Summary
ב חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים על coverslips מיקרוסקופ מאפשר הדמיה של לוקליזציה חלבון.
Abstract
תפקוד החלבון מצמידים הדוק לוקליזציה חלבון. למרות שחלק חלבונים מוגבלים במיקום מסוים או תא subcellular, חלבונים רבים נמצאים כאוכלוסייה לשדר באופן חופשי בתמורה חופשי עם האוכלוסייה משנה הקשור באופן הדוק עם תחום מבנה subcellular מסוים. חלוקה ב subcellular באתרו מאפשרת ויזואליזציה של חלבון מידור יכול גם לגלות חלבון תת אוכלוסיות למקם מבנים ספציפיים. למשל, הסרת חלבונים מסיסים cytoplasmic וחלבונים גרעיני שנערך רופף יכול לחשוף את הקשר היציב של כמה גורמי שעתוק עם הכרומטין. לאחר העיכול של דנ"א יכולה במקרים מסוימים לחשוף בשיתוף עם רשת של חלבונים RNAs אשר נקרא קולקטיבי הפיגום גרעיני או מטריצה גרעיני.
כאן אנו מתארים את השלבים הנדרשים במהלך של חלוקה באתרו של בתאי יונקים חסיד ולא חסיד על coverslips מיקרוסקופ. ויזואליזציה חלבון יכולה להיות מושגת באמצעות נוגדנים ספציפיים או חלבונים היתוך ניאון מיקרוסקופ פלואורסצנטי. נוגדנים ו / או צבעי ניאון כי לשמש סמנים של תאים או מבנים ספציפיים לאפשר לוקליזציה חלבון למפות בפירוט. חלוקה ב באתרו ניתן גם לשלב עם המערבי סופג להשוות את כמויות החלבון הנמצאים בכל חלק. גישה זו ביוכימי פשוט יכול לחשוף עמותות שאחרת להישאר מבלי שיבחינו בו.
Protocol
I. הכנה חלוקה
סעיף זה מתאר את ההכנה של פולי-L-ליזין coverslips מיקרוסקופ מצופה את הקובץ המצורף של תאים לפני חלוקה. אם יש צורך בתאים ניתן transfected transiently עם וקטורים ביטוי חלבון לפני או אחרי המצורף.
א הכנת poly-L-ליזין coverslips מצופה
- הכן פתרון של 1mg/ml poly-L-ליזין במים מזוקקים.
- מעיל coverslips נקי עם פולי-L-ליזין ידי דוגרים להם בפתרון לפחות שעה 1 על פלטפורמה מתנדנדת על 22 ° C.
- שטפו את coverslips מצופה מים מזוקקים סטריליים פעמיים ובצע עם לשטוף יחיד עם אתנול 96%.
- האוויר היבש coverslips מצופה על פיסת נייר לסנן ולשמור אותם במיכל יבש לשימוש עתידי (יבש פעם אחת הם יכולים להערם).
B. תאים צירוף coverslips
Non-חסיד תאים (כאן אנו משתמשים בתאי K562)
- מניחים coverslip poly-L-ליזין מצופה בבאר בצלחת 6-היטב עם משטח מצופה פונה כלפי מעלה.
- K562 Seed תאים בצפיפות של 7x10 5 תאים / היטב השתנה Dulbecco של הנשרים בינוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), ו - PS (פניצילין 100units/ml, 100mg/ml סטרפטומיצין). במקרה של K562 תאים transfection חולף יכול להתבצע באמצעות electroporation (0.4cm cuvettes electroporation עם 1x10 7 תאים 200μl של התקשורת על 250V / 975μF) לפני זריעת התאים.
- דגירה התאים למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- יוצקים מעל בינוני לשטוף את התאים פעמיים עם פוספט קרים שנאגרו מלוחים (PBS).
- פעל עם פרוטוקול חלוקה subcellular.
תאים חסיד (כאן אנו משתמשים קוס-7 תאים)
- הצב coverslip ציפוי בבאר בצלחת 6 באר.
- לשטוף פעמיים PBS prewarmed על 37 ° C.
- ניתוק התאים על ידי עיכול עם טריפסין (0.03% EDTA, טריפסין 0.25%) ב-PBS על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 5 דקות. חשוב לא להפריז לעכל את התאים כדי לעצור את העיכול בהקדם תאים בודדים צפים בעיקר נוכחים.
- עצור את מערכת העיכול על ידי זריעת התאים בצפיפות של 3x10 5 תאים / היטב צלחת 6-באר DMEM בתוספת 10% FBS ו PSG (פניצילין 100 יחידות / מ"ל, סטרפטומיצין 100ug/ml ו-L-גלוטמין 292ug/ml) , על coverslips נורמלי. התאים בדרך כלל חסיד לצרף גם על coverslips מיקרוסקופ רגיל, לעומת זאת, פולי-L-ליזין coverslips מצופה ניתן להשתמש לפי הצורך.
- דגירה התאים למשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. במקרה של קוס-7 תאים transfection חולף יכול להתבצע באמצעות Fugene 6 (Roche), אם נדרש התאים שמאל להתאושש במשך 24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- יוצקים מעל בינוני לשטוף את התאים פעמיים עם קרח קר PBS.
- פעל עם פרוטוקול חלוקה subcellular.
השנייה. Subcellular חלוקה
בשבריר באתרו נעשה על פי סכימטי שמוצג באיור 1 והיא מבוססת על שיטה שתואר לעיל 5 עם שינויים שתואר לעיל 7 ו בפרוטוקול כמפורט להלן. מומלץ להעביר את coverslips לצלחת 6-היטב טרי הבאים כל צעד חלוקה הסרת coverslip לפני הסרת נוזל. אמנם רק ארבע coverslips נדרשים עבור הדמיה, coverslips נוספים נדרשים כדי לייצר תמצית התא כולו שברים מטריצה גרעינית המערבי סופג אם זה להתבצע במקביל.
- הכן ולסנן cytoskeleton חיץ (CSK): צינורות 10mm, סוכרוז 300 מ"מ, 100 מ"מ NaCl, 3mm MgCl 2, 1mm EGTA. חיץ CSK צריכים להיות מוכנים טרי ביום החלוקה.
- אם יש צורך בתאים מ coverslip אחד יכול לשמש כדי להכין תמצית התא כולו המערבי סופג בעדינות על ידי הצבת TES 200ul חיץ (1% SDS, EDTA 2 מ"מ, 20 מ"מ טריס-HCl pH 7.4) ישירות על גבי coverslip ו דוגרים על 1 או 2 דקות בשעה 22 ° C. תמצית התא כולו לאחר מכן ניתן להסיר את החלבונים זירז ידי הוספת 250ul של 1M (NH 4) 2 SO 4 ו דוגרים על הקרח עד דגימות מערביות אחרות מוכנים.
- שטפו את coverslips הנותרים עם 1ml קרים PBS פעמיים ב 22 ° C על ידי הטיית 6 היטב צלחת פעמיים או שלוש פעמים.
- הסר את coverslip המייצג תאים שלמים ולהעביר לצלחת 6-גם טרי. פעל עם קיבוע התא חיסונית הקרינה פרוטוקול.
- בעדינות להסיר את PBS מבארות הנותרים.
- חלץ את החלבונים גרעיני cytoplasmic והחזיק בעדינות רופף על ידי הצבת חיץ CSK 200ul + 0.1% (V / V) טריטון X-100 ישירות על גבי coverslip כל שאר דוגרים עלקרח למשך דקה 1.
- הסר את תמצית גרעיני cytoplasmic והחזיק ברפיון לזרז כמתואר בשלב 2.
- שטפו את coverslips עם 1ml קרים PBS פעמיים ב 22 ° C על ידי הטיית 6 היטב צלחת.
- הסר את coverslip המייצגים חומר גרעיני בחוזקה ופעל עם קיבוע התא חיסונית הקרינה פרוטוקול.
- בעדינות להסיר את PBS מבארות הנותרים ואז לחלץ את החלבונים בעדינות החזיקו בחוזקה על ידי הצבת חיץ CSK 200ul + 0.5% (V / V) טריטון X-100 ישירות על גבי coverslip כל שאר דוגרים על קרח במשך 20 דקות.
- הסר את תמצית החזיקה בחוזקה לזרז כמתואר בשלב 2.
- שטפו את coverslips עם 1ml קרים PBS פעמיים ב 22 ° C על ידי הטיית 6 היטב צלחת.
- הסר את coverslip המייצג חלק הכרומטין ופעל עם קיבוע התא חיסונית הקרינה פרוטוקול.
- בעדינות להסיר את PBS מבארות הנותרים אז 200ul מקום CSK חיץ + 100ug/ml של DNase אני אל coverslips הנותרים דגירה במשך 30 דקות על 37 ° C.
- הסר את תמצית הכרומטין לזרז כמתואר בשלב 2.
- שטפו את coverslips עם קרח קר PBS פעמיים ב 22 ° C על ידי הטיית 6 היטב צלחת.
- הסר את coverslip המייצג את חלק מטריצה גרעיני ופעל עם קיבוע התא חיסונית הקרינה פרוטוקול.
- אם יש צורך חלבונים המטריצה ניתן להסיר coverslip מטריצה נוספת המערבי סופג באמצעות TES חיץ 200ul כמתואר בשלב 2.
- דוגמאות עבור כתם המערבי צריך להיות centrifuged בסל"ד 13000 ב microcentrifuge ספסל העליון על 4 מעלות צלזיוס, את כדורי resuspended ב 40ul SDS טוען חיץ (62.5mM טריס-HCl pH 6.8, SDS 2% (w / v), 50 מ"מ DTT, גליצרול 10%, 0.01% bromophenol כחול (w / v)) לפני הניתוח על ידי-SDS.
באיור 1. ייצוג סכמטי של חלוקה ב subcellular באתרה. Cytoskeleton חיץ (CSK) מורכב צינורות 10mm, סוכרוז 300 מ"מ, 100 מ"מ NaCl, 3mm MgCl 2, 1mm EGTA. TES המאגר מורכב של 1% SDS, EDTA 2 מ"מ, 20 מ"מ טריס-HCl pH 7.4.
ג. תא קיבעון ו חיסונית פלואורסצנטי
- בעדינות להוסיף 1ml של פורמלדהיד 4% / PBS כדי coverslip כל דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- לשטוף כל coverslip בעדינות 2-3 פעמים עם 1ml של PBS על 22 ° C.
- הוסף 400ul של X-100/PBS טריטון 0.1% ל coverslip כל לדגור על 22 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לשטוף כל coverslip בעדינות 2-3 פעמים עם 1ml של PBS על 22 ° C.
- הוסף 400ul של 3% שור סרום אלבומין (BSA) / PBS ו לדגור על 22 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להפחית מכתים רקע פוטנציאליים.
- לשטוף כל coverslip בעדינות 2-3 פעמים עם 1ml של PBS על 22 ° C.
- המקום 100ul של הנוגדן העיקרי PBS ישירות על גבי coverslip ו דגירה על 22 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. נוגדנים ראשוניים ומשניים צריך להיות מדולל PBS לריכוז הנדרש. זה אולי צריך להיות מותאם עבור נוגדן כל שימוש.
- לשטוף כל coverslip בעדינות 2-3 פעמים עם 1ml של PBS על 22 ° C.
- המקום 200ul של נוגדנים משני PBS ו לדגור על 22 ° C מן האור למשך שעה 1.
- לשטוף כל coverslip בעדינות 2-3 פעמים עם 1ml של PBS על 22 ° C.
- הר כל coverslip (תאים למטה) על גבי זכוכית נושאת מיקרוסקופ באמצעות מדיום Vectashield הרכבה המכיל DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole hydrochloride).
- נגב בינוני הרכבה עודף מרחבי coverslip בעזרת מגבת נייר דגירה את השקופית על 22 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות מן האור.
- תקן את coverslip לשקופית באמצעות זכוכית ללטש ברור מסמר אקרילי.
- שמור את השקופיות מן האור לפני להדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
IV. נציג תוצאות
איור 2. חלוקה subcellular הלא transfected COS-7 תאים. מופרדים קוס-7 תאים תוקנו עם פורמאלדהיד immunostained באמצעות α-טובולין, α-היסטון H1 או α-lamin A / C נוגדנים מצומדות כדי TRITC ואחריו טיפול בינוני הרכבה המכיל DAPI . תמונות שנרכשו עם עדשה עינית 10x ו 63x עדשה אובייקטיבי באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה. גרעין התא היו דמיינו באמצעות מערכת סינון DAPI בעוד התאים אותו שדה מוכתם נוגדנים סמן היו דמיינו באמצעות מערכת סינון TRITC.
איור 3. חלבון ה-GFP-6E2 היתוך קשורה המטריצה גרעיני. Subcellular חלוקה של קוס-7 תאים לבטא חלבון איחוי המכיל חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) התמזגו וירוס הפפילומה האנושי (HPV) סוג 6E2 חלבון (GFP-6E2). גרעין התא היו דמיינו באמצעות מכתים DAPI בעוד לוקליזציה של ה-GFP-6E2 בתאי transfected היה דמיינו ישירות דרך ה-GFP פלואורסצנטי. Lamin / C היה דמיינו באמצעות α-lamin A / C נוגדנים מצומדות כדי TRITC ומערכת סינון TRITC. התמונות למזג לגלות כי חלק של חלבון ה-GFP-6E2 קשורה המטריצה גרעיני (הפאנל הימנית התחתונה). תמונות התקבלו כמתואר באיור 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעיות נפוצות והצעות:
כל או רוב התאים הם איבדו במהלך הכביסה. במהלך השלבים כביסה נוזלים יש להוסיף באיטיות לצד צלחת 6-היטב את הימנעות coverslip. כמו כן נוזלים יש להסיר על ידי הטיית הצלחת בזהירות ולאט לאט pipetting את הנוזלים העודפים. הידבקות התא ניתן להגדיל באמצעות פולי-L-ליזין coverslips מצופה.
הדנ"א הגנומי אינו מתעכל לגמרי. עבור כמה סוגי תאים הצעד אני DNAse העיכול ייתכן שיהיה צורך להאריך ו / או ריכוז אני DNAse מוגברת על מנת להשיג הסרה מלאה של ה-DNA הגנומי.
קיבוע וחפצי חלוקה. חשוב לציין כי חלבונים מסוימים יכולים relocalize במהלך קיבעון או חלוקה 6. חלבונים שוחרר מבית שיבוש הגרעין הבאות של קרום הגרעין למשל יכול להיקשר לאתרים שאחרת היה ממוקם תאים מופרדים היטב. תופעות אלו ניתן למזער על ידי השוואת התוצאות המתקבלות בשיטות קיבוע שונים למשל באמצעות paraformaldehyde במקומו של פורמלדהיד. הדמיה תא חי יכול גם להיות מועיל עבור תאים שלמים לפחות 3.
טכניקה זו מתאימה היטב זיהוי של חלבונים GFP היתוך. עם זאת, חשוב לוודא את החלבון היתוך מתנהג באופן דומה לחלבון לא מתוייגת. חשוב גם כדי לאשר על ידי טיטרציה כי החלבונים באים לידי ביטוי ברמות דומות מאז חלבון מעל הביטוי יכול לשנות באופן דרמטי המשנה הסלולר לוקליזציה.
יישומים של הטכניקה:
טכניקה זו מאפשרת underutilized לוקליזציה חלבון שייקבע תוך התייחסות סמנים היטב מאופיין של תחומים subcellular או מבנים שונים ברחבי יש יישומים בתחומים רבים של ביולוגיה של התא. לדוגמה, גורמי שעתוק רבים להציג הפצה מורכבת עם לוקליזציה הציטופלסמה, nucleoplasm שנערך רופף, הכרומטין ו / או גרעיני מטריקס 1,2,4. לוקליזציה בכל התחומים הללו יכולים להשפיע על תפקוד החלבון, כמו גם מחזור חלבון ופוסט translational שינויים.
חלבון שיתוף לוקליזציה לתחומים ספציפיים, כגון מטריקס גרעיני יכול לספק תובנות תפקוד החלבון. חלבון מחדש לוקליזציה בתגובה לאותות ספציפיים ו / או ביטוי של חלבונים שותף יכול גם לשפוך אור על 1,4 תפקוד החלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
Anyaporn Sawasdichai ו Nazefah עבדול חמיד מודים לממשלת רויאל תאילנדי ממשלת מלזיה בהתאמה Ph.D. מלגות. עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome הפרויקט להעניק הוענק PSJ ו KG. אנחנו גם מודה לאוניברסיטת מתקן bioimaging וולפסון בריסטול.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Chemical | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| DNase I | Chemical | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | Chemical | Sigma-Aldrich | P-8920 | |
| Trypsin | Chemical | |||
| EGTA | Chemical | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | Chemical | VWR | 284216N | |
| PIPES | Chemical | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | Chemical | Sigma-Aldrich | T-6876 | |
| Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche Group | 11814443001 | |
| Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-8030 | |
| Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-20681 | |
| Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32293 |
References
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription. J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).
- Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins. Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).
- McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1. J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).
- McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking. J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).
- Melan, M. A., Sluder, G. Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy. J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).
- Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association. J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).
