Summary
डीएनए डबल भूग्रस्त एक आणविक मार्कर के रूप में γH2AX गठन का उपयोग धारियाँ की मात्रा का ठहराव विकिरण जीव विज्ञान में एक अमूल्य उपकरण बन गया है. यहाँ हम γH2AX foci के विकिरण के कक्षों के प्रदर्शन के बाद मात्रा का ठहराव के लिए एक immunofluorescence परख के उपयोग के प्रदर्शन.
Abstract
डीएनए डबल भूग्रस्त (DSBs) टूट जाता है, जो या तो अंतर्जात चयापचय प्रक्रियाओं के द्वारा या exogenous स्रोतों द्वारा प्रेरित कर रहे हैं और जीनोमिक अखंडता के अस्तित्व के संरक्षण के लिए सम्मान के साथ एक सबसे महत्वपूर्ण डीएनए घावों के कर रहे हैं. DSBs की प्रेरण के लिए एक प्रारंभिक प्रतिक्रिया H2A histone संस्करण, H2AX की phosphorylation सेरीन-139 अवशेषों पर, उच्च संरक्षित सी टर्मिनल SQEY आकृति में, बनाने γH2AX
Protocol
सेल तैयार
- Keratinocyte सीरम मुफ्त मध्यम में मानव keratinocytes (FEP-1811) बड़े हो रहे थे (कश्मीर SFM, Invitrogen) epidermal वृद्धि कारक, गोजातीय पिट्यूटरी निकालने और 20 μg / मिलीलीटर gentamicin के साथ पूरक 37 में डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 .
- एक एकल कक्ष निलंबन trypsin EDTA (0.05% v / वी) के साथ detaching द्वारा तैयार किया गया था
- कक्ष 8 अच्छी तरह लैब टेक द्वितीय microchamber स्लाइड्स में वरीयता प्राप्त किए गए थे (दस हज़ार कोशिकाओं को अच्छी तरह /) और स्लाइड 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में incubated रहे थे.
किरणन
- कक्ष 2 137 Cs स्रोत (, Nordion इंटरनेशनल, पर, कनाडा, Gammacell 1000 अभिजात वर्ग irradiator 20.6 सेकंड / Gy) का उपयोग Gy के साथ बर्फ पर विकिरणित किया गया
- Unirradiated नियंत्रण और 2 विकिरणित कोशिकाओं Gy के 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में incubated रहे थे .
Immunofluorescence धुंधला
- मीडिया दूर tipped था और कोशिकाओं के 300μl पीबीएस (w / ओ Ca + 2 या 2 मिलीग्राम +) के साथ अच्छी तरह से प्रति धोया गया और 5 मिनट के लिए एक कक्षीय मिक्सर पर घुमाया गया.
- बफर दूर tipped था और हौसले से तैयार 4% (v / v) paraformaldehyde प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा गया है और स्लाइड्स 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated रहे थे की 100μl.
सभी incubations एक humidified धुंधला गर्त में प्रदर्शन किया गया - कोशिकाओं तो पीबीएस (w / ओ 2 Ca + मिलीग्राम या + 2) के साथ धोया गया . स्लाइड एक Coplin जार और घुमाया में 5 मिनट के लिए एक कक्षीय मिक्सर पर रखा गया. इस धोने कदम आगे दो बार दोहराया गया था.
- बफर दूर tipped था और अतिरिक्त पीबीएस धीरे blotted किया गया था.
- कक्ष 100ml Triton एक्स 100 (0.1% v / वी) के अनुसार अच्छी तरह से और कमरे के तापमान पर एक 10 मिनट ऊष्मायन का उपयोग permeabilized थे.
- कक्ष पीबीएस के साथ धोया गया (w / ओ 2 Ca + या + 2 मिलीग्राम) के रूप में चरण 3 और 4 ऊपर में वर्णित है.
- गैर विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी BSA के 100ml (1% v / वी) के साथ अच्छी तरह से और 20 मिनट ऊष्मायन प्रति कमरे के तापमान पर अवरुद्ध किया गया था.
- अतिरिक्त BSA दूर tipped था और प्राथमिक माउस मोनोक्लोनल विरोधी phospho एंटीबॉडी histone H2AX (1:500 पतला, 1% BSA में, Millipore) के 100μl, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के ऊष्मायन के लिए एक अच्छी तरह से जोड़ा गया है.
- कक्ष पीबीएस के साथ धोया गया (w / ओ 2 Ca + या मिलीग्राम + 2) के रूप में चरण 3 और 4 ऊपर में वर्णित और माध्यमिक एंटीबॉडी के (Alexa Fluor 488 बकरी माउस विरोधी आईजीजी 100μl के साथ incubated 1% BSA में 1:500 , पतला ; Invitrogen) अच्छी तरह से अंधेरे में कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए प्रति. (पतला एंटीबॉडी प्रक्रिया भर अंधेरे में रखा गया था)
- कक्ष पीबीएस के साथ धोया गया (w / ओ 2 Ca + या + 2 मिलीग्राम) के रूप में चरण 3 और 4 ऊपर में वर्णित है. हालांकि, प्रकाश के संपर्क पन्नी का उपयोग कम से कम किया गया था.
- और अच्छी तरह से प्रति कमरे के तापमान पर एक 10 मिनट ऊष्मायन, परमाणु counterstaining 100ml TOPRO3 (Invitrogen 1:500 पतला) के साथ प्रदर्शन किया था
- कोशिकाओं पीबीएस (w / ओ 2 Ca + या + 2 मिलीग्राम) से धोया गया के रूप में 10 ऊपर चरण में वर्णित.
- कक्षों स्लाइड से ध्यान हटा रहे थे, अतिरिक्त नमी blotted किया गया था और स्लाइड्स के लिए सूखी हवा की अनुमति दी गई.
- स्वर्ण विरोधी फीका समाधान (Invitrogen) लम्बा की एक बूंद के अनुसार में अच्छी तरह से जोड़ा गया है और स्लाइड घुड़सवार थे (22x50 मिमी coverslip) और स्लाइड के किनारों के आसपास किसी भी अतिरिक्त तरल blotted किया गया था.
- स्लाइड्स नेल पॉलिश के साथ सील करने से पहले कमरे के तापमान पर एक और आगे 30 मिनट के लिए अंधेरे में रखा गया था.
- स्लाइड्स रातोंरात 4 में संग्रहीत सेल्सियस विश्लेषण से पहले अंधेरे में.
/ माइक्रोस्कोपी विश्लेषण
- (- Alexa Fluor 488 बकरी आईजीजी विरोधी माउस γH2AX के लिए) और दूर लाल लेसरों (TOPRO 3) Zeiss LSM510 मेटा Confocal Microscpe मानक GFP का उपयोग कर छवियों अधिग्रहण किया. आमतौर पर, एक 63 x तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस प्रयोग किया जाता है.
छवियाँ 0.5 सुक्ष्ममापी के एक कदम के आकार के साथ एक पैटर्न Z श्रृंखला में हासिल किया है. 0.5 सुक्ष्ममापी के एक कदम के आकार के विभिन्न विमानों में नाभिक में foci वर्तमान के नुकसान को कम करने के लिए चुना गया था. विश्लेषण के दौरान, व्यक्ति विमानों deconvoluted हैं और अधिकतम अनुमान foci के ओवरलैप (शीर्ष टोपी फिल्टर लागू) कम से कम छवि का उत्पादन करने के लिए खड़ी है. - Metamorph (आण्विक डिवाइसेज, संयुक्त राज्य अमरीका) foci के संख्या का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
कार्यक्रम foci के प्रत्येक कक्ष में संख्या quantitates बाद दहलीज पृष्ठभूमि बाहर करने के लिए लागू किया गया है. जानकारी आगे के विश्लेषण के लिए एक Microsoft Excel स्प्रेडशीट में लॉग इन किया है.
चित्रा 1 अनुपचारित मानव keratinocytes में और 2 Gy के साथ विकिरणित और 37 में एक और 1 घंटे के लिए incubated कोशिकाओं में γH2AX foci (हरा) के immunofluorescence दृश्य डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 . डीएनए TOPRO-3 (नीला) के साथ दाग था. छवियाँ Zeiss LSM 510 मेटा Confocal खुर्दबीन का उपयोग कर हासिल किया गया. बार = 10 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2 γH2AX foci (हरा) मानव keratinocytes में और 2 Gy के साथ विकिरणित और 37 में एक और 1 घंटे के लिए incubated कोशिकाओं में immunofluorescence दृश्य डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 . छवियाँ एक Zeiss LSM 510 मेटा Confocal खुर्दबीन 0.5 सुक्ष्ममापी जेड सेक्शनिंग (1-9) का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें सभी foci से हासिल किया गया का उपयोग कर हासिल किया गया. छवियों तो Metamorph का उपयोग quantitation के लिए खड़ी था. डीएनए TOPRO-3 (नीला) के साथ दाग था. खड़ी γH2AX और नीले रंग छवियों के दृश्य के लिए खड़ी थे. बार = 10 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
Ionizing विकिरण (γ रे), γH2AX foci तेजी फार्म और foci संख्या के बाद जोखिम 3-60 2 मिनट के बीच एक अधिकतम तक पहुँचने. इसलिए, हमारे 1 घंटे के समय के बाद विकिरण बिंदु प्रारंभिक DSB गठन को दर्शाता है. हम अपने प्रयोग के लिए नैदानिक प्रासंगिक 2 Gy की विकिरण खुराक का इस्तेमाल किया है. हालांकि, विधि विकिरण खुराक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रारंभिक DSB गठन का पता लगाने के लिए 4 Gy के लिए, foci के महत्वपूर्ण ओवरलैप उच्च खुराक पर सटीक quantitation precludes. उच्च विकिरण खुराक अब के बाद विकिरण ऊष्मायन समय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, γH2AX foci के रूप में की मरम्मत के कारण खो रहे हैं, quantifiable संख्या में जिसके परिणामस्वरूप. आमतौर पर, 4 घंटे और 24 घंटे बाद विकिरण ऊष्मायन बार निगरानी डीएनए की मरम्मत के लिए उपयोग किया जाता है. हमें इस्तेमाल किया है डीएनए TOPRO 3 हमारे confocal खुर्दबीन उत्तेजना लेज़रों में सीमाओं की वजह से दाग. सामान्यतः, 4,6 - diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) परमाणु counterstaining के लिए प्रयोग किया जाता है. यद्यपि हम एक confocal खुर्दबीन के साथ epifluorescent सूक्ष्मदर्शी का इस्तेमाल z-सेक्शनिंग क्षमता पर्याप्त हैं. immunofluorescence विधि अन्य पक्षपाती और सामान्य कैंसर कोशिका लाइनों के लिए उपयुक्त है, हम मानव glioblastoma और सामान्य मानव endothelial कोशिकाओं और चूहे H9c2 भ्रूण निलय myocytes T98G परीक्षण किया है.
अंत में, γH2AX के quantitation सचित्र के रूप में हमारे प्रयोग और मरम्मत (विकिरण संवेदनशीलता) द्वारा निगरानी डीएनए की क्षति के लिए विकिरण प्रेरित डीएनए की क्षति, ionizing के संदर्भ में उपयोगी है. परख यौगिकों कि विकिरण (यानी विकिरण संरक्षक और sensitizers) के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं मिलाना की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए भी उपयोगी है. इसके अलावा, γH2AX उम्र बढ़ने और रोग में एक संभावित आणविक मार्कर के रूप में उभर रहा है, मुख्य रूप से 10 कैंसर में .
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
परमाणु विज्ञान और इंजीनियरिंग के ऑस्ट्रेलियाई संस्थान का समर्थन स्वीकार किया है. TCK AINSE पुरस्कार के प्राप्तकर्ता था. Epigenomic चिकित्सा लैब राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (566,559) द्वारा समर्थित है. LM मेलबोर्न (मेलबोर्न विश्वविद्यालय) अनुसंधान और बायोमेडिकल इमेजिंग सीआरसी अनुपूरक छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है. मोनाश माइक्रो इमेजिंग के समर्थन (डीआरएस स्टीफन कोड़ी और Iśka Carmichael) इस काम के लिए अमूल्य था.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nalge Nunc international | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | EMD Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Biosciences | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Biosciences | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
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- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
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