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Biology

의 꽃 - 물놀이 변환 Arabidopsis thaliana 검사 pTSO2 : β - glucuronidase 리포터 유전자 발현

doi: 10.3791/1952 Published: June 11, 2010

Summary

이 문서의 꽃 - 수영 방법을 보여줍니다

Abstract

유기체로 외국 유전자를 도입하는 능력은 현대 생물학과 생명 공학에 대한 기초입니다. 모델 꽃 공장에서

Protocol

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I. 꽃 - 물놀이 Arabidopsis thaliana의 변화

  1. 이전 변환에 약 1 개월, 냄비에 약 10-15 식물 4-8 냄비 (5 인치 사각형 냄비)에 Arabidopsis 씨를 뿌리다. 정상 다산과 식물, 플라스미드 구조마다 식물의 4 냄비는 충분합니다. 하나는 감소 다산과 돌연변이 Arabidopsis를 변환하는 경우, 그에 따라 냄비의 수를 증가시킵니다.
  2. 식물은 표준 약관 (22 16 시간 조명과 어두운 8 시간 ° C)에서 재배하고 있습니다. 식물은 짧은 하루 더 낮은 온도 하에서 재배하는 경우, 그들은 변화를 위해 준비하는 꽃 이상으로 오래 걸립니다. 좋은 식물 관리는 성공적인 변화를위한 필수적인 건강한 식물을 보장합니다.
  3. 식물은 나올와 꽃으로 시작하는 경우. 그들은 지금 변화를위한 준비가되어 있습니다. 변환 효율을 향상시키기 위해, 3-4일 변환하기 전에, 곧 그들은 더 많은 보조 촬영 형성을 장려하기 위해 나올 필요로 메인 꽃이 핌 골인을 잘라. 식물 변환 전날 물. 이것은 토양이 꽃의 수영하는 동안 너무 많이 침투 미디어를 흡수하지 않을 보장합니다.
  4. Agrobacterium tumefaciens 변형 GV3101은 pTSO2를 들고와 (거스, 50 μg / ML Kanamycin : pTSO2의 경우) : 이틀 전에 변환하기 위해, 적절한 항생제를 포함한 40ml LB의 예방 : 거스는 건설. pTSO2 : : 거스는 Kanamycin 3 저항을 수여 NPTII 유전자를 가지고 pBIN20 벡터에 복제됩니다. 28-30 ° C.에 떨고 배양기에서 하룻밤 성장
  5. 그 다음날, 50 μg / ML Kanamycin이 포함된 LB의 400ml에 밤새 문화의 전송 8ml. 28-30 ° C.에 떨고 배양기에서 하룻밤 성장
  6. 변화의 날, Agrobacterium 문화의 OD 600 약 0.8 (0.5 to1 사이 OD 600 허용된다)에 도달하면, 5000rpm 8 분에서 Agrobacterium 야간 문화를 스핀 다운.
  7. 침투 미디어 1 L에있는 Agrobacterium 펠렛을 (리터) (10mM MgCl 2, 5 %의 자당, 0.44mM 6 benzyladenine (BA), 0.3 % silwet L - 77, 1X Gamborg의 비타민 솔루션과 autoclaved 물). Resuspend 매체 autoclaved해야하지만 신선한 만들 필요하지 않습니다. 접시 (예 : 8로 "x15"X2 "Pyrex 유리 접시)에 1 L Agrobacterium 함유 침투 매체를 붓고.
  8. 냄비 반전 (식물에서 떨어지지 않을 것이란)와 침투 솔루션에 식물의 모든 공중 부분을 찍어, 한 번에 한 오분 냄비 기다. 공장의 모든 항공 부분이 침투 매체에 열중하는 동안, 토양은 토양에 곰팡이 성장의 기회를 줄이기 위해 침투 미디어 중 하나를 흠뻑 젖어셔서 마십시오.
  9. 마른 후, 트레이에 종이 타월의 여러 레이어에서 자신의 측면에서 모든 담근 판돈을 놓으십시오. 종이 타올은 침투 미디어의 접근 금액을 만끽해보세요. 높은 습도를 보장하기 위해 플라스틱 포장으로 트레이를 다룹니다. 식물 성장 챔버에 트레이를 놓습니다.
  10. 다음날, 똑바로 플라스틱 랩, 종이​​ 수건, 장소의 냄비를 제거합니다. 4-5 더 많은 일 동안이 식물을 물을 마십시오. 이후, 그들은 씨앗을 설정할 때까지 정상적으로 식물을 유지하고 대량의 종자를 수집합니다.
  11. 4g의 멋진 한천, 압력솥, 그리고 추가 1M NaOH와 5.8-500 ML의 물, 산도에 용해, MS 매체가 50 μg / ML Kanamycin (중량 2.2g Murashige가 포함된 비타민없이 기초 소금을 Skoog와 함께 접시 (150x15mm 페트리 접시)을 부어 ) 50 μg / ML 최종 농도 Kanamycin를 추가합니다. 번호판이 필요 ° C까지 4 보관됩니다.
  12. 항생제 - 내성 유전자 변형 식물을 선택하기 위해, 하나는 최소한 20,000 씨앗을 화면으로 필요합니다. 0.1 그램은 약 5,000 씨앗입니다. 무게와 씨앗의 양을 예상됩니다.
  13. 30 초 동안 70 %의 에탄올과 15 ML 팰컨 튜브를 세척하여 씨를 소독. 한번 무균 물로 씨앗을 씻으십시오. 가게에서 구입 5 % 표백제 (Clorox)의 1시 10분 희석이 들어있는 용액에 30 초 동안 씨앗을 만끽해보세요. 멸균 물 3-6 시간을 씨를 린스. 무균 후드, 각 MS (Kanamycin) 플레이트에 피펫 5000에 대한 씨앗은 오염을 피하기 위해 Micropore 3M ​​테이프로 번호판을 봉인, 접시에 균일하게 씨앗을 확산.
  14. 4 번호판을 품어 ° C 3-4 일 동안 어둠 속에서, 다음 챔버 (같은 식물 성장 챔버 수)에 접시를 전송합니다. 약 14 일 후, 유전자 변형 모종 녹색 유지하지만 이외의 유전자 변형 것들은 창백 돌려 죽어 가고 있습니다. 둔화가 매체에서 뿌리를 철수하고 토양에서 그들을 배치하여 토양에 유전자 변형 묘목을 전송합니다.

II. pTSO2을 검토 : : 거스 표현 패턴

  1. 수확 pTSO2 : 거스 형질 전환 모종 및 유리 섬광 약병이나 microfuge 튜브의 감기 90 % 아세톤에 배치그것은 얼음에 보관됩니다. 한 샘플의 큰 숫자를 분석하는 경우 폴리스티렌 microtiter 플레이트 (안 폴리 프로필렌)도 사용할 수 있습니다.
  2. 모든 샘플이 채취 후 20 분 상온에서 튜브를 놓으십시오. 이 시간 동안 X - Gluc (0.2 % 트리톤 X - 100, 50mM NaHPO 4 버퍼 pH7.2, 2mM 칼륨 Ferrocyanide, 2mM의 칼륨 Ferricyanide)와 얼음에 장소없이 신선한 얼룩 버퍼를합니다.
  3. 샘플에서 아세톤을 제거하고 얼룩 버퍼를 추가합니다.
  4. X - Gluc 얼룩 솔루션 (0.2 % 트리톤 X - 100, 50mM NaHPO 4 버퍼 pH7.2, 2mM의 칼륨 Ferrocyanide, 2mM의 칼륨 Ferricyanide, 2mM X - gluc)를 구성합니다. 샘플에서 얼룩 버퍼를 제거하고 샘플을 X - Gluc을 포함하고있는 얼룩 버퍼를 추가합니다.
  5. 15-20분위한 진공 아래 샘플을 침투. 천천히 진공을 해제하고 모든 샘플이 얼룩 솔루션의 표면 아래 싱크되었는지 확인합니다. 필요한 경우 진공이 릴리스되면 모든 샘플 싱크까지 침투를 반복합니다.
  6. 37 품어 샘플 ° C X - Gluc와 얼룩 버퍼에 하룻밤.
  7. 인큐베이터에서 샘플을 제거하고 얼룩 버퍼를 제거합니다. 삼십분마다 변경 상온에서 (20 %, 35 % 및 50 % 에탄올) 연속 에탄올 시리즈의 샘플을 씻으십시오.
  8. 실온에서 30 분 FAA 정착액 (50 % 에탄올, 5 % 포름 알데히드 10 % 초산, 나머지 물)에 조직을 수정. FAA를 제거하고 70 % 에탄올을 추가합니다. 이 시점에서 조직은 시각 수 있으며 디지털 카메라가 장착된 해부 현미경 사진. TSO2가 (그림 1) 표현이 어디 진한 파란색 색상을 나타냅니다. 또한, 조직은 ° C 나중에 볼 수 있도록 4 저장할 수 있습니다.

    그림 1
    그림 1 pTSO2 :. : 유전자 변형 모종의 거스 표현 (A), 측면 뿌리 (B), 그리고 루트 팁 (C). TSO2 발기인은 젊은 분열 조직에서 매우 활성화되어 있습니다. (C)와 같이 산발적 표현식 패턴은 특정 세포주기의 단계에있는 유전자 표현의 전형이다.

대표 결과

제대로하면, 변환 효율은 약 0.1-0.2 %되어야합니다. 다른 단어에서, 하나는 모든 5,000 종자를 선별하여 50-10 형질 모종을해야합니다. 평균 약 100 유전자 변형 라인은 야생 형 식물의 4 냄비를 변환하여 얻을 수 있습니다.

에 대한 pTSO2를 포함하는 유전자 변형 모종 : 거스 구축 3, 거스 활동을 반영 진한 파란색 색상 어린 나뭇잎, 쏴, 아펙스, 루트 팁, 그리고 측면 루트 primordia (그림 1)을 포함하여 적극적으로 나누어 세포에서 발견된다. 비 균일한 산발적 패턴은 세포주기 단계 - 구체적인 표현의 특징입니다.

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Discussion

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변환 효율은 아래 설명하는 여러 가지 요인에 의해 결정됩니다 :

  1. 식물의 건강과 자신의 나이가 기본 중요합니다. 다수의 미숙 꽃 봉오리를 생산 약 한 달쯤 식물 이상적입니다. 변환하기 전에 보조 촬영 형성 3-4일 권장하는 기본 골인을 트리밍하는 것은 변환 효율을 증가합니다. 이전 식물 transformants을 일으키다하지만 낮은 비율로합니다.
  2. 식물의 불임은 중요하다. 하나는 감소 다산과 돌연변이를 변환하는 경우, 많은 식물은 찍기 위해 필요한 것입니다.
  3. 침투 버퍼의 0.3 % Silwet L - 77 계면 활성제가 필수적인 것으로 간주됩니다.
  4. 침투 미디어에서 시간을 디핑 것은 적어도 5 분 정도한다.
  5. 곰팡이 오염을 줄이기 위해 몇 가지주의 사항을 주의해야한다. 첫째, 하나는 식물 / 토양 침투하기 전에 하루에 물을 침투하여 미디어를 몸으로에서 흙을 피하기 위해 필요합니다. 잠수함 침투 미디어의 토양하지 마십시오. 둘째, 수분을 줄이기 위해 침투 후 24 시간 이내에 플라스틱 커버와 종이 타월을 제거합니다. 셋째, 물 식물 오일 침투 전까지는하지 않습니다.

특정 플라스미드 구조에 따라, 유전자 변형 식물의 선택 방법은 다를 수 있습니다. 플라스미드 벡터 암모늄을 glufosinate 수있는 바 (bialaphos acetyltransferase) 마커 유전자 부여 저항을 운반하면, 하나는 직접 종자의 살균하지 않고 토양에 씨를 뿌리고 있습니다. 한 후 스프레이는 1:1000 희석 glufosinate의 암모늄 (상업용 이름 : 피날레, 자유, 또는 점화)와 묘목 한 번 며칠마다 강한 묘목을 선택합니다.

귀스 얼룩 경우, 그것은 얼음에 아세톤에 조직을 수확하고 저하를 피하기 위해 모든 솔루션은 차가운 유지하는 것이 중요 S. X - Gluc과 않고 얼룩 버퍼는 각 구성 요소에 대한 재고 솔루션 (아래 참조)했고 미리 저장할 수 있지만, 신선한 만들 수 있어야합니다. 칼륨 Ferrocyanide 및 Ferricyanide 독성이 신경을 써서 처리한다. 뿐만 아니라, 1-2 일 이상을위한 X - Gluc로 얼룩 버퍼에서 ° C 조직 및 / 또는 얼룩 패턴을 퇴화 시작할 수 있기 때문에이 긴 incubations 동안 너무 확산 될 수 있습니다 37 조직을 부화하지 않는 것이 중요 S . 마지막으로, 높은 페리 및 ferrocyanide 농도가 낮은 전체 얼룩 수준,하지만 더 많은 특이성을 제공합니다. 2mM X - Glux은 대부분의 응용 프로그램에 잘 작동하지만, 농도는 특정 요구에 따라 조정해야 할 수 있습니다. X - Gluc가 비싼 것입니다. 얼룩은 최소한의 볼륨에서 실시하여야한다.

미리 만들 수 있습니다 스톡 솔루션 :

10% 트리톤 X - 100 (몇 달 동안 실온에서 보관)
0.5 M NaHPO 4 버퍼 (pH7.2) (몇 달 동안 실온에서 보관)
100 MM 칼륨 Ferrocyanide (4 어둠에 저장 ° C 몇 개월)
100 MM 칼륨 Ferricyanide (4 어둠 속에 보관 ° C 몇 개월)
100 MM X - Gluc (5 - 브로모 -4 - 클로로 - 3 - 인돌릴 β - D - glucuronide cyclohexamine 소금) Dimethylformamide (DMF)에 만들어 석박 포장 튜브에서 -20 ° C에 저장됩니다. 그것은 몇 달 동안 지속됩니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

도움이 의견을 거스 - 절대 안전한 프로토콜 Paja Sijacic과 코트니 Hollender를 공유하기위한 거스와 그림 1, Detlef 위겔의 사진을 : 우리는 pTSO2 구축을위한 Chunxin 왕 감사합니다. Z. L S 실험실에서 연구는 미국 국립 과학 재단 (IOB0616096 및 MCB0744752)에 의해 지원됩니다. ZL는 부분적으로 메릴랜드 농업 실험 역 대학에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-benzyladenine Sigma-Aldrich 852430
Silwet-77 Crompton Corp. Toxic, wear gloves
Murashige and Skoog Basal medium (MS) Sigma-Aldrich M5519
Gamborg’s vitamin solution 1000X Sigma-Aldrich G1019
X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt Biosynth International, Inc B-7300 Toxic, light sensitive keep in the dark
Micropore 3M Tape Fisher Scientific 19027761

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References

  1. Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
  2. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, (6), 735-735 (1998).
  3. Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18, (2), 350-350 (2006).
의 꽃 - 물놀이 변환<em> Arabidopsis thaliana</em> 검사<em> pTSO2 : β - glucuronidase</em> 리포터 유전자 발현
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Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::β-glucuronidase Reporter Gene Expression. J. Vis. Exp. (40), e1952, doi:10.3791/1952 (2010).More

Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::β-glucuronidase Reporter Gene Expression. J. Vis. Exp. (40), e1952, doi:10.3791/1952 (2010).

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