Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

フローラルディップ変換のシロイヌナズナ調べに pTSO2::β-グルクロニダーゼレポーター遺伝子発現

doi: 10.3791/1952 Published: June 11, 2010

Summary

この記事はのフローラルディップ法を示しています。

Abstract

生物に外来遺伝子を導入する能力は、現代生物学とバイオテクノロジーの基盤となります。モデルの顕花植物の

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I.フローラルディップシロイヌナズナの形質転換

  1. 変換の前に約1ヶ月、ポット当たり約10〜15工場で4〜8ポット(5インチ平方のポット)にシロイヌナズナの種子をまく。正常な受精能を持つ植物のために、プラスミド構築あたりの植物の4鉢で十分です。一低受精率と変異体シロイヌナズナを変換する必要がある場合、それに応じてポットの数を増やす。
  2. 植物は標準条件(16時間明、22℃で暗所8時間)で栽培されています。植物が短い日またはより低い温度下で栽培されている場合、それらは変換の準備をして花と長い時間がかかるようになります。良い植物の世話は、成功した変換のために不可欠な健全な植物を、保証されます。
  3. 植物は、単にボルトで固定し、花に始めているときに。彼らは今、変革のための準備が整いました。形質転換効率、変換前の3-4日を増やすために、可及的速やかに多くの二次シュート形成を促進するためにボルトで固定しているとして、主花序の枝を切り落とす。植物形質転換の前日に水。これは土が花、浸漬の間にあまり浸透メディアを吸収しないことが保証されます。
  4. アグロバクテリウムツメファシエンス菌株GV3101はpTSO2を運んで:(GUS、50μg/ mlのカナマイシン:pTSO2の場合):2日前の変換に、適切な抗生物質を含む40ミリリットルLBに接種する:GUSコンストラクトpTSO2::GUSはカナマイシン3に抵抗性を付与するNPTII遺伝子を有するpBIN20ベクターにクローン化されています。 28〜30℃の振盪インキュベーターで一晩成長
  5. 翌日、50μg/ mlのカナマイシンを含むLBの400ミリリットルに一晩培養の転送8ミリリットル。 28〜30℃の振盪インキュベーターで一晩成長
  6. 変革の日に、 アグロバクテリウム培養のOD 600が約0.8(0.5 TO1の間にOD 600が許容される)に達すると、5000rpmで8分間でアグロバクテリウム一晩培養をスピンダウン。
  7. 浸透培地1 L(リットル)(10mMのMgCl 2を 、5%スクロース、0.44mM 6 -ベンジルアデニン(BA)、0.3%シルウェットL - 77、1X Gamborgのビタミン溶液とオートクレーブ水)にアグロバクテリウムペレットを再懸濁する。培地はオートクレーブする必要がありますが、新鮮させる必要がありますされません。料理(8など"X15"X2"パイレックスガラス皿)に1 L アグロバクテリウムを含有する浸透の培地を注ぐ。
  8. ポットを反転させる(植物が落ちることはありません)と浸透溶液中に植物のすべての地上部を浸し、一度に5分ワンポットのために保持する。植物のすべての地上部が浸透媒体に浸漬されていますが、土壌は土壌に真菌の増殖の可能性を減らすために浸透のメディアのいずれかを吸収させることは避けてください。
  9. 浸漬した後、トレイにペーパータオルのいくつかの層に彼らの側にあるすべての浸漬ポットを置きます。ペーパータオルは、浸潤のメディアのアクセスの量を浴びる。高湿度を確保するためにプラスチック製のラップとトレイをカバーしています。植物の成長室にトレイを置きます。
  10. 次の日に、直立ラップと紙タオル、と場所の鉢を削除します。四から五日以上の水、これらの植物をしないでください。その後、彼らは種を設定するまで、通常の植物を維持し、大量の種子を収集する。
  11. 4グラムのクールな寒天、オートクレーブ、およびを追加、1M NaOHで5.8に水500ml、pH値で溶解、MS培地は、50μg/ mlのカナマイシン(重量2.2グラムムラシゲを含有し、ビタミンなしで基礎塩をスクーグとプレート(150x15mmペトリ皿を)注ぐ50μg/ mlの最終濃度)にカナマイシンを加える。必要とされるまでプレートを4℃に保管されています。
  12. 抗生物質耐性トランスジェニック植物のために選択するためには、最小で20,000種をスクリーニングする必要があります。 0.1グラムは約5000種です。重さと種子の量を見積もる。
  13. 30秒間70%エタノールで15 mlのFalconチューブ中でそれらを洗うことで種子を滅菌する。一度滅菌水で種を洗ってください。市販の5%の漂白剤(クロロックス)の1:10希釈液を含む溶液中で30秒間の種子を浸す。滅菌水で3〜6倍と種子をすすぎます。無菌フードでは、各MS(カナマイシン)プレート上にピペット約5000種が、汚染を避けるために細孔3Mテープでプレートをシールし、プレート上に均一に種を広げる。
  14. 4でプレートをインキュベート° Cで3〜4日間暗所で、その後、チャンバー(同じ植物の成長チャンバーかもしれない)にプレートを転送する。約14日後、トランスジェニック実生は緑色のままですが、非トランスジェニックものは薄いと死んで回っている。減速は、培地から根を引き抜いて、土壌にそれらを配置することにより土壌へのトランスジェニック苗を移す。

II。調べるpTSO2::GUSの発現パターン

  1. 収穫pTSO2::GUSトランスジェニック苗やガラスシンチレーションバイアルやマイクロチューブに冷90%アセトン中に置いてくださいそのは、氷上で保存されています。いずれかの大量のサンプルを分析する場合ポリスチレンマイクロタイタープレート(ではないポリプロピレン)を使用することもできます。
  2. すべてのサンプルが採取された後、20分間室温でバイアルを置きます。この時間の間にX - Gluc(0.2%トリトンX - 100、50mmのNaHPO 4緩衝液pH7.2、2mMのフェロシアン化カリウム、2mmのフェリシアン化カリウム)と氷上に置きますなく新鮮な染色バッファーを構成しています。
  3. 試料からアセトンを除去し、染色バッファーを追加します。
  4. X - Gluc染色液(0.2%トリトンX - 100、50mmのNaHPO 4緩衝液pH7.2、2mmのフェロシアン化カリウム、2mmのフェリシアン化カリウムの2mm x - gluc)を構成します。サンプルから染色バッファーを取り除き、試料にX - Glucを含む染色バッファーを追加します。
  5. 15〜20分間真空下で試料を浸潤する。徐々に真空を解放し、すべてのサンプルは、染色液の表面の下に沈むことを確認してください。必要に応じて真空が解放された後、すべてのサンプルのシンクまで浸潤を繰り返します。
  6. 37インキュベートサンプル℃でX - Glucと染色バッファーで一晩。
  7. インキュベーターからサンプルを取り出して、染色バッファーを除去する。各変更室温で30分間連続するエタノールシリーズ(20%、35%、50%エタノール)でサンプルを洗浄する。
  8. 室温で30分間FAA固定液(50%エタノール、5%のホルムアルデヒド、10%酢酸、残りの水)で組織を修正。 FAAを削除し、70%エタノールを加える。この時点で組織を可視化し、デジタルカメラを搭載した解剖顕微鏡下で撮影することができます。 TSO2が (図1)に発現されている場所濃い青色を示します。また、組織を° C後で表示するために4℃で保存することができます。

    図1
    図1 pTSO2:。:トランスジェニック実生におけるGUS発現()、側根(B)、および根端(C)。 TSO2プロモーターが若いと割って組織中の高活性であることに注意してください。 (C)に示すように散発的な発現パターンは、特定の細胞周期の段階で発現する遺伝子の典型です。

代表的な結果

正しく行われると、形質転換効率は約0.1から0.2パーセントにする必要があります。別の言葉で、人はすべての5000種をスクリーニングすることにより、50〜10トランスジェニック実生を得る必要があります。平均で、約100トランスジェニック系統は、野生型植物の4鉢を変換することによって得ることができます。

:pTSO2を含有するトランスジェニック実生の場合:GUSコンストラクト3、GUS活性を反映して濃い青の色は若い葉、茎頂、根端、及び側根の原基(図1)を含めて積極的に分裂細胞に含まれています。不均一な散発的なパターンは、細胞周期段階特異的発現の特徴です。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

形質転換の効率は以下に説明されているさまざまな要素によって決定されます。

  1. 植物の健康と自分の年齢が最も重要です。多数の未熟な花芽を生産する約1ヵ月の古い植物は理想的です。変換する前に二次シュート形成3-4日奨励するために、主枝をオフにトリミング形質転換効率を向上します。古い植物は、形質転換することではなく、より低いレートで上昇を与える。
  2. 植物の生殖能力は重要です。一低受精率を有する変異体を変換する必要がある場合、多くの植物は、浸漬のために必要となります。
  3. 浸潤のバッファーに0.3%シルウェットL - 77界面活性剤が不可欠であると考えられる。
  4. 浸潤のメディアに時間を浸漬することは、少なくとも5分にしてください。
  5. 真菌汚染を減らすために、いくつかの注意が必要。最初に、人は植物/土壌浸透前日の水遣りで浸透メディアを浸すから土壌を避ける必要があります。水没浸潤のメディアで土壌をしないでください。第二に、湿気を減らすために浸透した後、24時間以内にプラスチック製のカバーと紙タオルを削除してください。第三に、水生植物は、浸透後の5日間まではしないでください。

特定のプラスミド構築物に応じて、トランスジェニック植物の選択方法が異なる場合があります。プラスミドベクターは、アンモニウムをグルホシネートに対する耐性を付与するバー(アセチルトランスフェラーゼビアラホス)マーカー遺伝子を運ぶ場合、一方は直接種子のあらゆる殺菌することなく土壌に種を植えることができる。 Oneその後、スプレーは、1:1000希釈グルホシネートアンモニウム(商品名:フィナーレ、リバティ、またはIgnite)と苗は一度数日ごとに耐性実生のために選択します。

GUS染色の場合、それは氷の上でアセトンで組織を採取し、あらゆる劣化を避けるために、すべてのソリューションは、寒さに保つことが重要S。 X - Glucがある場合とない場合の染色バッファは、各コンポーネントのストック溶液(下記参照)が作られ、事前に格納することができますが、新鮮させる必要があります。フェロシアン化カリウムとフェリシアン化は有毒であり、取り扱いには注意してください。組織が劣化し始めると/または染色パターンは、長いインキュベーション中あまりにも散漫になることができるため、さらに、それよりも長い1-2日間37 ° X - Glucと染色バッファでCで組織を培養することが重要s 。最後に、より高い積層フェリとフェロシアン化カリウム濃度は低く、全体的な染色のレベルが、より特異性を与える。 2mMのX - Gluxは、ほとんどのアプリケーションに適していますが、濃度が特定のニーズに合わせて調整する必要があります。 X - Glucは高価です。染色は最小限のボリュームで実施されるべきである。

事前に作ることができる株式のソリューション:

10パーセントトリトンX - 100(数ヶ月間、室温で保存)
0.5 M NaHPO 4緩衝液(pH7.2)(数ヶ月間、室温で保存)
100mMのフェロシアン化カリウム(4℃暗所で保管℃で数ヶ月間)
100mMのフェリシアン化カリウム(4℃暗所で保管℃で数ヶ月間)
100mMのX - Gluc(5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリルβ- D -グルクロニドcyclohexamine塩)ジメチルホルムアミド(DMF)で行い、アルミホイル、ラップチューブで-20℃に保存されます。それは数ヶ月続きます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgments

我々はpTSO2を構築するため純新王に感謝::GUSと図1の写真、デトレフワイゲル有益なコメントをGUS -フールプルーフプロトコル、Paja Sijacic、とコートニーホランダーを共有するための。 Z. Lの研究室の研究は米国国立科学財団(IOB0616096とMCB0744752)によってサポートされています。 ZLは部分的にメリーランド州農業試験場の大学によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-benzyladenine Sigma-Aldrich 852430
Silwet-77 Crompton Corp. Toxic, wear gloves
Murashige and Skoog Basal medium (MS) Sigma-Aldrich M5519
Gamborg’s vitamin solution 1000X Sigma-Aldrich G1019
X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt Biosynth International, Inc B-7300 Toxic, light sensitive keep in the dark
Micropore 3M Tape Fisher Scientific 19027761

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
  2. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, (6), 735-735 (1998).
  3. Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18, (2), 350-350 (2006).
フローラルディップ変換の<em>シロイヌナズナ</em>調べに<em> pTSO2::β-グルクロニダーゼ</em>レポーター遺伝子発現
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::β-glucuronidase Reporter Gene Expression. J. Vis. Exp. (40), e1952, doi:10.3791/1952 (2010).More

Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::β-glucuronidase Reporter Gene Expression. J. Vis. Exp. (40), e1952, doi:10.3791/1952 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter