Summary
In situ subcellulaire fractionatie van zoogdiercellen op microscoop dekglaasjes kan de visualisatie van eiwit lokalisatie.
Abstract
Eiwit-functie is nauw gekoppeld aan eiwit lokalisatie. Hoewel sommige eiwitten zijn beperkt tot een specifieke locatie of subcellulaire compartiment, veel eiwitten aanwezig zijn als een vrij verspreiden van de bevolking in de vrije uitwisseling met een sub-populatie die nauw is gekoppeld aan een bepaalde subcellulaire domein of structuur. In situ subcellulaire fractionering kan de visualisatie van eiwit verkokering en kan ook zien eiwit subpopulaties die lokaliseren om specifieke structuren. Bijvoorbeeld, kan verwijdering van de oplosbare cytoplasmatische eiwitten en losjes nucleaire eiwitten onthullen de stabiele vereniging van een aantal transcriptiefactoren met chromatine. Latere spijsvertering van DNA kan in sommige gevallen openbaren associatie met het netwerk van eiwitten en RNA's die collectief wordt genoemd de nucleaire steiger of nucleaire matrix.
Hier beschrijven we de stappen die nodig zijn tijdens de in situ fractionering van het aanklevende en niet-hechtende cellen van zoogdieren op microscoop dekglaasjes. Eiwit visualisatie kan worden bereikt met behulp van specifieke antilichamen of TL-fusie-eiwitten en fluorescentie microscopie. Antilichamen en / of fluorescente kleurstoffen die fungeren als markers voor specifieke vakken of structuren laten eiwit lokalisatie in kaart worden gebracht in detail. In situ fractionering kan ook worden gecombineerd met western blotting om de hoeveelheden eiwit aanwezig is in elke fractie vergelijken. Deze eenvoudige biochemische benadering kan onthullen verenigingen die anders onopgemerkt zouden blijven.
Protocol
I. Voorbereiding voor fractionering
Dit gedeelte beschrijft de bereiding van poly-L-lysine gecoate dekglaasjes microscoop en de aanhechting van cellen voorafgaand aan de fractionering. Indien gewenst kunnen de cellen tijdelijk getransfecteerd worden met eiwit expressievectoren voor of na bevestiging.
A. Bereiding van poly-L-Lysine beklede dekglaasjes
- Bereid een oplossing van 1mg/ml poly-L-lysine in gedistilleerd water.
- Vacht schoon coverslips met poly-L-lysine door het incuberen van hen in de oplossing gedurende tenminste 1 uur op een schommelende platform bij 22 ° C.
- Twee keer was de beklede dekglaasjes met steriel gedestilleerd water en volgen met een een wasbeurt met 96% ethanol.
- De lucht drogen de gecoate dekglaasjes op een stuk filtreerpapier en bewaar ze in een droge container voor toekomstig gebruik (een keer droog ze kunnen worden gestapeld).
B. Bevestiging van cellen om coverslips
Niet-hechtende cellen (hier gebruiken we K562 cellen)
- Plaats een poly-L-lysine gecoat dekglaasje in een put in een 6-well plaat met het gecoate oppervlak naar boven.
- Zaad K562-cellen bij een dichtheid van 7x10 5 cellen / putje in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS), en de PS (penicilline 100units/ml, streptomycine 100mg/ml). In het geval van K562 cellen transiënte transfectie kan worden uitgevoerd met behulp van elektroporatie (0.4cm elektroporatie cuvetten met 1x10 7 cellen in 200μl van media op 250V / 975μF) voordat het zaaien van de cellen.
- Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C in 5% CO 2.
- Giet het medium en twee keer was de cellen met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Volg met de subcellulaire fractionatie protocol.
Hechtende cellen (hier gebruiken we Cos-7-cellen)
- Plaats een ongecoat dekglaasje in een goed in een 6-wells plaat.
- Was twee keer in PBS voorverwarmd bij 37 ° C.
- Maak de cellen door verteren met trypsine (0.03% EDTA, 0,25% trypsine) in PBS bij 37 ° C gedurende 2 tot 5 minuten. Het is belangrijk dat niet om de cellen te over-verteren en om de spijsvertering te stoppen zodra overwegend individuele drijvende cellen aanwezig zijn.
- Stop de spijsvertering door het zaaien van de cellen bij een dichtheid van 3x10 5 cellen / putje in een 6-wells plaat in DMEM aangevuld met 10% FBS en PSG (penicilline 100 eenheden / ml, streptomycine 100ug/ml en L-glutamine 292ug/ml) , op de normale dekglaasjes. Hechtende cellen over het algemeen goed hechten op een normale microscoop dekglaasjes, echter, poly-L-lysine beklede dekglaasjes kan worden gebruikt indien nodig.
- Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2. In het geval van COS-7 cellen transiënte transfectie kunnen worden uitgevoerd met behulp van Fugene 6 (Roche) indien nodig en de cellen links om nog eens 24 uur terug bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Giet het medium en twee keer was de cellen met ijskoude PBS.
- Volg met de subcellulaire fractionatie protocol.
II. Subcellulaire fractionering
In situ fractie wordt uitgevoerd volgens het schema in figuur 1 en is gebaseerd op een methode beschreven die eerder vijf met wijzigingen beschreven die eerder zeven en in de gedetailleerde protocol hieronder. Het wordt aanbevolen om de dekglaasjes over te dragen aan een nieuwe 6-wells plaat na elke stap in het verwijderen van de fractionering dekglaasje voordat u de vloeistof. Hoewel slechts vier dekglaasjes nodig zijn voor beeldvorming, zijn extra dekglaasjes nodig zijn om hele celextract en nucleaire matrix fracties voor western blotting als dit moet worden uitgevoerd in parallel te produceren.
- Voor te bereiden en filter cytoskelet buffer (CSK): 10mm BUIZEN, 300mm Sucrose, 100mm NaCl, 3mm MgCl2, 1 mM EGTA. CSK buffer moet vers worden bereid op de dag van fractionering.
- Indien gewenst kan de cellen van een dekglaasje kan worden gebruikt om hele celextract voor te bereiden op western blotting door zachtjes te plaatsen 200ul TES buffer (1% SDS, 2mm EDTA, 20mm Tris-HCl pH 7,4) direct op de dekglaasje en het incuberen voor 1 of 2 minuten bij 22 ° C. De hele cel extract kan vervolgens worden weggenomen en de eiwitten neergeslagen door het toevoegen van 250ul van 1M (NH 4) 2 SO 4 en incuberen op ijs totdat de andere westerse monsters zijn klaar.
- Twee keer was de resterende dekglaasjes met 1 ml ijskoude PBS bij 22 ° C door het kantelen van de zes goed-plaat twee of drie keer.
- Verwijder het dekglaasje die hele cellen en over te dragen aan een nieuwe 6-well plaat. Volg met de cel fixatie en immuno-fluorescentie-protocol.
- Verwijder voorzichtig het PBS van de overige bronnen.
- Pak de cytoplasmatische en losjes nucleaire eiwitten door zachtjes te plaatsen 200ul CSK buffer + 0,1% (V / V) Triton X-100 direct op elke resterende dekglaasje en incuberen opijs gedurende 1 minuut.
- Verwijder de cytoplasmatische en losjes nucleaire extract en neerslag zoals beschreven in stap 2.
- Twee keer was de dekglaasjes met 1 ml ijskoude PBS bij 22 ° C door het kantelen van de zes goed-plaat.
- Verwijder het dekglaasje die strak gehouden nucleair materiaal en volg met de cel fixatie en immuno-fluorescentie-protocol.
- Voorzichtig de PBS te verwijderen uit de overige wells pak dan de strak gehouden eiwitten door zachtjes te plaatsen 200ul CSK buffer + 0,5% (V / V) Triton X-100 direct op elke resterende dekglaasje en incuberen op ijs gedurende 20 minuten.
- Verwijder de strak gehouden extract en neerslag zoals beschreven in stap 2.
- Twee keer was de dekglaasjes met 1 ml ijskoude PBS bij 22 ° C door het kantelen van de zes goed-plaat.
- Verwijder het dekglaasje die chromatine fractie en volg met de cel fixatie en immuno-fluorescentie-protocol.
- Verwijder voorzichtig het PBS van de overige wells plaats dan 200ul CSK buffer + 100ug/ml van DNase I op de resterende dekglaasjes en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Verwijder de chromatine extract en neerslag zoals beschreven in stap 2.
- Was de dekglaasjes met ijskoude PBS twee keer bij 22 ° C door het kantelen van de zes goed-plaat.
- Verwijder het dekglaasje die de nucleaire matrix fractie en volgen met de cel fixatie en immuno-fluorescentie-protocol.
- Indien gewenst kan de matrix eiwitten kunnen worden verwijderd uit een extra matrix dekglaasje voor western blotting gebruik van 200ul TES buffer zoals beschreven in stap 2.
- Monsters voor western blot moet worden gecentrifugeerd bij 13000 rpm in een bench top microcentrifuge bij 4 ° C en de pellets opnieuw gesuspendeerd in 40ul SDS laadbuffer (62,5 mm Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS (w / v), 50 mM DTT, 10% glycerol, 0,01% broomfenolblauw (w / v)) vóór analyse door SDS-PAGE.
Figuur 1. Een schematische voorstelling van de in situ subcellulaire fractionatie. Cytoskelet buffer (CSK) bestaat uit 10 mM PIPES, 300mm Sucrose, 100mm NaCl, 3mm MgCl2, 1 mM EGTA. TES buffer bestaat uit 1% SDS, 2mm EDTA, 20mm Tris-HCl pH 7,4.
III. Cel fixatie en immuno-fluorescentie
- Voorzichtig toe te voegen 1 ml 4% formaldehyde / PBS aan elk dekglaasje en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Was elke dekglaasje voorzichtig 2-3 keer met 1 ml PBS bij 22 ° C.
- Voeg 400ul van 0,1% Triton X-100/PBS aan elke dekglaasje en incubeer bij 22 ° C gedurende 10 minuten.
- Was elke dekglaasje voorzichtig 2-3 keer met 1 ml PBS bij 22 ° C.
- Voeg 400ul van 3% Bovine Serum Albumine (BSA) / PBS en incubeer bij 22 ° C gedurende 20 minuten om potentiële achtergrondkleuring te verminderen.
- Was elke dekglaasje voorzichtig 2-3 keer met 1 ml PBS bij 22 ° C.
- Plaats 100ul van het primaire antilichaam in PBS direct op de dekglaasje en incubeer bij 22 ° C gedurende 1 uur. Primaire en secundaire antilichamen moeten worden verdund in PBS tot de gewenste concentratie. Dit moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor elke gebruikte antilichaam.
- Was elke dekglaasje voorzichtig 2-3 keer met 1 ml PBS bij 22 ° C.
- Plaats 200ul van secundaire antilichaam in PBS en incubeer bij 22 ° C verwijderd van het licht gedurende 1 uur.
- Was elke dekglaasje voorzichtig 2-3 keer met 1 ml PBS bij 22 ° C.
- Mount elk dekglaasje (cellen naar beneden) op een glas microscoopglaasje met behulp van Vectashield montage medium met DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole hydrochloride).
- Veeg overtollige montage medium uit de hele dekglaasje met behulp van een papieren handdoek en incubeer de glijbaan bij 22 ° C gedurende ten minste 30 minuten van het licht.
- Bevestig de dekglaasje om het glas schuiven met behulp van acryl nagellak.
- Houd de dia's uit de buurt van licht voor de visualisatie van fluorescentie microscopie.
IV. Representatieve resultaten
Figuur 2. Subcellulaire fractionering van niet-getransfecteerde COS-7 cellen. Gefractioneerde Cos-7-cellen werden gefixeerd met formaldehyde en immunostained met behulp van α-tubuline, α-histon H1 of α-Lamin A / C antilichamen geconjugeerd aan TRITC gevolgd door behandeling met montage medium dat DAPI . Beelden werden verkregen met 10x oculair lens en 63x objectief met behulp van een Leica confocale microscoop. Celkernen werden gevisualiseerd met behulp van een DAPI filter ingesteld terwijl in hetzelfde veld cellen gekleurd met stift antilichamen werden gevisualiseerd met behulp van een TRITC filter in te stellen.
Figuur 3. Een GFP-6E2 fusie-eiwit is geassocieerd met de nucleaire matrix. Subcellulaire fractionering van COS-7 cellen die een fusie-eiwit dat bestaat uit groen fluorescerend eiwit (GFP) gefuseerd met het humaan papillomavirus (HPV) type 6E2 eiwit (GFP-6E2). Celkernen werden zichtbaar via DAPI kleuring, terwijl lokalisatie van GFP-6E2 in de getransfecteerde cellen werd direct gevisualiseerd via GFP fluorescentie. Lamine A / C werd gevisualiseerd met behulp van α-Lamin A / C antilichamen geconjugeerd aan TRITC en een TRITC filter in te stellen. Het samenvoegen beelden laten zien dat een aantal van de GFP-6E2 eiwit is geassocieerd met de nucleaire matrix (onderste rechter paneel). Beelden werden verkregen zoals beschreven in figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vaak voorkomende problemen en suggesties:
Alle of de meeste van de cellen verloren zijn gegaan tijdens het wassen. Tijdens het wassen stappen vloeistoffen moeten langzaam worden toegevoegd aan de kant van de 6-wells plaat het vermijden van de dekglaasje aan. Op dezelfde vloeistoffen moeten worden verwijderd door voorzichtig kantelen van de plaat en langzaam pipetteren overtollige vloeistof. Celadhesie kan worden verhoogd met behulp van poly-L-Lysine beklede dekglaasjes.
Genomisch DNA is niet helemaal verteerd. Voor sommige soorten cellen de DNAse I spijsvertering stap kan worden uitgebreid en / of het DNAse I-concentratie verhoogd om volledige verwijdering van het genomisch DNA te bereiken.
Fixatie en fractionering artefacten. Het is belangrijk op te merken dat sommige eiwitten kunnen herlokaliseren tijdens de fixatie of fractionering 6. Eiwitten vrijgelaten uit de kern na verstoring van het nucleaire membraan bijvoorbeeld kunnen binden aan sites die anders zouden worden gevestigd in goed gescheiden compartimenten. Deze effecten kunnen worden geminimaliseerd door het vergelijken van de behaalde resultaten met behulp van verschillende methoden voor fixatie bijvoorbeeld met behulp van paraformaldehyde in plaats van formaldehyde. Live-cell imaging kan ook nuttig zijn voor gehele cellen minstens 3.
Deze techniek is uitermate geschikt voor de detectie van GFP fusie-eiwitten. Toch is het belangrijk om te bevestigen dat het fusie-eiwit gedraagt zich op een soortgelijke wijze op het gecodeerde eiwit. Het is ook belangrijk om te bevestigen door titratie dat de eiwitten worden uitgedrukt op een vergelijkbaar niveau sinds eiwit over-expressie kan drastisch veranderen sub-cellulaire lokalisatie.
Toepassingen van de techniek:
Deze techniek maakt het mogelijk onderbenut eiwit lokalisatie worden bepaald aan de hand van goed gekarakteriseerde markers van verschillende subcellulaire domeinen of structuren en heeft toepassingen in vele gebieden van de celbiologie. Bijvoorbeeld, veel transcriptiefactoren weer een complex distributie met lokalisatie naar het cytoplasma, losjes gehouden nucleoplasm, chromatine en / of nucleaire matrix 1,2,4. Lokalisatie in elk van deze domeinen kunnen beïnvloeden eiwitten functioneren als eiwitten omzet-en post-translationele modificaties.
Eiwit co-localisatie naar specifieke domeinen, zoals de nucleaire matrix kan bieden inzicht in de eiwit-functie. Eiwit re-lokalisatie in antwoord op specifieke signalen en / of de expressie van partner eiwitten kunnen ook licht werpen op eiwitfunctie 1,4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Anyaporn Sawasdichai en Nazefah Abdul Hamid Met dank aan de Koninklijke Thaise regering en de regering van Maleisië respectievelijk Ph.D. Beurzen. Dit werk werd gefinancierd door een Wellcome Trust projectsubsidie toegekend aan PSJ en KG. We zijn ook dankbaar voor de Universiteit van Bristol Wolfson BioImaging Facility.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Chemical | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma-Aldrich | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | VWR | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma-Aldrich | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche Group | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32293 |
References
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription. J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).
- Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins. Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).
- McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1. J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).
- McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking. J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).
- Melan, M. A., Sluder, G. Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy. J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).
- Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association. J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).
