentraties moet mogelijk worden aangepast voor bepaalde behoeften. X-Gluc is duur. De kleuring dient te worden uitgevoerd in een minimale volumes.

Stock oplossingen die kunnen van tevoren worden gemaakt:

10% Triton X-100 (op kamertemperatuur bewaard gedurende een aantal maanden)
0,5 M NaHPO ₄ Buffer (pH7.2) (op kamertemperatuur bewaard gedurende een aantal maanden)
100 mM kaliumferrocyanide (op te slaan in het donker bij 4 ° C gedurende enkele maanden)
100 mM kaliumferricyanide (Bewaren in het donker bij 4 ° C gedurende enkele maanden)
100 mM X-Gluc (5-broom-4-chloor-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine zout) is gemaakt in dimethylformamide (DMF) en opgeslagen in -20 ° C in aluminiumfolie gewikkeld buizen. Het duurt enkele maanden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzyladenine	Sigma-Aldrich	852430
Silwet-77	Crompton Corp.		Toxic, wear gloves
Murashige and Skoog Basal medium (MS)	Sigma-Aldrich	M5519
Gamborg’s vitamin solution 1000X	Sigma-Aldrich	G1019
X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt	Biosynth International, Inc	B-7300	Toxic, light sensitive keep in the dark
Micropore 3M Tape	Fisher Scientific	19027761