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Biology

पुष्प डुबकी परिवर्तन Arabidopsis thaliana जांच करने के लिए PTSO2:: बीटा glucuronidase रिपोर्टर जीन एक्सप्रेशन

doi: 10.3791/1952 Published: June 11, 2010

Summary

इस अनुच्छेद के पुष्प स्नान की विधि दिखाता है

Abstract

एक जीव में विदेशी जीन परिचय करने की क्षमता आधुनिक जीवविज्ञान और जैवप्रौद्योगिकी के लिए नींव है. मॉडल फूल पौधे

Protocol

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I. Arabidopsis thaliana के परिवर्तन डुबकी पुष्प

  1. लगभग 1 महीने पहले परिवर्तन करने के लिए, 4 से 8 बर्तन (5 इंच वर्ग के बर्तन) पर बर्तन प्रति लगभग 10-15 पौधों के साथ Arabidopsis बीज बोना. सामान्य उर्वरता के साथ पौधों के लिए, प्लाज्मिड का निर्माण प्रति पौधों की 4 बर्तन पर्याप्त होगा. यदि एक प्रजनन क्षमता में कमी के साथ उत्परिवर्ती Arabidopsis को बदलने के लिए है, तो तदनुसार बर्तन की संख्या में वृद्धि.
  2. पौधों मानक स्थितियों (16 घंटा प्रकाश और 22 में 8 अंधेरे घंटा ° सी) के तहत बड़े हो रहे हैं. यदि पौधों को कम दिन या कम तापमान के तहत बड़े हो रहे हैं, वे अब फूल और अब लेने के परिवर्तन के लिए तैयार हो जाएगा. अच्छा संयंत्र की देखभाल स्वस्थ पौधों, जो सफल परिवर्तन के लिए आवश्यक हैं यह सुनिश्चित करेंगे.
  3. जब पौधों बस bolted और फूल करने के लिए शुरू कर दिया है. वे अब कर रहे हैं परिवर्तन के लिए तैयार हैं. परिवर्तन दक्षता बढ़ाने के लिए, परिवर्तन से पहले 3-4 दिन से मुख्य पुष्पक्रम शूटिंग के रूप में जल्द ही के रूप में वे और अधिक माध्यमिक गोली मार गठन को प्रोत्साहित करने के लिए bolted है ट्रिम. जल संयंत्रों परिवर्तन के पहले दिन. यह सुनिश्चित करता है कि मिट्टी फूलों की सूई के दौरान बहुत ज्यादा मीडिया की घुसपैठ नहीं लेना होगा.
  4. Agrobacterium tumefaciens तनाव GV3101 pTSO2 ले जाने के साथ: (गस, 50 μg / मिलीलीटर Kanamycin: pTSO2 के मामले में): दो दिन पहले परिवर्तन करने के लिए, 40ml उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त लेग टीका लगाना: गस निर्माण . pTSO2:: गस pBIN20 सदिश है कि NPTII जीन है कि 3 Kanamycin प्रतिरोध प्रदान पास में क्लोन है . रातोंरात एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 28-30 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें
  5. अगले दिन, 50 Kanamycin μg मिलीलीटर / युक्त लेग की 400ml में रातोंरात संस्कृति के हस्तांतरण 8ml. रातोंरात एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 28-30 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें
  6. परिवर्तन के दिन, जब Agrobacterium संस्कृति के 600 आयुध डिपो लगभग 0.8 (आयुध डिपो to1 0.5 के बीच 600 स्वीकार्य हैं) तक पहुँचता है, 5000rpm पर 8 मिनट के लिए नीचे Agrobacterium रातोंरात संस्कृति स्पिन.
  7. Agrobacterium गोली (लीटर) 1 एल में घुसपैठ मीडिया (10mm MgCl 2, 5% sucrose, 0.44mM benzyladenine 6 (बीए), 0.3% L-77 silwet, 1x Gamborg विटामिन समाधान और autoclaved पानी). Resuspend माध्यम से autoclaved हो की जरूरत नहीं है, लेकिन ताजा किया जा जरूरत है. एक डिश (जैसे के रूप में 8 "x15" x2 "Pyrex कांच पकवान) में 1 एल घुसपैठ Agrobacterium युक्त मध्यम डालो.
  8. बर्तन उलटें (पौधों से नहीं गिर जाएगी) और घुसपैठ समाधान में पौधों की सभी हवाई भागों डुबकी, एक समय में 5 मिनट एक बर्तन के लिए पकड़. जबकि संयंत्र के सभी हवाई भागों घुसपैठ मध्यम में डूब रहे हैं, दे मिट्टी घुसपैठ मीडिया के किसी भी सोख करने के लिए धरती पर कवक विकास की संभावना को कम करने से बचें.
  9. सूई के बाद, कागज तौलिया के कई परतों पर एक ट्रे में उनके पक्ष में सभी डूबा बर्तन जगह. कागज तौलिए घुसपैठ मीडिया के उपयोग की राशि लेना. प्लास्टिक की चादर के साथ उच्च आर्द्रता सुनिश्चित ट्रे कवर. पौधों की वृद्धि के चेंबर में ट्रे प्लेस.
  10. अगले दिन पर, प्लास्टिक लपेटो और कागज तौलिये, और जगह बर्तन ईमानदार हटा दें. चार से पांच दिनों के लिए इन पौधों को पानी नहीं है. बाद में, पौधों को सामान्य बनाए रखने के लिए जब तक वे बीज सेट और थोक में बीज इकट्ठा.
  11. एमएस मध्यम 50 μg / मिलीलीटर Kanamycin (वजन 2.2g Murashige युक्त और विटामिन के बिना बेसल नमक Skoog के साथ प्लेटें (150x15mm पेट्री डिश) डालो, 5,8 करने के लिए 500 मिलीलीटर पानी, पीएच में 1M NaOH के साथ भंग, 4 ग्राम अगर, आटोक्लेव, शांत और जोड़ने 50 μg / एमएल अंतिम एकाग्रता Kanamycin जोड़ने). प्लेट्स 4 में रखा जाता है डिग्री सेल्सियस जब तक की जरूरत है.
  12. एंटीबायोटिक प्रतिरोधी ट्रांसजेनिक पौधों के लिए चयन करने के लिए, कम से कम 20,000 बीज स्क्रीन की जरूरत है. 0.1 ग्राम के बारे में 5000 बीज है. वजन और बीज की मात्रा का अनुमान.
  13. बीज को 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में उन्हें 30 सेकंड के लिए 70% इथेनॉल के साथ धो जीवाणुरहित. बाँझ पानी के साथ बीज एक बार धोएं. 30 सेकंड के लिए एक दुकान खरीदा 5% ब्लीच (Clorox) के कमजोर पड़ने 1:10 युक्त समाधान में बीज भिगोएँ. साथ बाँझ पानी तीन से छह बार बीज कुल्ला. बाँझ हुड, पिपेट प्रत्येक एमएस प्लेट (Kanamycin) पर के बारे में 5000 बीज, बीज समान रूप से थाली पर फैल micropore 3M टेप के साथ प्लेटों को सील करने के लिए संक्रमण से बचने.
  14. 4 में प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस 3-4 दिनों के लिए अंधेरे में, तो एक कक्ष (एक ही संयंत्र विकास चैम्बर हो सकता है) प्लेटें हस्तांतरण. के बारे में 14 दिनों के बाद, ट्रांसजेनिक seedlings हरा रहने पर गैर ट्रांसजेनिक लोगों को पीला मोड़ रहे हैं और मरने. मिट्टी में धीमा जड़ों के माध्यम से बाहर खींच और उन्हें मिट्टी में रखा ट्रांसजेनिक seedlings स्थानांतरण.

द्वितीय. जांच pTSO2:: गस अभिव्यक्ति पैटर्न

  1. PTSO2 हार्वेस्ट:: गस ट्रांसजेनिक seedlings और उन्हें एक गिलास जगमगाहट शीशी या microfuge ट्यूब में ठंडा एसीटोन 90% में जगहकि बर्फ पर रखा जाता है. Polystyrene microtiter प्लेटें (नहीं polypropylene) भी अगर एक नमूने की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण किया जा सकता है.
  2. सभी नमूनों के बाद harvested रहे हैं, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए शीशियों जगह. इस समय के दौरान (0.2% ट्राइटन x-100, 50mm NaHPO 4 बफर pH7.2, ferricyanide 2mm पोटेशियम Ferrocyanide, 2mm पोटेशियम) एक्स - Gluc और बर्फ पर जगह के बिना ताजा धुंधला बफर बनाने .
  3. नमूनों से एसीटोन निकालें और धुंधला बफर जोड़ने.
  4. एक्स - Gluc धुंधला समाधान की (0.2% ट्राइटन ferricyanide X-100, 50mm NaHPO 4 pH7.2 बफर, 2mm पोटेशियम Ferrocyanide, 2mm पोटेशियम, 2mm एक्स gluc) बनाओ . नमूनों से धुंधला बफर निकालें और धुंधला नमूने के एक्स - Gluc युक्त बफर जोड़ें.
  5. 15 से 20 मिनट के लिए एक वैक्यूम के तहत नमूने घुसपैठ. वैक्यूम रिलीज धीरे धीरे और सत्यापित करें कि सभी नमूनों धुंधला समाधान की सतह के नीचे सिंक. यदि आवश्यक हो, सभी नमूनों सिंक तक घुसपैठ दोहराने के बाद वैक्यूम जारी है.
  6. पर सेते नमूने 37 डिग्री सेल्सियस के साथ-x Gluc धुंधला बफर में रातोंरात.
  7. इनक्यूबेटर से नमूने निकालें और धुंधला बफर हटायें. लगातार इथेनॉल श्रृंखला में नमूनों धो (20%, 35% और 50% इथेनॉल) 30 मिनट प्रत्येक परिवर्तन के लिए कमरे के तापमान पर.
  8. FAA लगानेवाला में (50% इथेनॉल, Formaldehyde 5%, 10% एसिटिक एसिड, बाकी पानी) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ऊतकों को ठीक करें. FAA निकालें और 70% इथेनॉल जोड़ें. इस बिंदु पर ऊतकों और visualized किया जा सकता है एक विदारक एक डिजिटल कैमरा के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के तहत फोटो खिंचवाने. एक गहरे नीले रंग इंगित करता है जहाँ TSO2 व्यक्त किया है (चित्रा 1 ). वैकल्पिक रूप से, ऊतकों ° बाद में देखने के लिए सी 4 में संग्रहीत किया जा सकता है है.

    चित्रा 1
    चित्रा 1 pTSO2:: गस में ट्रांसजेनिक seedlings अभिव्यक्ति (A), पार्श्व जड़ों (बी), और जड़ टिप (सी). ध्यान दें कि TSO2 प्रमोटर युवा और विभाजन के ऊतकों में अत्यधिक सक्रिय है . (सी) में दिखाया गया है छिटपुट अभिव्यक्ति पैटर्न विशिष्ट कोशिका चक्र के चरणों में व्यक्त जीनों की विशिष्ट है.

प्रतिनिधि परिणाम

जब सही ढंग से किया, परिवर्तन दक्षता लगभग 0.1-0.2% होना चाहिए. एक शब्द में, एक हर 5000 बीज स्क्रीनिंग 5-10 ट्रांसजेनिक seedlings मिलना चाहिए. औसत पर, के बारे में 100 ट्रांसजेनिक लाइनों जंगली प्रकार के पौधों की चार बर्तन को बदलने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

ट्रांसजेनिक pTSO2 युक्त seedlings: गस 3 का निर्माण, गहरे नीले रंग गस गतिविधि को दर्शाती सक्रिय रूप से युवा पत्तियों, शूट सुप्रीम, जड़ टिप, और पार्श्व रूट primordia (चित्रा 1) सहित विभाजित कोशिकाओं में पाया जाता है. गैर वर्दी छिटपुट पैटर्न कोशिका चक्र चरण विशिष्ट अभिव्यक्ति की विशेषता है.

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Discussion

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परिवर्तन की क्षमता कई अलग अलग कारक है, जो नीचे चर्चा कर रहे हैं द्वारा निर्धारित किया जाता है:

  1. पौधों के स्वास्थ्य और उनकी उम्र के प्राथमिक महत्व के हैं. लगभग एक महीने पुराने कई अपरिपक्व पुष्प कलियों उत्पादन संयंत्रों के लिए आदर्श हैं. बंद ट्रिमिंग करने वाली प्राथमिक शूटिंग परिवर्तन से पहले माध्यमिक गोली मार गठन 3-4 दिनों के लिए प्रोत्साहित परिवर्तन दक्षता में वृद्धि होगी. वृध्द पौधों वृद्धि transformants दे, लेकिन एक कम दर पर होगा.
  2. पौधों की फर्टिलिटी महत्वपूर्ण है. यदि एक प्रजनन क्षमता में कमी के साथ म्यूटेंट परिणत है, एक बहुत अधिक पौधों की सूई के लिए की जरूरत होगी.
  3. घुसपैठ बफर में 0.3% Silwet एल 77 surfactant आवश्यक माना जाता है.
  4. घुसपैठ मीडिया में समय की सूई में कम से कम 5 मिनट किया जाना चाहिए.
  5. कवक संदूषण को कम करने के लिए, कई सावधानियों लिया जाना चाहिए. सबसे पहले, एक पौधों / मिट्टी घुसपैठ के एक दिन पहले पानी से घुसपैठ मीडिया भिगोने से मिट्टी से बचने की जरूरत है. डूब घुसपैठ मीडिया में मिट्टी मत करो. दूसरा, 24 घंटे के भीतर नमी कम घुसपैठ के बाद प्लास्टिक कवर और कागज तौलिया हटा दें. तीसरा, पानी पौधों घुसपैठ के बाद 5 दिनों तक नहीं है.

विशिष्ट प्लाज्मिड का निर्माण पर निर्भर करता है, ट्रांसजेनिक पौधों का चयन तरीकों भिन्न हो सकते हैं हैं. यदि एक प्लाज्मिड वेक्टर (bialaphos acetyltransferase) बार मार्कर जीन प्रदान प्रतिरोध करने के लिए अमोनियम glufosinate किया जाता है, एक सीधे बीज की किसी भी नसबंदी के बिना मिट्टी में बीज संयंत्र कर सकते हैं. तो एक स्प्रे 1:1000 पतला glufosinate अमोनियम (वाणिज्यिक नाम: समापन, लिबर्टी, या प्रज्वलित) के साथ seedlings हर कुछ दिनों एक बार प्रतिरोधी seedlings के लिए चयन करने के लिए.

गस धुंधला के लिए, यह महत्वपूर्ण है बर्फ पर एसीटोन में ऊतक फसल और सभी समाधान के लिए किसी भी गिरावट से बचने ठंडे रहते हैं. के साथ और बिना एक्स Gluc धुंधला बफ़र्स के लिए ताजा बना हो सकता है, हालांकि प्रत्येक घटक के लिए स्टॉक समाधान किया जा सकता है समय से आगे संग्रहीत (नीचे देखें) की जरूरत है. Ferrocyanide पोटेशियम और ferricyanide विषाक्त कर रहे हैं और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, यह महत्वपूर्ण है कि 37 में ऊतक नहीं सेते ° सी 1-2 दिनों से अधिक समय के लिए एक्स Gluc के साथ धुंधला हो जाना बफर में है क्योंकि ऊतक और / या धुंधला पैटर्न बिगड़ना शुरू कर सकते हैं भी फैलाना लंबे समय incubations के दौरान हो सकता है . अंत में, उच्च Ferri और ferrocyanide सांद्रता कम समग्र धुंधला स्तर है, लेकिन अधिक विशिष्टता दे. 2mm एक्स Glux सबसे अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन कुछ जरूरतों के लिए समायोजित किया जा सांद्रता की आवश्यकता हो सकती है. एक्स - Gluc महंगा है. धुंधला हो जाना कम से कम मात्रा में बाहर किया जाना चाहिए.

स्टॉक समाधान है कि समय से आगे बनाया जा सकता है:

10% Triton एक्स 100 (कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित)
0.5 एम NaHPO 4 (pH7.2) बफर (कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित)
100 मिमी पोटेशियम Ferrocyanide (4 अंधेरे में दुकान डिग्री सेल्सियस कई महीनों के लिए)
100 मिमी पोटेशियम ferricyanide (4 अंधेरे में स्टोर डिग्री सेल्सियस कई महीनों के लिए)
100 मिमी x Gluc (5 ब्रोमो - 4 क्लोरोफ्लूरोकार्बन 3 indolyl β-डी glucuronide cyclohexamine नमक) Dimethylformamide (DMF) में किया जाता है और टिनफ़ोइल लिपटे ट्यूबों में -20 ° सी में संग्रहीत. यह कई महीनों के लिए रहता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम Chunxin वांग pTSO2 निर्माण करने के लिए धन्यवाद: गस और उपयोगी टिप्पणी के लिए प्रोटोकॉल गस आसान, Paja Sijacic, और कोर्टनी Hollender साझा करने के लिए चित्रा 1, Detlef Weigel में तस्वीरों के लिए. जेड एस एल प्रयोगशाला में अनुसंधान अमेरिका के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IOB0616096 और MCB0744752) द्वारा समर्थित है. ZL आंशिक रूप से मैरीलैंड कृषि प्रयोग स्टेशन के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-benzyladenine Sigma-Aldrich 852430
Silwet-77 Crompton Corp. Toxic, wear gloves
Murashige and Skoog Basal medium (MS) Sigma-Aldrich M5519
Gamborg’s vitamin solution 1000X Sigma-Aldrich G1019
X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt Biosynth International, Inc B-7300 Toxic, light sensitive keep in the dark
Micropore 3M Tape Fisher Scientific 19027761

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References

  1. Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
  2. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, (6), 735-735 (1998).
  3. Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18, (2), 350-350 (2006).
पुष्प डुबकी परिवर्तन<em> Arabidopsis thaliana</em> जांच करने के लिए<em> PTSO2:: बीटा glucuronidase</em> रिपोर्टर जीन एक्सप्रेशन
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Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::β-glucuronidase Reporter Gene Expression. J. Vis. Exp. (40), e1952, doi:10.3791/1952 (2010).More

Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::β-glucuronidase Reporter Gene Expression. J. Vis. Exp. (40), e1952, doi:10.3791/1952 (2010).

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