Summary
मास स्पेक्ट्रोमेट्री बड़े प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो गया है. इस विधि बहु - सबयूनिट विधानसभाओं की रचना stoichiometry, और समग्र वास्तुकला में अंतर्दृष्टि को सक्षम बनाता है. यहाँ हम का वर्णन है,, कदम - कदम के द्वारा, कैसे एक संरचनात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए, और macromolecular संरचनाओं विशेषताएँ.
Protocol
भाग 1: सोने में लिपटे capillaries के nanoflow electrospray ionization के लिए तैयार
गैर सहसंयोजक परिसरों के विश्लेषण आम तौर पर nanoflow electrospray (nESI) ionization 6 के माध्यम से किया जाता है, कांच या क्वार्ट्ज capillaries जो ठीक एक टिप (~ 1 सुक्ष्ममापी भीतरी व्यास), और प्रवाहकीय सामग्री के साथ लेपित के लिए खींच लिया गया है (आमतौर पर सोने) का उपयोग . इस तरह के capillaries के वाणिज्यिक स्रोतों (नई उद्देश्य या Proxeon) से तैयार करने के लिए उपयोग करने के लिए उपलब्ध हैं, तथापि, यह और अधिक लागत प्रभावी हो उन्हें घर में तैयार कर सकते हैं:
- डबल पक्षीय चिपकने वाला एक पेट्री डिश, 2 सेमी के अलावा के नीचे करने के लिए पैड के दो स्ट्रिप्स चिपका. एक पैड के बीच में एक गिलास छड़ी (8 सेमी एक्स 5 मिमी) रखें. चिपकने वाला पैड जगह में capillaries पकड़ है, और गिलास छड़ी तैयार capillaries का समर्थन है, और तोड़ने (1 छवि) से सुझावों रखने.
- Borosilicate ग्लास capillaries, 1.0 मिमी आयुध डिपो 0.78 मिमी आईडी एक्स का उपयोग करें (हम वार्नर इंस्ट्रूमेंट्स से 500 पतली दीवार borosilicate capillaries के पैक का उपयोग करें, बिल्ली नहीं. G100TF-4). एक सुई खींचने (हम Sutter उपकरण कं से पी 97-मॉडल का उपयोग) में केशिका सम्मिलित करें. केशिका धीरे जगह में, दबाना और अपनी स्थिति को समायोजित इतना है कि यह सुई है डांड़ी हीटिंग फिलामेंट के केंद्र में निहित है. Clamps कस धीरे, जब तक केशिका फर्म के दोनों सिरों पर आयोजित किया जाता है.
- केशिका खींचो, एक पूर्वनिर्धारित कार्यक्रम का उपयोग. हर खींच केशिका वृद्धि दो अंतिम, आकार capillaries के लिए दे देंगे. खींचने प्रोग्रामिंग की प्रक्रिया एक परीक्षण और त्रुटि के है, जब तक एक स्वीकार्य टिप आकार प्राप्त की है. हम निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग करें:
चरण गर्मी खींचें Vell समय 1 750 - 15 80 2 700 - 15 50 3 750 200 20 80 - साधन से खींचा capillaries निकालें और सुझावों, discarding के किसी भी है कि विकृत या टूटी हुई हैं का निरीक्षण किया. कुंद चिमटी, (हम सी.के. प्रेसिजन से स्थिति चिमटी का उपयोग करें) का उपयोग पेट्री डिश में capillaries जगह. केशिका के आधार चिपकने वाला पैड करने के लिए संलग्न किया जाना चाहिए और गिलास छड़ी पर ऊपरी भाग ऊपर की ओर इशारा करते टिप के साथ, दुबला चाहिए.
- एक बार पेट्री डिश भरा हुआ है (एक 10 सेमी व्यास डिश में 80 capillaries फिट) के बारे में, सोने में थाली सम्मिलित coater धूम (हम कोई मॉडल का उपयोग EMS550. ईएमएस से). सुनिश्चित करें कि गैस की आपूर्ति निर्माता के निर्देशों के अनुसार चुना जाता है, और एक पूर्वनिर्धारित कोटिंग चक्र को सक्रिय (हम 4 साई 5 x 10 mbar -2, 45mA की मौजूदा एक वैक्यूम दबाव में आर्गन दबाव का उपयोग करते हैं, और एक कोटिंग के समय 1 मिनट, 3-6 चक्र के लिए, capillaries जब तक समान रूप से स्वर्ण) कर रहे हैं.
भाग 2: नमूना तैयारी
- नमूने की कम micromolar सांद्रता (- 20 सुक्ष्ममापी एक) आवश्यक हैं. यदि आवश्यक हो, नमूना केन्द्रापसारक ultrafiltration उपकरणों (जैसे, Sartorius से Vivaspin, या पाल निगम से NanoSep) का उपयोग करते हुए ध्यान केंद्रित. यह अनुशंसित है कि आप डिवाइस झिल्ली प्रोटीन परिसर के सोखना को सत्यापित उपयोग करने से पहले.
- अक्सर, शुद्धि बफ़र्स या प्रोटीन परिसर के भंडारण समाधान nESI, जिसके लिए केवल अस्थिर समाधान इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ संगत नहीं हैं. इसलिए, बफर मुद्रा आवश्यक है. यह महत्वपूर्ण कदम है, जिसमें लवण, बफर अणुओं या ग्लिसरॉल, डीटीटी, या EDTA जैसे किसी भी अन्य गैर वाष्पशील adducts के सभी निशान को हटा रहे हैं, स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता निर्धारित करता है. आमतौर पर, जलीय अमोनियम एसीटेट समाधान, 5 मिमी और एम 1 के बीच की एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है, और 6-8 पीएच. बफर मुद्रा microcentrifuge जेल निस्पंदन स्तंभ (जैसे, माइक्रो जैव स्पिन 6 जैव रेड से क्रोमैटोग्राफी स्तंभों) का उपयोग किया जा सकता है. इस कदम न्यूनतम कमजोर पड़ने (1.3 5 प्रति युक्ति के एक पहलू से कम) के साथ 1-3 बार दोहराया कर सकते हैं, जब तक अधिक से अधिक आदान - प्रदान हासिल की है . यदि दोनों एकाग्रता और बफर आदान - प्रदान की आवश्यकता हैं, ये एक साथ किया जा सकता है, केन्द्रापसारक ultrafiltration (ई, जी, Sartorius से Vivaspin, या पाल निगम से NanoSep) का उपयोग.
भाग 3: उच्च जन मापन के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर औजार
बहु प्रोटीन परिसरों पर किए गए प्रयोगों के अधिकांश नैनो (Q-TOF) quadrupole समय की उड़ान साधन electrospray का उपयोग करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. यह सुझाव दिया है कि आप एक quadrupole मास कम आवृत्तियों के लिए समायोजित फिल्टर का उपयोग करते हैं, उच्च मी / z 7,8 मूल्यों के साथ आयनों की पारेषण और बड़े पैमाने पर विश्लेषण सक्षम. यह हैयह भी सिफारिश की है कि गैस 7,8 या 9 आस्तीन inlets के साधन के लिए पहली आयन गाइड में जोड़ा जा, पहले शून्य स्तर पर दबाव नियंत्रण सक्षम है. बाद संचरण का अनुकूलन, और बहुत बड़ी 7-9 आयनों के desolvation सक्षम बनाता है. वर्तमान में, वाणिज्यिक ईएसआई-TOF और क्यू-TOF उपकरणों कई निर्माताओं (उदाहरण के लिए, वाटर्स, SCIEX, Bruker, या Agilent है) है जो अपेक्षाकृत आसानी से और लागत प्रभावी ढंग से संशोधित किया जा सकता है, देशी एमएस 7,8 अनुप्रयोगों के लिए , से उपलब्ध हैं. यह संभव है, तथापि, LCT या QToF1 (वाटर्स) जैसे उपकरणों पर मानक TOF या QToF विन्यास का उपयोग करने के लिए एक एमडीए परिसरों के लिए जन स्पेक्ट्रा अधिग्रहण हार्डवेयर 5 संशोधनों के लिए आवश्यकता के बिना .
प्रोटोकॉल नीचे उल्लिखित एक Synapt साधन (वाटर्स) पर आयोजित किया गया.
- शुद्ध पानी में सीएसआई के 100 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार करें. सीएसआई अकेले चार्ज नमक समूहों के रूप में उच्च के रूप में जन अंशांकन, (सीएसआई) n Cs के लिए प्रयोग किया जाता है + एक व्यापक जन सीमा पर 393 से मी / z 10,000 से अधिक अच्छी तरह से (छवि 2) विस्तार, .
- कुंद चिमटी का प्रयोग, केशिका में पेट्री डिश और सीएसआई समाधान के लोड 2μL से एक लेपित केशिका, ले एक Eppendorf GeLoader टिप का उपयोग कर.
- केशिका धारक में केशिका डालें, और इस तरह से है कि टिप लगभग 10 मिमी धारक के किनारे से दूर में केशिका समायोजित.
- केशिका की नोक की ओर समाधान या तो स्वयं स्लाइड, या एडाप्टर के नीचे एक स्पिन का उपयोग.
- एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत केशिका प्लेस और टिप ट्रिम तेज ए.ए. प्रकार चिमटी का उपयोग कर.
- Nanoflow ES इंटरफ़ेस करने के लिए केशिका धारक कनेक्ट. Xyz चरण पीछे की ओर घुमाएँ केशिका हानिकारक से बचने के लिए, और इसके सक्रिय स्थिति में मंच धक्का. केशिका 1 रखा जाना चाहिए - शंकु छिद्र से 10 मिमी.
- केशिका (1050-1400 वी) वोल्टेज और कम nanoflow दबाव (0.00-.03 बार) लागू जब तक स्प्रे शुरू की है, तो एक न्यूनतम मूल्य के लिए nanoflow दबाव को कम करने की कोशिश.
- Xyz चरण का स्थान, केशिका वोल्टेज, nanoflow दबाव, और desolvation गैस प्रवाह का समायोजन करके संकेत तीव्रता का अनुकूलन.
- सीएसआई शिखर श्रृंखला की एक विस्तृत रेंज मास का पता लगाने के लिए, तेजी voltages (केशिका 1.3-1.7 केवी, नमूना शंकु 80 150V, निष्कर्षण कोन 1-3 वी हम निम्न पैरामीटर का उपयोग करें) अनुकूलित किया जाना चाहिए.
- उच्च जन आयनों, जो कोमल desolvation शर्तों, स्रोत और विश्लेषक के बीच वैक्यूम प्रारंभिक चरण में समर्थन के दबाव की आवश्यकता के संचरण का अनुकूलन करने के लिए, उठाया जाना चाहिए. यह ध्यान से आंशिक रूप से अलगाव वाल्व (SpeediValve) बंद करके स्रोत वैक्यूम पंप स्क्रॉल करने के लिए लाइन के प्रवाहकत्त्व को कम करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. आदेश में इष्टतम बिंदु को परिभाषित करने के लिए, बाद जबकि संकेत तीव्रता (हम आम तौर पर 3.0-6.5 mbar का उपयोग) पर प्रभाव की निगरानी किया जाना चाहिए.
- एक स्कैन / सेकंड के बारे में 30 स्कैन १,००० के बीच 15,000 मी / जेड की एक रेंज मी / z पर, ले लीजिए
- अधिग्रहण के बाद, उपयुक्त अंशांकन तालिका का उपयोग TOF जांचना.
भाग 4: बरकरार प्रोटीन परिसरों के एमएस विश्लेषण
- अपने नमूना लोड के रूप में वर्णित (भाग 3, 2-5 अनुभाग), और स्प्रे आरंभ.
- स्प्रे के आरंभिक अनुकूलन (भाग 3, धारा 6-9) द्वारा शुरू करो, जब तक सिग्नल का पता चला है. प्रभारी राज्यों की सही स्थिति का प्रोटीन पर निर्भर है, तथापि, यह भविष्यवाणी की जा सकता है आयन मास और औसत प्रभारी राज्य के बीच संबंधों का उपयोग, इस प्रकार है: (जेड ए वी) 10: जेड ए वी = √ .0778 (मीटर), जिसमें मीटर Daltons में परिसर के द्रव्यमान है. जटिल हदबंदी को रोकने के लिए, आयन स्रोत गर्मी नहीं करते हैं: या तो हीटर बंद है, या नीचे 40 तापमान रखने डिग्री सेल्सियस
- केशिका स्थिति, नमूना शंकु और चिमटा आयन संचरण को अधिकतम voltages भिन्नता है, और स्पेक्ट्रा में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन की जाँच करें. वी 1, केशिका वोल्टेज 1.5 केवी: चिमटा शंकु, एक संभव प्रारंभिक बिंदु शंकु वोल्टेज 100 वी किया जा सकता है. Nanoflow दबाव के साथ संयोजन में, इन मानकों को ऑप्टिमाइज़ करें.
- Desolvation में सुधार लाने और बंद अवशिष्ट पानी और बफर घटकों पट्टी करने के लिए, पूर्वाग्रह वोल्टेज और टक्कर सेल में गैस के दबाव में वृद्धि. यह कदम सावधानी से किया जाना चाहिए, परिसर के पृथक्करण को रोकने. ठेठ पूर्वाग्रह voltages 1-10 वी के सीमा के भीतर 1-10 मिलीग्राम / मिनट (3 छवि) का एक जाल गैस के प्रवाह के साथ कर रहे हैं. आरएफ सेटिंग और quadrupole प्रोफ़ाइल के मैनुअल समायोजन उच्च जन आयनों के संचरण में सुधार हो सकता है.
- ट्रैप और स्थानांतरण टक्कर ऊर्जा समायोजित करें. अक्सर, उच्च voltages उच्च जन आयनों (आमतौर पर 10-30 वी के सीमा के भीतर) के प्रसारण के लिए आवश्यक हैं. इस बिंदु पर, यह महत्वपूर्ण है टक्कर प्रेरित जटिल की हदबंदी से बचने के लिए.
- एक स्थिर संकेत के बाद r हैeached, यह अनुशंसित है कि nanoflow दबाव और केशिका वोल्टेज न्यूनतम मूल्यों को कम किया जा, जबकि स्थिर स्प्रे को बनाए रखने.
भाग 5: अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री: अलग प्रोटीन परिसरों
- एक बार एक इष्टतम और स्थिर संकेत प्राप्त किया गया है, एक अग्रदूत साबित आयन का चयन करें. बड़े पैमाने पर केंद्र और अलगाव चौड़ाई (हम आम तौर पर 12 की एक LM संकल्प, और 13 के बीच और 15 की एक एचएम संकल्प का उपयोग करें) सेट. उच्च जन / कम चार्ज हदबंदी उत्पादों का पता लगाने के लिए एक विस्तृत रेंज मास का उपयोग करने के लिए. यह अनुशंसित है कि आप अधिकतम स्तर मीटर / z रेंज सेट, और फिर इसे वांछित मूल्यों को कम करने. हम आगे एमएस और एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा superimposing सुझाव है, के लिए चुना अग्रदूत आयन के अलगाव को मान्य.
- प्रदर्शन एमएस / एमएस, अग्रदूत आयन टक्कर सेल पर टक्कर ऊर्जा (CE) और दबाव बढ़ाने के द्वारा अलग कर देना. या तो जाल बढ़ाएँ या CE, धीरे - धीरे 10-20V के चरणों में, स्थानांतरण, और 0-5 मि.ली. / मिनट (सामान्य मान) टक्कर गैस के दबाव तरक्की. मॉनिटर परिवर्तन स्पेक्ट्रा में इष्टतम सक्रियण शर्तों जब तक पहुँच रहे हैं. उच्च सक्रियण ऊर्जा बरकरार परिसर से एक या एक से अधिक सब यूनिटों के पृथक्करण प्रेरित हो सकता है, और स्पष्ट अलग सब यूनिटों की बातचीत समानताएं. ट्रैप / स्थानांतरण कोशिकाओं में एक टक्कर गैस के रूप में हम आम तौर पर आर्गन उपयोग करते हैं, हालांकि एक भारी गैस (जैसे, XE, या एस एफ 6) का उपयोग करने के लाभों की सूचना दी गई है, तथापि, इन गैसों को काफी अधिक महंगी 11 (छवि 3) हैं.
- यह अनुशंसा की जाती है कि एक से अधिक प्रभारी राज्य एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए चयनित किया जाना है. अतिव्यापी घटकों के मामले में, मिलकर एमएस स्पेक्ट्रा के एक सेट खरीदने के विभिन्न आबादी के प्रभारी श्रृंखला को हल करने में सहायता करेगा. इसके अलावा, उच्च प्रभारी राज्यों और अधिक आसानी से कम चार्ज 12 राज्यों की तुलना में, अलग कर देना होगा.
- बरकरार परिसर के लक्षण वर्णन के अलावा, यह सुझाव दिया है कि समाधान में छोटे subcomplexes उत्पन्न हो जाएगा हल्के denaturing शर्तों के तहत. Subcomplexes के एमएस और एमएस / एमएस विश्लेषण जटिल 13 के सबयूनिट वास्तुकला परिभाषित करने के लिए आधार के रूप में. सबयूनिट - सबयूनिट बातचीत की आंशिक व्यवधान के लिए, धीरे धीरे कार्बनिक सॉल्वैंट्स (जैसे मेथनॉल, isopropanol, या acetonitrile) जोड़ने के 50% के एक एकाग्रता के लिए, या 4 के एक एकाग्रता के लिए अमोनिया या चींटी एसिड (जोड़कर समाधान के पीएच बदलने %).
- व्यक्ति सब यूनिटों कि जटिल रचना की जनता का निर्धारण करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है denaturing शर्तों के तहत एक स्पेक्ट्रम हासिल करने के लिए. यह ज़िप युक्ति 25:75 अनुपात / पानी acetonitrile के साथ 4 सी (Millipore) का उपयोग elution विलायक के रूप में 1% चींटी एसिड के साथ किया जा सकता है है.
भाग 6: डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण
- डेटा ऑफ़लाइन विश्लेषण है, एमएस स्पेक्ट्रा के लिए एक वर्णक्रमीय विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग कर. हम आम तौर पर MassLynx कार्यक्रम (वाटर्स) का उपयोग करें.
- स्पेक्ट्रा है कि एक विस्तृत श्रृंखला मी / z अवधि के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि चौरसाई और केन्द्रक मापदंडों के विभिन्न योजनाओं के उच्च और निम्न मी / z क्षेत्रों के लिए लागू हो सकता है, इन क्षेत्रों के शिखर संकल्प में अंतर को प्रतिबिंबित करने के लिए.
- प्रभारी श्रृंखला की पहचान और प्रभारी राज्यों और जनता की गणना करने के लिए, "मैन्युअल" MassLynx के समारोह लागू किया जा सकता है. अतिव्यापी घटकों के साथ जटिल जन स्पेक्ट्रा के मामलों में, जनता के मैनुअल गणना आसान हो सकता है.
- इन असाइनमेंट प्रक्रियाओं को सुविधाजनक बनाने के लिए, अतिरिक्त सॉफ्टवेयर इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए: स्पेक्ट्रा deconvolution 14, शिखर फिटिंग और 15 अनुकरण के लिए SOMMS, और और प्रोटीन subcomplexes की संरचना stoichiometry बताए और प्रोटीन बातचीत नेटवर्क 13,16,17 पैदा करने के लिए शिखर सम्मेलन के लिए MAXENT .
भाग 7: प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. तैयारी सोने में लिपटे नैनो electrospray capillaries.
एक पेट्री डिश के लिए दो डबल पक्षीय चिपकने वाला स्ट्रिप्स संलग्न, 2 सेमी के अलावा. तैयार capillaries समर्थन करने के लिए, एक पैड के बीच में एक गिलास छड़ी (8 सेमी एक्स 5 मिमी) जगह बी. चिपकने वाला पैड तैयार capillaries के कुंद अंत छड़ी, और कांच की छड़ी पर टिप दुबला. सी. एक बार पेट्री डिश तैयार capillaries, उन्हें कोट के साथ सोने से भरा है जब तक सोने की एक पतली फिल्म में समान रूप से capillaries की बाहरी सतह पर जमा है.
चित्रा 2. उच्च जन सीज़ियम आयोडाइड आयनों का उपयोग अंशांकन.
सीएसआई के बड़े और monisotopic समूहों उच्च बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर calibrating के लिए पसंद की यौगिक बना दिया है. समान रूप से स्थान चोटियों की श्रृंखला मी / z 393 से 10,000 से अधिक अच्छी तरह से करने के लिए, एक विस्तृत रेंज पर विस्तार. वे assig कर रहे हैंनेड अकेले सामान्य संरचना (सीएसआई) n Cs + नमक समूहों का आरोप लगाया. प्रमुख चोटियों के बीच अतिरिक्त संकेतों श्रृंखला की डबल और ट्रिपल चार्ज प्रजातियों की वजह से कर रहे हैं, (सीएसआई) n CS2] 2 + और [(सीएसआई) CS3 n] 3 + क्रमशः. प्रारंभिक वैक्यूम स्तर पर दबाव बढ़ाने उच्च जन समूहों का पता लगाने के लिए आवश्यक है. उच्च जन चोटियों पर दबाव के प्रभाव एक पैनलों में प्रदर्शन किया है. और बी. 1.2 और 5.3, क्रमशः के दबाव readbacks के साथ सी . जन स्पेक्ट्रम का विस्तार बी में दिखाया गया है.
चित्रा 3. एक pentameric लेक्टिन के Nanoflow electrospray जन स्पेक्ट्रा.
ए मास स्पेक्ट्रोमेट्री (निर्देशित 18 विकास द्वारा Lib1-B7 से व्युत्पन्न) के एक लेक्टिन संस्करण जटिल ३००० और 5,000 मी / Z के बीच आरोप राज्य के वितरण को जन्म देता है है, तथापि, आयनों की अपर्याप्त desolvation वजह से , चोटियों व्यापक हैं. पैनल ए और बी की तुलना 4V (.) से (बी) शिखर चौड़ाई पर पूर्वाग्रह वोल्टेज 15V करने के लिए बढ़ाने के प्रभाव दिखाते हैं. तेजी की स्थिति में यह वृद्धि अवशिष्ट पानी और बफर घटकों के विपठ्ठन कारण बनता है, एक अत्यधिक हल स्पेक्ट्रम उपज. बड़े पैमाने पर मापा (60,240 ± 38 दा) एक pentameric जटिल संगत सी. 15 प्रभारी राज्य फिर मिलकर MS (पैनल बी में ग्रे में छायांकित.) विश्लेषण डी के लिए चुना गया था. . टक्कर ऊर्जा में वृद्धि एक उच्च आरोप monomer, 1664 मीटर / z पर केन्द्रित है, और एक छीन tetrameric जटिल की रिहाई का कारण बनता है, 5000 की रेंज में - +८,००० मीटर / जेड सभी स्पेक्ट्रा 0.5m अमोनियम एसीटेट में एक समाधान का 20 सुक्ष्ममापी युक्त नमूना से प्राप्त किया गया.
Discussion
अधिग्रहण के लिए उच्च गुणवत्ता स्पेक्ट्रा नमूना तैयार कदम है, जो नमूना एकाग्रता और बफर विनिमय शामिल करने के लिए ध्यान दिया जाना चाहिए. पतला नमूने ओवर कम संकेत उपज, जबकि अत्यधिक ध्यान केंद्रित नमूने बल्कि चिपचिपा हो सकता है, और electrospray सुई ब्लॉक. इसके अलावा, लवण, ग्लिसरॉल, डिटर्जेंट, धातु आयनों, और कम करने एजेंट (डीटीटी या β-mercaptoethanol) जैसे समाधान additives, प्रोटीन की बाहरी सतह का पालन करते हैं, और चोटियों के व्यापक बनाने के कारण. इसलिए, क्रम में अच्छी तरह से हल चोटियों को प्राप्त करने के लिए, इन घटकों को न्यूनतम संभव सांद्रता में जोड़ा जाना चाहिए.
एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर केशिका nanoflow की स्थिति, मास स्पेक्ट्रोमीटर छिद्र करने के लिए सापेक्ष है. "मीठी हाजिर" ढूँढना अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है है, फिर भी, यह काफी स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता को प्रभावित करती है. यह भी महत्वपूर्ण है की जांच करने के लिए स्प्रे की दीक्षा nanoflow पहले केशिका. छोटी बूंद के आकार टिप व्यास, जो 1μm ~ होना चाहिए की एक समारोह है. छोटी बूंदों अधिक कुशल ionization के लिए सीसा, और इसलिए लाभप्रद होगा. करने के लिए मान्य है कि वहाँ केशिका के भीतर कोई हवाई बुलबुले कि प्रवाह को ब्लॉक कर सकते हैं कर रहे हैं यह भी महत्वपूर्ण है, और है कि अधिग्रहण के दौरान सोने की कोटिंग केशिका से छीन नहीं है, यदि हां, तो आगे टिप ट्रिम. ध्यान रखें कि नमूने के एक अत्यधिक राशि अनुकूलन केशिका वोल्टेज, तेजी voltages, दबाव, और टक्कर ऊर्जा जैसे एमएस शर्तों की संभावना में वृद्धि होगी.
कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल में समझाया प्रक्रियाओं संरचना, stoichiometry और कई प्रोटीन परिसरों की वास्तुकला (2,3,4 समीक्षा) को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Ribosome 19 जैसे बड़े एमडीए परिसरों और अत्यधिक आदेश दिया वायरस capsids 20-22, के विश्लेषण से आणविक मशीनों 23-25, या सबयूनिट बातचीत नेटवर्क के लक्षण वर्णन के लिए बाध्य सब्सट्रेट परिभाषित करने में 26,17,16,17,27,28 के रूप में सेवा लेकिन इस दृष्टिकोण के मूल्य के कुछ उदाहरण हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों उनके महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए, और पांडुलिपि के लिए अपने योगदान के लिए शेरोन समूह के सदस्यों को धन्यवाद देता हूं. हम Morasha और Bikura प्रोग्राम्स, इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान नग 1823-1807 और 378/08), जोसेफ Cohn मिनर्वा Biomembrane अनुसंधान के लिए केंद्र, नई वैज्ञानिकों के लिए Chais परिवार फैलो प्रोग्राम, इब्राहीम के समर्थन के लिए आभारी हैं और सोनिया Rochlin फाउंडेशन, वोल्फसन परिवार चैरिटेबल ट्रस्ट, हेलेन और मिल्टन ए Kimmelman केंद्र Biomolecular संरचना और विधानसभा के लिए, Shlomo और Sabine Beirzwinsky की संपत्ति, Meil डे Botton Aynsley, और करेन Siem, ब्रिटेन. हम दान Tawfik और Itamar Yadid हमें लेक्टिन संस्करण नमूना देने के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-2 μL Volume | Per capillary | ||
| 1-20 μM Concentration | Per complex | ||
| Aquanos volatile buffer such as ammonium acetate at pH= 6- 8 | Typically 5 mM-1 M | ||
| Detergent (Minimal) | Clusters of detergent molecules produce broad and unresolved peaks | ||
| Glycerol (Minimal, up to 5%) | Adheres nonspecifically to proteins and, consequently, broad peaks are observed | ||
| Organic solvents (Up to 50%) | Might denature proteins complexes | ||
| Acids (Up to 4%) | Denature protein complexes | ||
| Salts (Minimal) | Salt adducts lead to broad and unresolved peaks | ||
| DTT (Minimal) | 1-2 μM can be present | ||
| Chelating agents (Minimal) | Above 250 μM lead to extensive adduct formation |
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