Summary
현미경 coverslips에서 포유 동물 세포의 현장 subcellular 분별 (분리)에서 단백질 지방화의 시각이 있습니다.
Abstract
단백질 기능을 속속들이 단백질 현지화로 결합됩니다. 어떤 단백질은 특정 위치 또는 subcellular 구획로 제한하고 있지만, 많은 단백질이 밀접하게 특정 subcellular 도메인 또는 구조와 관련된 하위 인구를 무료로 교환 자유롭게 diffusing 인구로 존재한다. 원위치 subcellular 분별 (분리)에서의 시각화가 가능 단백질 compartmentalization 또한 단백질 구체적인 구조에 집중 하위 인구를 공개하실 수 있습니다. 예를 들어, 용해 세포질 단백질과 느슨하게 개최 핵 단백질의 제거는 염색질와 함께 전사 요소의 안정적인 연결을 확인할 수 있습니다. DNA의 소화 이후 어떤 경우에는 집합 핵 발판이나 핵 매트릭스를 칭했다는 단백질과 RNAS의 네트워크 연결을 확인할 수 있습니다.
여기 현미경 coverslips에 자기편 및 비 점착 성의 포유 동물 세포의 현장 분별화에서 중 필요한 단계를 설명합니다. 단백질 시각화는 특정 항체 또는 형광 융합 단백질과 형광 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 항체 및 / 또는 특정 구획이나 구조에 대한 마커 역할을 형광 염료는 단백질 지방화는 자세히 매핑 될 수 있습니다. 원위치 분별화에서도 서양 각 분획에있는 단백질의 양을 비교 모래 바닥과 함께하실 수 있습니다. 이 간단한 생화 학적 접근 방법은 별도로 들키지 않고 남아있는 것이 연결을 확인할 수 있습니다.
Protocol
분류에 대한 I. 준비
이 섹션은 폴리 - L - 라이신 코팅 현미경 coverslips 및 분류하기 전에 세포의 첨부 파일의 준비를 설명합니다. 필요한 경우 전지 transiently 첨부 앞 또는 뒤에 하나 단백질 발현 벡터와 함께 transfected 수 있습니다.
폴리 - L - 라이신 코팅 coverslips의 A. 준비
- 증류수에 1mg/ml 폴리 - L - 라이신의 솔루션을 준비합니다.
- 22 락을 플랫폼에서 최소한 1 시간 동안 솔루션에서 그들을 잠복기로 폴리 - L - 라이신과 겉옷 깨끗한 coverslips ° C.
- 두 멸균 증류수로 코팅 coverslips를 씻고 96 % 에탄올과 함께 하나의 세척과 함께하십시오.
- 에어 필터 종이에 코팅 coverslips을 건조하고 나중에 사용할 수 드라이 컨테이너 (일단 드라이들은 스택 가능)에 보관하십시오.
coverslips에 B. 첨부 세포
비 점착 성의 세포 (여기서 우리는 K562 세포를 사용)
- 최대 직면한 코팅 표면을 가진 6 잘 플레이트에 잘에서 폴리 - L - 라이신 코팅 coverslip를 놓습니다.
- 7x10 5 세포의 밀도에 씨앗 K562 세포 / 잘 Dulbecco의 수정 이글스 중간 (DMEM) 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 PS (페니실린 100units/ml, 스트렙토 마이신의 100mg/ml)와 보충 인치 K562 세포의 경우에는 과도 transfection은 세포를 시딩 전에 electroporation을 (250V / 975μF에서 매체의 200μl에 1x10 7 전지 0.4cm electroporation의 cuvettes)를 사용하여 수행할 수 있습니다.
- 37 ° C 5 % CO 2에서 24 시간 동안 세포를 품어.
- 매체를 붓고 얼음 차가운 인산과 함께 두 번 세포 세차 호수 (PBS)를 버퍼.
- subcellular 분획화 프로토콜하십시오.
자기편 세포 (여기서 우리가 만들었기에 - 7 세포를 사용)
- 6 잘 판에있는 우물에 uncoated coverslip를 놓습니다.
- PBS로 두 번 씻어 37 ° C.에 prewarmed
- 37 PBS의 트립신 (0.03 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.25 %의 트립신)를 소화하여 세포를 분리 ° C 2~5분하십시오. 그것은 주로 개인 떠있는 세포가 존재로 전지를 오버 소화하고 즉시 소화를 중지하지 않는 것이 중요합니다.
- / 잘 10% FBS와 PSG (페니실린 100 단위 / ML, 스트렙토 마이신 100ug/ml 및 L - 글루타민 292ug/ml)와 보충 DMEM에 6 잘 판에 3x10 5 세포의 밀도에 세포를 시딩하여 소화를 중지합니다 정상 coverslips에. 자기편 세포는 일반적으로 필요한 경우에는, 폴리 - L - 라이신 코팅 coverslips 사용할 수있는 정상적인 현미경 coverslips에 잘 부착합니다.
- 37 ° C와 5% CO 2에서 24 시간 동안 세포를 품어. 왜냐하면 - 7 세포의 경우에는 과도 transfection은 Fugene 6 (로체) 필요한 경우 37에서 추가로 24 시간 동안 복구 왼쪽으로 세포를 사용하여 수행할 수 있습니다 ° C와 5 % CO 2.
- 매체를 붓고 얼음 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
- subcellular 분획화 프로토콜하십시오.
II. Subcellular 분별 (분리)
현장 분획에서는 그림 1에 표시된 설계도에 따라 수행되고있는 방법을 기반으로 함께 이전 5 설명한 변경 사항은 이전에 7 아래의 자세한 프로토콜 설명했다. 이것은 액체를 제거하기 전에 coverslip을 제거 각 분류 단계 다음과 같은 새로운 6 - 잘 판에 coverslips을 전송하는 것이 좋습니다. 적당히 coverslips이 영상에 필요한 있지만, 추가 coverslips이가 병렬로 진행하는 경우 서부는 모래 바닥에 대한 전체 세포 추출물과 핵 매트릭스 분수를 생성해야합니다.
- 준비하고 cytoskeleton 버퍼 (CSK) 필터 : 10mM 파이프, 300mM 자당, 100mM NaCl, 3mM MgCl 2, 1mM EGTA합니다. CSK 버퍼는 신선한 분별화 당일 준비되어야합니다.
- 필요한 경우 하나 coverslip에서 세포가 부드럽게 직접 coverslip에 200ul의 TES 버퍼 (1 % SDS, 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20mM 트리스 - HCL 산도 7.4)을 배치하고 1 ~ 2 분 동안 잠복기에 의해 모래 바닥 서부에 대한 전체 세포 추출물을 준비하는 데 사용할 수 있습니다 22 ° C. 전체 세포 추출물은 다음 1M의 250ul (NH 4) 2 SO 4 추가하고 다른 서양의 샘플이 준비되기 전까지는 얼음 잠복기에 의해 제거되고 단백질은 시켰던 수 있습니다.
- 22 ° C 기울이기로 6 잘 플레이트 두세 시간에 두 번 1ml 얼음 차가운 PBS로 남아 coverslips 씻으십시오.
- 전체 세포와 신선한 6 잘 판에 전송을 대표하는 coverslip을 제거합니다. 세포 고정과 단백질 형광 프로토콜과 함께하십시오.
- 부드럽게 남아있는 우물에서 PBS를 제거합니다.
- 부드럽게 200ul CSK 버퍼를 배치하여 세포질과 핵 단백질 개최 느슨하게 압축을 풉니다 + 0.1 % (V / V) 트리톤 직접 각 나머지 coverslip에 X - 100 잠복기에1 분 얼음.
- 세포질과 느슨하게 개최 핵 추출물을 제거하고이 단계는 2 단계에 설명된대로 침전물.
- 22 회 1ml 얼음 차가운 PBS로 coverslips을 씻어 ° C를 기울이기 6 잘 판에 의해.
- 밀접하게 개최 핵 물질을 대표하는 coverslip을 제거하고 세포 고정과 단백질 형광 프로토콜과 함께하십시오.
- 부드럽게 남아있는 우물에서 PBS를 제거한 후 부드럽게 + 0.5 % (V / V) 트리톤 X - 100에 직접 각 나머지 coverslip에 200ul CSK 버퍼를 넣어 20 분 동안 얼음 잠복기에 의해 단단히 개최 단백질을 추출합니다.
- 단단히 개최 추출물을 제거하고 2 단계에서 설명한대로 침전물.
- 22 회 1ml 얼음 차가운 PBS로 coverslips을 씻어 ° C를 기울이기 6 잘 판에 의해.
- 염색질 분획을 대표하는 coverslip을 제거하고 세포 고정과 단백질 형광 프로토콜하십시오.
- 부드럽게 다음 장소 200ul CSK 버퍼 + 100ug/ml DNase I 30 분 동안 나머지 coverslips과 부화에 37 ° C. 남아있는 우물에서 PBS를 제거
- 염색질 추출물을 제거하고 2 단계에서 설명한대로 침전물.
- ° C 틸팅하여 6 잘 플레이트 22 회 얼음 차가운 PBS로 coverslips 씻으십시오.
- 핵 매트릭스 분율을 나타내는 coverslip을 제거하고 세포 고정과 단백질 형광 프로토콜과 함께하십시오.
- 필요한 경우 매트릭스 단백질은 2 단계에서 설명한대로 200ul의 TES 버퍼를 사용하여 모래 바닥 서부에 대한 추가 매트릭스 coverslip에서 제거할 수 있습니다.
- 서양 얼룩에 대한 샘플은 4 벤치 최고 microcentrifuge에서 13,000 rpm으로 centrifuged되어야 ° C와 40ul SDS 로딩 버퍼 (62.5mM 트리스 - HCL 산도 6.8, 2퍼센트 SDS (W / V), 50 MM DTT에 resuspended 산탄 10 % 글리세롤, SDS - PAGE로 분석하기 전에 0.01 % bromophenol 블루 (W / V)).
그림 1. 현장 subcellular 분별 (분리)에의 개략도 표현. Cytoskeleton 버퍼 (CSK)는 10mM 파이프, 300mM 자당, 100mM NaCl, 3mM MgCl 2, 1mM EGTA으로 구성되어 있습니다. TES 버퍼가 1 % SDS, 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20mM 트리스 - HCL pH를 7.4로 구성되어 있습니다.
III. 세포 고정과 단백질 형광
- 부드럽게 30 분 4 각 coverslip과 부화 ° C ~ 4 %의 포름 알데히드 / PBS의 1ml를 추가합니다.
- 각 coverslip에게 22 PBS의 1ml로 부드럽게 2-3 회 ° C. 와시
- 10 분 22 ° C에서 각 coverslip과 부화 0.1 % 트리톤 X-100/PBS의 400ul를 추가합니다.
- 각 coverslip에게 22 PBS의 1ml로 부드럽게 2-3 회 ° C. 와시
- 잠재적인 배경 얼룩을 줄이기 위해 20 분 동안 22 ° C에서 3퍼센트 소 혈청 알부민 (BSA) / PBS와 부화의 400ul를 추가합니다.
- 각 coverslip에게 22 PBS의 1ml로 부드럽게 2-3 회 ° C. 와시
- 직접 1 시간 22 ° C에서 coverslip과 부화에 PBS에서 기본 항체의 플레이스 100ul. 기본 및 보조 항체가 필요한 농도로 PBS에 희석한다. 이것은 사용되는 각각의 항체에 대한 최적화 할 수 있습니다.
- 각 coverslip에게 22 PBS의 1ml로 부드럽게 2-3 회 ° C. 와시
- ° C 떨어진 1 시간 빛으로부터 22 PBS과 부화에 이차 항체의 플레이스 200ul.
- 각 coverslip에게 22 PBS의 1ml로 부드럽게 2-3 회 ° C. 와시
- DAPI (4 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole 염산염)이있는 Vectashield 장착 매체를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 각각 coverslip을 (셀 아래) 마운트합니다.
- 종이 타월을 사용하여 coverslip 주위에서 초과 장착 매체를 닦고 적어도 30 분 거리 빛으로부터 22 ° C에서 슬라이드를 품어.
- 명확한 아크릴 매니큐어를 사용하여 유리 슬라이드에 coverslip을 수정.
- 형광 현미경으로 시각화하기 전에 멀리 빛으로부터 슬라이드를 유지.
IV. 대표 결과
그림 2. 비 transfected COS - 7 세포 Subcellular 분별 (분리). Fractionated 있으니까요 - 7 전지는 포름 알데히드와 고정 및 DAPI를 포함하는 설치 매체를 치료 다음 TRITC하는 복합 A / C 항체 α - Tubulin, α - 히스톤 H1 또는 α - Lamin를 사용 immunostained되었습니다 . 이미지 Leica 공촛점 현미경을 사용하여 10X 안구 렌즈와 63x 객관적인 렌즈로 인수했다. 세포 핵은 마커 항체 물들일 동일한 필드 셀이에 TRITC 필터 세트를 사용하여 시각 동안 DAPI 필터 세트를 사용하여 시각되었습니다.
그림 3. GFP - 6E2 융합 단백질은 핵 매트릭스와 연결되어 있습니다. 인간 papillomavirus (HPV) 유형 6 융합 녹색 형광 단백질 (GFP)로 구성된 융합 단백질을 표현 있으니까요 - 7 세포의 Subcellular 분별 (분리)E2 단백질 (GFP - 6E2). transfected 세포에 GFP - 6E2의 지방화는 GFP 형광을 통해 직접 시각 동안 세포 핵은 DAPI의 얼룩을 통해 시각되었습니다. Lamin A / C는 α - Lamin TRITC과 TRITC 필터 설정 복합 / C 항체를 사용하여 시각되었습니다. 병합 이미지는 GFP - 6E2 단백질 중 일부는 핵 매트릭스 (오른쪽 아래 패널)와 관련된 것을 밝히지. 그림 2에서 설명한대로 이미지를 취득했다.
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Discussion
일반적인 문제 및 제안 :
전부 또는 세포의 대부분은 세척하는 동안 손실됩니다. 세척 단계를하는 동안 액체는 coverslip을 피하 6 잘 접시의 측면으로 천천히 추가해야합니다. 마찬가지로 액체는 신중하게 틸팅 판에 의해 제거되어야하며 천천히 초과 액체를 pipetting. 세포 접착은 폴리 - L - 라이신 코팅 coverslips을 사용하여 증가 수 있습니다.
게놈 DNA가 완전히 소화하지 않습니다. 몇몇 세포 유형에 대한 DNAse I의 소화 단계는 게놈 DNA의 완전한 제거를 달성하기 위해 확장 및 / 또는 DNAse I의 농도가 증가해야 할 수 있습니다.
고정 및 분획화 유물. 어떤 단백질은 고정 또는 분별화 6 중 relocalize 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 예를 들어 핵 막의 핵심의 다음과 같은 장애에서 발표 단백질은 달리 잘 구분된 구획에있는 것입니다 사이트에 바인딩할 수 있습니다. 이러한 효과는 포름 알데히드의 자리에 paraformaldehyde를 사용하는 예를 들어 서로 다른 고정 방법을 사용하여 얻은 결과를 비교하여 최소화하실 수 있습니다. 라이브 셀 이미징은 적어도 3 전체 세포에 대한 도움이 될 수 있습니다.
이 기술은 잘 GFP 융합 단백질의 검출에 적합합니다. 그러나, 융합 단백질은 태그가 지정되지 않은 단백질과 유사한 방식으로 작동하는지 확인하는 것이 중요합니다. 이상의 표현은 크게 하위 세포 로컬 리 제이션을 변경할 수 있습니다 단백질 이후 단백질이 비교 수준에서 표현되는 적정에 의해 확인하는 것도 중요합니다.
기술의 응용 :
이 underutilized 기술은 단백질 지방화는 서로 다른 도메인 또는 subcellular 구조의 잘 특징 마커 참조로 결정 수있게하고 세포 생물학의 여러 분야에 걸쳐 응용 프로그램을하고 있습니다. 예를 들어, 많은 전사 요소는 세포질에 로컬 리 제이션과 복잡한 유통, 느슨하게 개최 nucleoplasm, 염색질 및 / 또는 핵 매트릭스 1,2,4를 표시합니다. 이러한 도메인의 각 지역화 단백질 기능뿐 아니라 단백질 회전율 및 사후 translational 수정에 영향을 미칠 수있다.
단백질 등 핵 매트릭스 같은 특정 도메인에 대한 공동 지역화 단백질 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 특정 신호 및 / 또는 파트너 단백질의 표현에 대한 응답으로 단백질 다시 로컬 리 제이션은 또한 단백질 기능 1,4에 되거 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
Anyaporn Sawasdichai 및 Nazefah 압둘 하미드는 박사에 대한 각각 로얄 태국 정부와 말레이시아 정부에 감사 장학금. 이 작품은 PSJ와 KG에게 수여 웰컴 트러스트 프로젝트 부여하여 자금을했습니다. 우리는 또한 브리스톨 울프슨의 Bioimaging 시설의 대학에 감사하고 있습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Chemical | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma-Aldrich | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | VWR | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma-Aldrich | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche Group | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32293 |
References
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