Summary
允许在原位显微镜盖玻片上的哺乳动物细胞的亚细胞分馏蛋白定位可视化。
Abstract
蛋白质的功能是紧密耦合的蛋白定位。虽然一些蛋白质被限制到特定的位置或亚细胞车厢，许多蛋白质是自由扩散，作为一个自由交流的的一个亚群，是与特定的亚细胞域或结构紧密相关的人口。允许的可视化，在原地的亚细胞分馏蛋白质的条块分割，还可以揭示蛋白质亚群，定位于特定的结构。例如，去除可溶性的细胞质蛋白和松散举行的核蛋白质可以揭示一些与染色质的转录因子的稳定协会。随后的DNA消化，可以揭示在某些情况下，协会与网络，统称为核脚手架或核基质蛋白和RNA的。
在这里，我们描述了在显微镜盖玻片壁和非贴壁的哺乳动物细胞原位分馏过程中所需的步骤。使用特异性抗体或荧光融合蛋白和荧光显微镜，可以达到蛋白质的可视化。抗体和/或行为，作为特定的车厢或结构的标记的荧光染料允许蛋白定位进行详细的映射。原位分馏也可以结合免疫印迹比较每个分数中蛋白质的数额。这个简单的生化方法可以揭示协会，否则仍未被发现。
Protocol
一，准备进行分馏
本节介绍了聚- L -赖氨酸涂层显微镜的盖玻片和细胞附着之前分馏的准备。如果需要的细胞可以瞬时转染与蛋白表达载体之前或之后附件。
A.制备聚- L -赖氨酸涂布盖玻片
- 准备一个1mg/ml的聚- L -赖氨酸的蒸馏水溶液。
- 清洁盖玻片大衣与聚- L -赖氨酸孵化摇椅平台上至少1小时的解决方案，在22 ° C。
- 用无菌蒸馏水冲洗涂盖玻片两次，并按照与单一，用96％乙醇洗。
- 空气干燥的滤纸上涂盖玻片和保存以供将来使用的干货柜（干燥后，他们可堆叠）。
B.附加细胞，以盖玻片
非贴壁细胞（这里我们使用K562细胞）
- 在6孔板与涂层表面朝上放置在一个良好的聚- L -赖氨酸的涂布盖玻片。
- 种子K562细胞在7x10 5个细胞的密度细胞/孔贝科的修改老鹰培养基（DMEM），辅以10％小牛血清（FBS），和PS（青霉素100units/ml，链霉素100mg/ml ）。在瞬时转染对K562细胞的情况下，可以进行播种前的细胞电（媒体200μL1 × 10 7细胞在250V /975μF0.4厘米电试管）。
- 在37 ° C在5％的CO 2孵育24小时的细胞。
- 倒掉的中期和细胞两次用冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 按照与亚细胞分馏协议。
贴壁细胞（这里我们使用COS - 7细胞）
- 在6孔板放置在一个良好的非涂布盖玻片。
- 在PBS清洗两次预热在37 ° C
- 细胞分离与胰蛋白酶的PBS（0.03％EDTA，0.25％胰蛋白酶）消化在37 ° C为2至5分钟。重要的是不要过度消化的细胞，并尽快停止消化，主要是个人的浮动细胞存在。
- 停止播种在3X10 5个细胞的密度细胞/孔的DMEM在6孔板与10％FBS和PSG（青霉素100单位/ ml，链霉素100ug/ml和L -谷氨酰胺292ug/ml）为辅的消化，正常的盖玻片。贴壁细胞一般附加到正常的显微镜盖玻片，但是，如果需要的话，可用于聚- L -赖氨酸涂布盖玻片。
- 在37 ° C和5％的CO 2孵育24小时的细胞。在瞬时转染COS - 7细胞的情况下可以使用Fugene 6（罗氏）如 果需要的话，并留下进一步的24小时内恢复在37的细胞° C和5％的CO 2。
- 倒掉的中期和冰冷的PBS洗细胞两次。
- 按照与亚细胞分馏协议。
二。亚细胞分馏
原位分数是根据原理图如图1所示，是一个方法根据前面描述的5修改描述以前7，并在下面的详细协议。建议去除盖玻片取出液体前，每个分馏步骤转移到一个新的6孔板的盖玻片。虽然只有四个盖玻片成像所需的，额外的盖玻片须出示全细胞提取物和免疫印迹，如果这是在并行执行核基质组分。
- 准备和过滤器骨架缓冲液（CSK）：10mm的管道，300mm的蔗糖，氯化钠100MM，MgCl 2的3MM，为1mM EGTA 。 CSK缓冲液应新鲜配制的一天，分馏。
- 如果需要从一个盖玻片的细胞可用于准备杂交西部全细胞提取物轻轻直接放置到盖玻片200ul工商业污水附加费（1％SDS，EDTA的2MM，20MM的Tris - HCl pH值7.4）缓冲和孵化为1或2分钟在22 ° C全细胞提取物可以被删除，蛋白质沉淀，加入250ul 1M（NH 4）2 SO 4冰孵化，直到其他西方样本准备。
- 其余盖玻片用1ml冰冷的PBS洗两次在22 ° C的倾斜6板两次或三次。
- 取出盖玻片，占整个细胞转移到一个新的6孔板。按照与细胞固定和免疫荧光协议。
- 轻轻地清除余下的井的PBS。
- 轻轻放置200ul CSK缓冲中提取的细胞质和松散举行的核蛋白质+ 0.1％（V / V）TRITON X - 100直接到其余每个盖玻片和孵化冰为1分钟。
- 取出细胞质和松散举行的核提取物和沉淀步骤2中所述。
- 用1ml冰冷的PBS冲洗盖玻片两次在22 °倾斜6板彗星。
- 取出盖玻片，紧紧举行的核材料，并按照与细胞固定和免疫荧光协议。
- 轻轻地清除余下的井的PBS，轻轻地放在+ 0.5％（V / V）Triton X - 100的的直接到其余每个盖玻片200ul CSK的缓冲区，并在冰上孵育20分钟，然后提取紧紧举行的蛋白质。
- 取出紧密举行的提取物和沉淀步骤2中所述。
- 用1ml冰冷的PBS冲洗盖玻片两次在22 °倾斜6板彗星。
- 取出盖玻片染色分数，并按照与细胞固定和免疫荧光协议。
- 轻轻地清除余下的井的PBS然后将200ul CSK缓冲+ 100ug/ml DNA酶我到剩余的盖玻片和30分钟的孵育在37 ° C。
- 取出染色质的提取物和沉淀步骤2中所述。
- 两次在22 ° C的倾斜板与冰冷的PBS冲洗盖玻片。
- 取出盖玻片，核基质分数，并按照与细胞固定和免疫荧光协议。
- 如果所需的基质蛋白，可以被删除，从西部的额外矩阵印迹使用步骤2中所述200ul工商业污水附加费缓冲区盖玻片。
- 在替补出场的4个顶部的离心，免疫印迹的样品应在13000转离心° C和重悬于40ul SDS上样缓冲液（62.5mM的Tris - HCl pH值6.8，2％SDS（W / V），50毫米数码地面电视的颗粒， 10％甘油，0.01％溴酚蓝（W / V）），然后通过SDS - PAGE分析。
图1。一个示意图，在原地的亚细胞分馏。骨架缓冲液（CSK）由10mm的管道，300mm的蔗糖， 氯化钠 100MM，MgCl 2的3MM，为1mM EGTA。工商业污水附加费的缓冲区由1％SDS，2MM 20MM的Tris - HCl pH 7.4的EDTA，。
三。细胞固定和免疫荧光
- 轻轻地添加4％的甲醛/ PBS 1ml到每个盖玻片，并在4 ° C孵育30分钟。
- 每个盖玻片洗净1毫升的PBS轻轻的2-3倍在22 ° C
- 添加0.1％，海卫一X-100/PBS 400ul每个盖玻片，在22 ° C孵育10分钟。
- 每个盖玻片洗净1毫升的PBS轻轻的2-3倍在22 ° C
- 20分钟加3％的牛血清白蛋白（BSA）/ PBS和孵化400ul在22 ° C，以减少潜在的背景染色。
- 每个盖玻片洗净1毫升的PBS轻轻的2-3倍在22 ° C
- 在PBS的主要抗体100ul直接到盖玻片，在22 ° C孵育1小时。小学和中学的抗体，应在PBS稀释至所需浓度。这可能需要为每个使用的抗体进行了优化。
- 每个盖玻片洗净1毫升的PBS轻轻的2-3倍在22 ° C
- 将200ul的PBS孵育二级抗体在22 ° C间距离为1小时。
- 每个盖玻片洗净1毫升的PBS轻轻的2-3倍在22 ° C
- 装载到一个玻璃显微镜幻灯片使用Vectashield安装培养基中含有的DAPI（4',6 - diamidino - 2 -苯基吲哚盐酸盐）每个盖玻片（细胞下跌）。
- 从周围的盖玻片，用纸巾擦去多余的安装介质，并在22 ° C孵育至少30分钟，避光的幻灯片。
- 修复盖玻片载玻片上，用丙烯酸指甲油。
- 保持幻灯片避光前荧光显微镜可视化。
四。代表性的成果
图2。非转染COS - 7细胞，亚细胞分馏，分馏的COS - 7细胞用甲醛固定，免疫染色使用的A / C抗体结合，以TRITC安装介质中含有的DAPI治疗α-微管蛋白，α-组蛋白H1或α-拉明。图片获得10倍的目镜和使用徕卡共聚焦显微镜63X物镜。细胞核使用DAPI荧光标记抗体染色的细胞在同一领域的可视化使用一个TRITC的过滤器设置的过滤器设置的可视化。
图3。一个GFP - 6E2的融合蛋白是与核基质 。COS - 7细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）的融合，人类乳头状瘤病毒（HPV）6型组成的融合蛋白的亚细胞分馏E2蛋白（GFP - 6E2）。通过DAPI染色观察细胞核，而在转染细胞的GFP - 6E2本地化是直接通过GFP荧光的可视化。拉明一个/可视化使用α-核纤层蛋白A / C抗体结合TRITC和TRITC的过滤器设置。合并的图像显示，一些GFP - 6E2蛋白与核基质（右下面板）。在图2所描述的图像。
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Discussion
共同的问题和建议：
在清洗过程中的全部或大部分细胞都将丢失。在洗涤步骤中的液体必须避免盖玻片的6孔板边缓慢加入。同样的液体，应仔细倾斜板中删除，并慢慢地移液多余的液体。使用聚- L -赖氨酸涂布盖玻片，可提高细胞粘附。
基因组DNA是没有完全消化。对于某些类型的细胞的DNA酶I消化步骤，可能需要进行扩展和/或DNA酶I浓度增加，以达到彻底去除基因组DNA。
固定和分馏文物。重要的是要注意的一些蛋白质，可以relocalize在固定或分馏 6 。例如核膜的细胞核从下列扰乱发布的蛋白可以绑定，否则将在位于很好的分离车厢的网站。通过比较得到的结果，使用不同的固定方法，例如使用多聚甲醛代替甲醛，这些影响降到最低限度。活细胞成像，也可以帮助至少 3个全细胞。
这种技术是非常适合的GFP融合蛋白的检测。然而，重要的是要证实该融合蛋白在以类似的方式行为无标记蛋白质。同样重要的是滴定法确认的蛋白质，因为蛋白质的过度表达，可以极大地改变亚细胞定位相若表示。
该技术的应用：
这没有得到充分利用的技术可以参照不同的亚细胞域或结构特征的标记蛋白定位和细胞生物学的许多领域之间的应用。例如，许多转录因子显示复杂的分销与本地化细胞质，核质松散举行，染色质和/或核基质1,2,4。在这些领域的每一个本地化可以影响蛋白质的功能以及蛋白质周转和翻译后修饰。
特定域，如核基质蛋白的共定位蛋白质的功能可以提供见解。针对特定的信号和/或伴侣蛋白的表达的蛋白质重新定位，也可以揭示蛋白质的功能1,4。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
Anyaporn Sawasdichai Nazefah阿卜杜勒哈米德感谢泰王国政府和马来西亚政府，分别为博士奖学金。这项工作是由威康信托项目荣获PSJ和KG授予。我们也感谢布里斯托尔大学欧胜生物成像设施。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Chemical | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma-Aldrich | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | VWR | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma-Aldrich | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche Group | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32293 |
References
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription. J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).
- Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins. Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).
- McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1. J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).
- McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking. J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).
- Melan, M. A., Sluder, G. Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy. J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).
- Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association. J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).
