Summary
In situ subzellulären Fraktionierung von Säugetierzellen auf Mikroskop-Deckgläser ermöglicht die Visualisierung von Protein-Lokalisierung.
Abstract
Protein-Funktion ist eng mit Proteinlokalisierung gekoppelt. Obwohl einige Proteine an einen bestimmten Ort oder subzellulären Kompartiment beschränkt sind, sind viele Proteine als frei diffundierenden Bevölkerung in freien Austausch mit einer Sub-Population, die eng mit einem bestimmten subzellulären Domäne oder der Struktur verbunden ist. In situ subzelluläre Fraktionierung ermöglicht die Visualisierung von Protein Kompartimentierung und kann auch zeigen, Protein Sub-Populationen, die auf bestimmte Strukturen zu lokalisieren. Zum Beispiel kann die Entfernung der löslichen zytoplasmatischen Proteine und locker gehaltenen nuklearen Proteine zeigen die stabile Assoziation von einigen Transkriptionsfaktoren mit Chromatin. Nachfolgende Verdauung von DNA kann in vielen Fällen den Zusammenhang mit dem Netzwerk von Proteinen und RNA, die zusammen den nuklearen Gerüst oder Kernmatrix bezeichnet wird.
Hier beschreiben wir die Schritte während der in situ-Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen auf Mikroskop-Deckgläser erforderlich. Protein-Visualisierung kann mit Hilfe spezifischer Antikörper oder fluoreszierende Fusionsproteine und Fluoreszenz-Mikroskopie werden. Antikörper und / oder fluoreszierende Farbstoffe, die als Marker für spezifische Abteilungen oder Strukturen zu agieren Proteinlokalisierung im Detail abgebildet werden. In situ-Fraktionierung kann auch mit Western-Blot auf die Mengen an Protein, das in jeder Fraktion vergleichen kombiniert werden. Diese einfache biochemische Verfahren deckt Verbände, die sonst bliebe unerkannt.
Protocol
I. Vorbereitung für die Fraktionierung
Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung von Poly-L-Lysin beschichtet Mikroskop Deckglas und die Anheftung von Zellen vor der Fraktionierung. Bei Bedarf können die Zellen transient mit Expressionsvektoren Protein entweder vor oder nach der Befestigung transfiziert.
A. Herstellung von Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser
- Bereiten Sie eine Lösung von 1mg/ml Poly-L-Lysin in destilliertem Wasser.
- Coat saubere Deckgläser mit Poly-L-Lysin durch Inkubation in der Lösung für mindestens 1 Stunde auf einem Wippschüttler bei 22 ° C.
- Waschen Sie die beschichtete Deckgläser mit sterilem destilliertem Wasser zweimal und folgen mit einmaligem Waschen mit 96% Ethanol.
- An der Luft trocknen beschichtete Deckgläser auf einem Stück Filterpapier und halten sie in einem trockenen Behältnis für die zukünftige Verwendung (nach dem Trocknen können sie gestapelt werden).
B. Anbringen Zellen Deckgläser
Nicht adhärente Zellen (hier benutzen wir K562-Zellen)
- Legen Sie eine Poly-L-Lysin beschichtet Deckglas in einem Brunnen in einem 6-Well-Platte mit der beschichteten Seite nach oben weisend.
- Seed K562-Zellen bei einer Dichte von 7x10 5 Zellen / well in Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und PS (Penizillin 100units/ml, Streptomycin 100mg/ml). Im Falle von K562-Zellen transiente Transfektion kann mittels Elektroporation (0.4cm Elektroporationsküvetten mit 1x10 7 Zellen in 200 ul von Medien bei 250V / 975μF) vor der Aussaat der Zellen sein.
- Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2.
- Abgießen des Mediums und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Folgen Sie mit der subzellulären Fraktionierung Protokoll.
Adhärente Zellen (hier benutzen wir Cos-7-Zellen)
- Ein unbeschichtetes Deckglas in einem Brunnen in einem 6-Well-Platte.
- Zweimal waschen in PBS vorgewärmt auf 37 ° C.
- Lösen Sie die Zellen durch Verdau mit Trypsin (0,03% EDTA, 0,25% Trypsin) in PBS bei 37 ° C für 2 bis 5 Minuten. Es ist wichtig, nicht zu stark zu verdauen die Zellen und die Verdauung an, sobald überwiegend einzelnen schwimmenden Zellen vorhanden sind.
- Stoppen Sie die Verdauung durch Aussaat der Zellen bei einer Dichte von 3x10 5 Zellen / Well in einer 6-Well-Platte in DMEM mit 10% FBS und PSG (Penicillin 100 Einheiten / ml, Streptomycin 100ug/ml und L-Glutamin 292ug/ml) ergänzt auf normale Deckgläser. Adhärenten Zellen im Allgemeinen gut befestigen auf normalen Mikroskop Deckgläser jedoch Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser verwendet werden können, wenn erforderlich.
- Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Im Falle von Cos-7-Zellen transiente Transfektion kann mit Fugene 6 (Roche), falls erforderlich, und die Zellen von links nach für weitere 24 Stunden bei 37 ° C zu erholen und 5% CO 2.
- Abgießen des Mediums und waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS.
- Folgen Sie mit der subzellulären Fraktionierung Protokoll.
II. Subzelluläre Fraktionierung
In situ-Fraktion wird nach dem Schema in Abbildung 1 dargestellt durchgeführt und basiert auf einer Methode zuvor beschriebenen 5 mit Änderungen zuvor beschrieben 7 und in der detaillierten Protokoll unten. Es wird empfohlen, die Deckgläschen in ein frisches 6-Well-Platte übertragen nach jeder Fraktionierung Schritt Entfernen des Deckglases vor dem Entfernen der Flüssigkeit. Obwohl nur vier Deckgläser für die Bildgebung erforderlich sind, werden zusätzliche Deckgläser müssen Ganzzellextrakt und Kernmatrix Fraktionen für Western-Blot, wenn dies parallel durchgeführt werden produzieren.
- Vorbereiten und Filter Zytoskelett-Puffer (CSK): 10mm PIPES, 300mm Saccharose, 100 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 1 mM EGTA. CSK-Puffer sollte frisch am Tag der Fraktionierung vorbereitet werden.
- Bei Bedarf kann die Zellen von einem Deckglas kann verwendet werden, um Ganzzellextrakt für Western-Blot vorbereitet durch sanftes Auflegen 200 &mgr; l TES-Puffer (1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4) direkt auf das Deckglas und Inkubation für 1 oder 2 Minuten werden bei 22 ° C. Die Ganzzellextrakt kann dann entfernt werden und die Proteine durch Zugabe von 250ul von 1M (NH 4) 2 SO 4 und Inkubieren auf Eis, bis die anderen westlichen Proben bereit sind.
- Waschen Sie den verbleibenden Deckgläser mit 1 ml eiskaltem PBS zweimal bei 22 ° C durch Kippen des 6-Well-Platte zwei-oder dreimal.
- Entfernen Sie das Deckglas für ganze Zellen und Überführung in ein frisches 6-Well-Platte. Folgen Sie mit der Zelle Fixierung und Immun-Fluoreszenz-Protokoll.
- Entfernen Sie vorsichtig das PBS aus den übrigen Bohrlöchern.
- Entpacken Sie die zytoplasmatische und locker gehaltenen nuklearen Proteinen durch sanftes Auflegen 200 &mgr; l CSK-Puffer + 0,1% (V / V) Triton X-100 direkt auf jede verbleibende Deckglas und Inkubation aufEis für 1 Minute.
- Entfernen Sie die zytoplasmatische und locker gehalten Kernextrakt und Niederschlag wie in Schritt 2 beschrieben.
- Waschen Sie die Deckgläser mit 1 ml eiskaltem PBS zweimal bei 22 ° C durch Kippen des 6-Well-Platte.
- Entfernen Sie das Deckglas vertreten dicht gehalten Kernmaterial und folgen mit der Zelle Fixierung und Immun-Fluoreszenz-Protokoll.
- Entfernen Sie vorsichtig das PBS aus den übrigen Bohrlöchern extrahieren Sie dann die dicht gehalten Proteine durch sanftes Auflegen 200 &mgr; l CSK-Puffer + 0,5% (V / V) Triton X-100 direkt auf jede verbleibende Deckglas und Inkubation auf Eis für 20 Minuten.
- Entfernen Sie die dicht gehalten extrahieren und Niederschlag wie in Schritt 2 beschrieben.
- Waschen Sie die Deckgläser mit 1 ml eiskaltem PBS zweimal bei 22 ° C durch Kippen des 6-Well-Platte.
- Entfernen Sie das Deckglas vertreten Chromatin-Fraktion und folgen mit der Zelle Fixierung und Immun-Fluoreszenz-Protokoll.
- Entfernen Sie vorsichtig das PBS aus den übrigen Bohrlöchern dann statt 200 &mgr; l CSK-Puffer + 100ug/ml von DNase I auf die restlichen Deckgläser und Inkubation für 30 Minuten bei 37 ° C.
- Entfernen Sie die Chromatin-Extrakt und Niederschlag wie in Schritt 2 beschrieben.
- Waschen Sie die Deckgläser mit eiskaltem PBS zweimal bei 22 ° C durch Kippen des 6-Well-Platte.
- Entfernen Sie das Deckglas, die die Kernmatrix-Fraktion und folgen mit der Zelle Fixierung und Immun-Fluoreszenz-Protokoll.
- Bei Bedarf kann die Matrix-Proteinen kann von einer zusätzlichen Matrix Deckglas für Western-Blot mit 200 &mgr; l TES-Puffer, wie in Schritt 2 beschrieben entfernt werden.
- Proben für die Western-Blot sollte bei 13000 rpm in einer Tischplatte Mikrozentrifuge bei 4 ° C zentrifugiert und die Pellets in 40ul SDS-Ladepuffer (62.5mm Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS (w / v), 50 mM DTT resuspendiert, 10% Glycerin, 0,01% Bromphenolblau (w / v)) vor der Analyse durch SDS-PAGE.
Abbildung 1. Eine schematische Darstellung der in situ subzelluläre Fraktionierung. Zytoskelett-Puffer (CSK) besteht aus 10 mM PIPES, 300mm Saccharose, 100 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 1 mM EGTA. TES-Puffer besteht aus 1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4.
III. Zell-Fixierung und Immunfluoreszenz
- Vorsichtig 1ml von 4% Formaldehyd / PBS in jedes Deckglas und inkubieren Sie bei 4 ° C für 30 Minuten.
- Waschen Sie jeden Deckglas vorsichtig 2-3 mal mit 1 ml PBS bei 22 ° C.
- Add 400ul von 0,1% Triton X-100/PBS jedem Deckglas und Inkubieren bei 22 ° C für 10 Minuten.
- Waschen Sie jeden Deckglas vorsichtig 2-3 mal mit 1 ml PBS bei 22 ° C.
- Add 400ul von 3% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS und Inkubation bei 22 ° C für 20 Minuten, um mögliche Hintergrundfärbung zu reduzieren.
- Waschen Sie jeden Deckglas vorsichtig 2-3 mal mit 1 ml PBS bei 22 ° C.
- Legen Sie 100 ul des primären Antikörpers in PBS direkt auf das Deckglas und Inkubieren bei 22 ° C für 1 Stunde. Primäre und sekundäre Antikörper sollten in PBS auf die gewünschte Konzentration verdünnt werden. Eventuell müssen Sie diese für jeden Antikörper verwendet optimiert werden.
- Waschen Sie jeden Deckglas vorsichtig 2-3 mal mit 1 ml PBS bei 22 ° C.
- Legen Sie 200 &mgr; l des sekundären Antikörpers in PBS und Inkubation bei 22 ° C vor Licht für 1 Stunde.
- Waschen Sie jeden Deckglas vorsichtig 2-3 mal mit 1 ml PBS bei 22 ° C.
- Berg jedes Deckglas (Zellen nach unten) auf einem Glasobjektträger mit Vectashield Montage-Medium mit DAPI (4 ',6-Diamino-2-phenylindole Hydrochlorid).
- Überschüssiges Eindeckmedium aus der ganzen Deckglas mit einem Papiertuch und inkubieren die Folie bei 22 ° C für mindestens 30 Minuten entfernt vom Licht.
- Befestigen Sie das Deckglas auf den Objektträger mit klarem Acryl Nagellack.
- Halten Sie die Folien vom Licht, bevor Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie.
IV. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 2. Subzellulären Fraktionierung von nicht-transfizierten COS-7-Zellen. Fraktionierte Cos-7-Zellen wurden mit Formaldehyd fixiert und immunhistochemisch mit α-Tubulin, α-Histon H1 oder α-Lamin A / C-Antikörper, konjugiert mit TRITC durch die Behandlung mit Montage-Medium mit DAPI gefolgt . Die Bilder wurden mit 10x Okular und 63x Objektiv mit einer Leica konfokalen Mikroskops erworben. Zellkerne wurden visualisiert mit einem DAPI-Filter gesetzt, während in dem gleichen Gebiet Zellen mit Marker-Antikörper gefärbt wurden visualisiert mit einem TRITC-Filter eingestellt.
Abbildung 3. Eine GFP-6E2-Fusionsprotein mit der Kernmatrix assoziiert. Subzelluläre Fraktionierung von Cos-7 Zellen, die ein Fusionsprotein bestehend aus grün fluoreszierende Protein (GFP) fusioniert mit dem humanen Papillomavirus (HPV) Typ 6E2-Protein (GFP-6E2). Zellkerne wurden visualisiert via DAPI-Färbung, während Lokalisation von GFP-6E2 in den transfizierten Zellen wurde direkt visualisiert via GFP-Fluoreszenz. Lamin A / C wurde unter Verwendung α-Lamin A / C-Antikörper, konjugiert mit TRITC und einem TRITC-Filter eingestellt. Die Zusammenführung Bilder zeigen, dass einige der GFP-6E2-Protein mit der Kernmatrix (untere rechte Tafel) verbunden ist. Bilder wurden wie in Abbildung 2 beschrieben.
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Discussion
Häufige Probleme und Anregungen:
Alle oder die meisten Zellen sind beim Waschen verloren. Während Waschschritte Flüssigkeiten müssen langsam auf die Seite der 6-Well-Platte zu vermeiden das Deckglas hinzugefügt werden. Auch Flüssigkeiten sollten durch vorsichtiges Kippen der Platte entfernt werden und langsam Abpipettieren überschüssige Flüssigkeit. Zelladhäsion vergrößert Verwendung von Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser werden.
Genomic DNA nicht vollständig verdaut. Für einige Zelltypen der DNAse I Verdau Schritt müssen möglicherweise verlängert werden und / oder die DNAse I-Konzentration erhöht, um die vollständige Entfernung der genomischen DNA zu erreichen.
Fixation und Fraktionierung Artefakte. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Proteine können während der Fixierung oder Fraktionierung 6 relokalisieren. Proteine aus dem Zellkern nach Unterbrechung der Kernmembran zum Beispiel freigesetzt werden können, um Websites, die sonst in gut getrennten Abteilen wäre zu binden. Diese Effekte können durch den Vergleich der Ergebnisse unter Verwendung verschiedener Methoden Fixierung zB mit Paraformaldehyd anstelle von Formaldehyd minimiert werden. Live Cell Imaging kann auch hilfreich sein für die ganze Zellen mindestens 3.
Diese Technik ist gut für die Detektion von GFP-Fusionsproteinen geeignet. Allerdings ist es wichtig, zu bestätigen, dass das Fusionsprotein in ähnlicher Weise verhält, die nicht markierte Protein. Es ist auch wichtig, durch Titration zu bestätigen, dass die Proteine bei einem vergleichbaren Grad ausgedrückt werden, da Protein-Überexpression dramatisch verändern können sub-zelluläre Lokalisation.
Anwendungen der Technik:
Dieses ausgelastete Technik erlaubt Proteinlokalisierung mit Bezug auf gut charakterisierte Marker für unterschiedliche subzelluläre Domänen oder Strukturen bestimmt werden und hat Anwendungen in vielen Bereichen der Zellbiologie. Beispielsweise zeigen viele Transkriptionsfaktoren eine komplexe Verteilung mit Lokalisierung in das Zytoplasma, locker gehaltenen Kernplasma, Chromatin und / oder Kernmatrix 1,2,4. Localization in jedem dieser Bereiche beeinflussen können Protein-Funktion sowie Protein-Turnover und post-translationale Modifikationen.
Protein Co-Lokalisation auf bestimmte Bereiche wie die Kernmatrix können Einblicke in Funktion von Proteinen liefern. Protein re-Lokalisierung in Reaktion auf bestimmte Signale und / oder die Expression von Partner-Proteine können auch Licht auf die Funktion von Proteinen 1,4.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Anyaporn Sawasdichai und Nazefah Abdul Hamid sind dankbar, dass die thailändische Regierung und der Regierung von Malaysia jeweils für Ph.D. Stipendien. Diese Arbeit wurde durch eine Wellcome Trust Projekt Zuschuss für PSJ und KG finanziert. Wir sind auch dankbar für die University of Bristol Wolfson Bioimaging Facility.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Chemical | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma-Aldrich | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | VWR | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma-Aldrich | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche Group | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32293 |
References
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