Summary
Bu makale, çiçek-daldırma yöntemi göstermektedir.
Abstract
Bir organizmanın içine yabancı genlerin tanıtmak için yetenek, modern biyoloji ve biyoteknolojinin temelini oluşturur. Model çiçekli bitki
Protocol
I. Çiçekli daldırma Arabidopsis thaliana dönüşümü
- Yaklaşık 1 ay önce dönüşüm, pot başına yaklaşık 10-15 bitkiler ile 4-8 tencere (5 inç kare tencere) üzerine Arabidopsis tohumları ekmek. Plazmid inşa başına 4 tencere bitkilerin normal doğurganlık ile bitkiler için yeterli olacaktır. Doğurganlık azalmış mutant Arabidopsis dönüştürmek için varsa, buna göre kapların sayısını artırmak.
- Bitkiler standart koşullar altında (22, 16 saat ışık ve 8 saat karanlık ° C) yetiştirilmektedir. Kısa gün veya daha düşük sıcaklık altında yetiştirilen bitkiler, bu dönüşüm için hazır hale çiçek ve daha uzun sürecektir. İyi bitki bakımı, başarılı bir dönüşüm için gerekli olan sağlıklı bitkiler, sağlayacaktır.
- Bitkiler sadece cıvatalı ve çiçek başladı. Onlar şimdi, dönüşüm için hazır. Dönüşüm verimliliği artırmak için, dönüşüm 3-4 gün önce, en kısa sürede daha ikincil ateş oluşumunu teşvik etmek cıvatalı gibi ana gelişme sürgünler keserek. Bitkilerin dönüşüm önceki gün Su. Bu toprak, çiçek daldırma sırasında çok infiltrasyon medya emmek olacağını garanti eder.
- : (Agrobacterium tumefaciens gerginlik GV3101 pTSO2 taşıma ile GUS, 50 mcg / ml Kanamisin: pTSO2 durumunda): İki gün önce dönüşüm, uygun antibiyotik içeren 40ml LB aşılamak: GUS inşa. PTSO2: GUS Kanamisin 3 direnç bahşeder NPTII gen sahip pBIN20 vektör klonlanmış. 28-30 ° C'de sallayarak inkübatör gecede büyütün
- Ertesi gün, 50 mg / ml Kanamisin içeren LB 400ml gecelik kültür transferi 8 ml. 28-30 ° C'de sallayarak inkübatör gecede büyütün
- Dönüşüm gününde, OD 600 Agrobacterium kültürünün yaklaşık 0.8 (0.5 1'e arasında OD 600 kabul edilir) ulaştığında, 5000rpm 8 dakika Agrobacterium gecede kültürü aşağı doğru döndürün.
- 1 L infiltrasyon medya Agrobacterium pelet yeniden süspanse (litre) (10mM MgCl 2,% 5 sakkaroz, 0.44mM 6-benzyladenine (BA),% 0.3 silwet L-77, 1x Gamborg vitamin çözüm ve otoklava su). Orta otoklava gereken değildir ama taze yapılmış olması gerekir. 1 L Agrobacterium içeren infiltrasyon orta bir yemek (8 "x15" x2 "Pyrex cam tabak) içine dökün.
- Pot haricindekileri (bitkiler kapalı düşme olmaz) ve bitkilerin tüm hava infiltrasyon çözüm içine daldırma, bir seferde bir tencerede 5 dakika tutun. Bitkinin tüm hava infiltrasyon orta dalmış iken, toprak, toprak üzerinde mantar büyüme şansını azaltmak için herhangi bir infiltrasyon medya içinize izin kaçının.
- Daldırma sonra, bir tepsi kağıt havluyu birkaç kat üzerinde kendi tarafında tüm daldırma tencere yerleştirin. Kağıt havlu infiltrasyon medya erişim miktarı içinize çekin. Tepsi yüksek nem sağlamak için naylon ile örtün. Bitki büyüme odasına tepsiye yerleştirin.
- Ertesi gün, dik plastik wrap ve kağıt havlu, yer ve tencere çıkarın. 4-5 gün daha bu bitkiler su etmeyin. Daha sonra, tohum kadar normalde bitkilerin bakımı ve toplu olarak tohumları toplamak.
- 4 gram serin agar, otoklav ve 1M NaOH ile 5,8, 500 ml su, pH içinde çözülür, MS 50 mg / ml Kanamisin (ağırlık 2.2G Murashige içeren orta ve bazal tuz vitamini olmadan Skoog levhalar (150x15mm petri) dökün ) 50 mg / ml nihai konsantrasyonu Kanamisin ekleyin. Tabaklar gerekli ° C ye kadar 4 tutulur.
- Antibiyotiğe dayanıklı transgenik bitkiler için seçmek için en az 20.000 tohum ekrana ihtiyacı var. 0.1 gram yaklaşık 5000 tohum. Ağırlık ve tohum miktarı tahmin.
- 15 ml Falcon tüp 30 saniye boyunca% 70 etanol ile yıkayın tohum sterilize edin. Tohumları bir kez steril su ile yıkayın. 01:10 seyreltme mağaza satın aldı,% 5 çamaşır suyu (Clorox) içeren bir çözüm için tohum 30 saniye bekletin. Tohumları 3-6 kez steril su ile durulayın. Her MS (Kanamisin) plaka üzerine pipet yaklaşık 5000 tohumlar, steril kaput, Micropore 3M bant ile kirlenmesini önlemek amacıyla plakaları, plaka üzerinde eşit tohum yayıldı.
- 4 plakaları inkübe ° C, 3-4 gün boyunca karanlıkta, sonra bir odaya (aynı bitki büyüme odası olabilir) plakaları aktarmak. Yaklaşık 14 gün sonra, transgenik fide yeşil kalır ama transgenik olmayan soluk dönüm ve ölüyor. Yavaşlama orta kökleri dışarı çekerek ve toprağın yerleştirdiler transgenik fideler toprağa aktarın.
II. PTSO2 incelenmesi: GUS ekspresyonu
- Hasat pTSO2: GUS transgenik fide ve% 90 aseton, bir bardak sintilasyon flakon veya mikrofuge'de tüpleri soğuk koyunbuz üzerinde tutulur. Biri büyük bir sayıda numune analiz eğer Polistiren microtiter plakalar (polipropilen) de kullanılabilir.
- Tüm örnekler hasat sonra, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında şişeleri. Bu süre zarfında x-Gluc (% 0.2 Triton X-100, 50mm NaHPO 4 Tampon pH7.2, 2mm Potasyum Ferrocyanide, 2mm Potasyum ferrisiyanür) ve buz üzerinde yer olmadan taze boyama tampon oluşturur.
- Örneklerden aseton çıkarın ve boyama tamponu ekleyin.
- X-Gluc boyama solüsyonu (% 0.2 Triton X-100, 50mm NaHPO 4 Tampon pH7.2, 2mm Potasyum Ferrocyanide, 2mm potasyum ferrisiyanür, 2mm x-gluc) olun. Örneklerinden boyama tamponu çıkarın ve x-Gluc örnekleri içeren boyama tamponu ekleyin.
- 15 ila 20 dakika arasında bir vakum altında örnekleri Infiltrate. Vakum yavaşça serbest bırakın ve tüm örnekleri boyama çözüm yüzeyin altında lavabo doğrulamak. Gerekirse vakum yayımlandıktan sonra, tüm örneklerde lavaboya kadar infiltrasyon tekrarlayın.
- 37 inkübe örnekleri ° C x-Gluc boyama tampon geceleme.
- Inkübatör örnekler çıkarın ve boyama tamponu çıkarın. Her değişiklik için 30 dakika oda sıcaklığında (% 20,% 35 ve% 50 etanol), ardışık etanol serisi örnekleri yıkayın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika içinde FAA fiksatif (% 50 Etanol,% 5 Formaldehit,% 10 asetik asit, geri kalanı su) dokuların sabitleyin. FAA çıkarın ve% 70 etanol ekleyin. Bu noktada dokuların görüntülendi olabilir ve bir dijital kamera ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu altında fotoğraflandı. TSO2 (Şekil 1) ifade edilir, koyu mavi renk gösterir . Alternatif olarak, dokuların, 4 ° C daha sonra izlenmek üzere saklanabilir.
Şekil 1 pTSO2:: GUS transgenik fidan ifade (A), yan kök (B), ve kök ucu (C). TSO2 organizatörü, genç ve bölme dokularda son derece aktif olduğunu unutmayın . (C) gösterilen sporadik ifade deseni, belirli bir hücre döngüsü evreleri olarak ifade genlerin tipik bir örneğidir.
Temsilcisi Sonuçlar
Doğru bir şekilde yapılırsa, dönüşüm verimliliği yaklaşık% 0.1-0.2 olmalıdır. Başka bir kelime, bir, 5000 tohum eleme 5-10 transgenik fide almalısınız. Ortalama, yaklaşık 100 transgenik çizgileri vahşi tip bitkiler 4 tencere dönüştürerek elde edilebilir.
Için pTSO2 içeren transgenik fide: GUS inşa 3, GUS faaliyet yansıtan koyu mavi renk, genç yaprak, sürgün apeks, kök ucu ve lateral kök primordia (Şekil 1) de dahil olmak üzere aktif olarak bölünen hücreleri bulunur . Üniform olmayan sporadik desen hücre döngüsü faz-spesifik ifade karakteristik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dönüşüm verimliliği aşağıda tartışılmıştır çok farklı faktörler tarafından belirlenir:
- Birincil öneme sahip bitkilerin sağlık ve yaşlarına. Üreten çok sayıda olgunlaşmamış çiçek tomurcukları yaklaşık bir aylık bitkiler idealdir. Dönüşüm ikincil ateş oluşumu 3-4 gün önce teşvik etmek birincil sürgünler kapalı Kırpma dönüşüm verimliliği artacaktır. Önceki bitkiler transformants doğuran, ancak daha düşük bir oranda.
- Bitkilerin Doğurganlık önemlidir. Doğurganlık azalmış mutantlar dönüştürmek için varsa, daha bir çok bitki daldırma için gerekli olacaktır.
- Infiltrasyon tampon% 0.3 Silwet L-77 sürfaktan temel olarak kabul edilir.
- Daldırma infiltrasyon medya zaman, en az 5 dakika olmalıdır.
- Mantar kontaminasyonu azaltmak için çeşitli önlemler alınmalıdır. İlk olarak, bir bitki / toprak infiltrasyon bir gün önce sulama infiltrasyonu medya iliklerine kadar toprak kaçınmak gerekir. Batığın infiltrasyon medya toprak etmeyin. İkincisi, infiltrasyon nemi azaltmak için plastik kapak ve kağıt havlu sonra 24 saat içinde çıkarın. Üçüncü olarak, su bitkileri infiltrasyon 5 gün sonrasına kadar yoktur.
Belirli bir plazmid inşa bağlı olarak, transgenik bitkilerin seçimi yöntemleri değişebilir. Plazmid vektör amonyum glufosinate Bar (bialaphos asetiltransferaz) işaretleyici gen, tartışmaya açık direniş devam ederse, bir tohum herhangi bir sterilizasyon olmadan doğrudan topraktaki tohumlar bitki. Bir sonra spreyler 1:1000 sulandırılmış glufosinate amonyum (ticari adı: Finale, Özgürlük, ya da Ignite) fide birkaç günde bir kez dayanıklı fide seçmek için.
GUS boyama, buz üzerinde aseton doku hasat ve herhangi bir zarar görmesini önlemek için tüm çözümler soğuk tutmak için önemlidir. X-Gluc olan ve olmayan boyama tamponlar, her bileşen için stok solüsyonu (aşağıya bakın) ve vaktinden önce saklanan olabilir rağmen, taze yapılacak gerekiyor. Potasyum Ferrocyanide ve ferrisiyanür toksik ve bakım ile ele alınmalıdır. Buna ek olarak, 37 ° C'de 1-2 gün daha uzun süre X-Gluc boyama tampon doku ve / veya boyama desen bozulmaya başlaması nedeniyle uzun inkubasyon sırasında çok diffüz olabilir doku inkübe için önemlidir . Son olarak, yüksek demirli ve ferrosiyanat konsantrasyonları genel olarak daha az boyanma seviyesi, ancak daha fazla özgüllük verir. 2mm X-Glux çoğu uygulama için iyi çalışır, ancak konsantrasyonları belli ihtiyaçlar için ayarlanabilir gerekebilir. X-Gluc pahalıdır. Boyama minimal cilt olarak yapılmalıdır.
Vaktinden önce yapılabilir Stok çözümleri:
% 10 Triton X-100 (birkaç ay boyunca oda sıcaklığında saklanan)
0.5 M NaHPO 4 Buffer (pH7.2) (birkaç ay boyunca oda sıcaklığında saklanan)
100 mM potasyum Ferrocyanide (4 karanlıkta ° C'de birkaç ay için)
100 mM potasyum ferrisiyanür (4 karanlıkta saklayın ° C'de birkaç ay için)
100 mM X-Gluc (5-bromo-4-kloro-3-indolyl β-D-glukuronid cyclohexamine tuz) Dimethylformamide (DMF) yapılan ve folyo sarılı tüplerde -20 ° C saklanır. Bu birkaç ay sürer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
GUS GUS-kusursuz bir protokol, Paja Sijacic ve Courtney Hollender paylaşımı için yararlı yorum ve Şekil 1, Detlef Weigel fotoğraflar için: Biz Chunxin Wang pTSO2 inşa için teşekkür ederiz . Z. L s laboratuvarda Araştırma, ABD Ulusal Bilim Vakfı (IOB0616096 ve MCB0744752) tarafından desteklenmektedir. ZL, Maryland Zirai Araştırma İstasyonu Üniversitesi tarafından kısmen destekleniyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzyladenine | Sigma-Aldrich | 852430 | |
| Silwet-77 | Crompton Corp. | Toxic, wear gloves | |
| Murashige and Skoog Basal medium (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| Gamborg’s vitamin solution 1000X | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt | Biosynth International, Inc | B-7300 | Toxic, light sensitive keep in the dark |
| Micropore 3M Tape | Fisher Scientific | 19027761 |
References
- Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).
- Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).
