Summary
Теломеры имеют важное значение для стабильности и хромосом теломеры G-навес структура будет необходима для теломеразы-опосредованной обслуживание теломер. Мы недавно приняли два метода для обнаружения теломер G-навес структуры в
Abstract
Теломер G-навес структуры были выявлены во многих эукариот, включая дрожжи, позвоночных и Trypanosoma brucei. Она служит в качестве субстрата для теломеразы для вновь синтеза ДНК теломер и, следовательно, важным для поддержания теломер. Т. brucei является простейшим паразитом, который вызывает сонную болезнь у людей и Нагана крупного рогатого скота. После заражения млекопитающего, Т. brucei клетка регулярно переключает свой поверхностный антиген уклониться от иммунной атаки хозяев. Недавно мы показали, что Т. brucei теломер структура играет важную роль в регулировании поверхностного антигена экспрессии генов, которая имеет решающее значение для Т. brucei патогенез. Тем не менее Т. brucei теломер структура не изучена из-за ограничений методов анализа этой специализированной структуры. Мы уже успешно внедрен в родном-гель гибридизации и лигирования-опосредованной удлинения праймера методы изучения теломер G-навес структуры и метод перевязки адаптер для определения теломеров терминал нуклеотид в Т. brucei клеток. Здесь мы опишем протоколов в деталях и сравнить их преимущества и ограничения.
Protocol
1. Обнаружение T. brucei теломер G-навес с помощью собственных В-гель Гибридизация 3
Принцип (рис. 1): В родном состоянии, конец меченных (CCCTAA) 4 (TELC) олиго зонд может только гибридизуются с одноцепочечной теломер G-навес регионе. Гибридизации интенсивность пропорциональна длине свеса. После денатурации и нейтрализации же зонда смогут скрещиваться для всего региона теломер. Гибридизации интенсивности представляет собой общее количество ДНК теломер и может быть использован в качестве управления загрузкой. Два стандартных элементов управления для этого эксперимента гибридизации с использованием конечного помечены (TTAGGG) 4 (TELG) олиго зонд, которые не должны давать какой-либо сигнал, что и Т. brucei ячейка не имеет теломер C-навес структуры, и относиться к геномной ДНК с 3'-конкретных одноцепочечной экзонуклеаз таких как Exo я или Exo Т до гибридизации, которая должна устранить родные TELC сигнал гибридизации.
Шаг 1. Подготовка ДНК зажигания для импульсного гель-электрофореза поле (PFGE)
Неповрежденная хромосомы будут разделены PFGE. Таким образом, геномной ДНК готовят ДНК зажигания.
- Начните с 100 мл клеток крови виде (на 1,5 -2 млн. кл / мл) или 20 мл procyclic клеток (на 10 млн. кл / мл).
- Растворите 1,6% низкой температурой плавления (LMP) агарозы в L буфера (0,01 М Трис • CL рН 7,6, 0,02 M NaCl, 0,1 М ЭДТА рН 8,0) и сохранить его теплым при температуре 50 ° C.
- Урожай клетки центрифугированием при 1,5 krpm, 4 ° С в течение 10 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток с L буфер конечной концентрации 5 миллионов клеток / мл.
- Инкубируйте клеточной суспензии на 42-50 ° С в течение 10 мин.
- Добавить 1 объем LMP агарозном до 1 объема клеток. Хорошо перемешайте, но быстро.
- Алиготе 85 мкл клеточной суспензии в каждую лунку одноразовые формы пробку (BioRad).
- Через 5-10 минут или до пробки затвердевшего, передача вставляется в 15 мл коническую трубку с 5 мл буфера L / 1% Sarkosyl. Добавить 100 мкл 250 мг / мл протеиназы К или щепотку протеиназы К порошок, хорошо перемешать и инкубировать при температуре 50 ° С в течение 48 часов.
- Откажитесь от буфера, мыть зажигания с 5 мл L буфера в два раза и повторить протеиназы К пищеварение еще 48 часов. Вымойте зажигания с свежего буфера L снова. Магазин пробками при температуре 4 ° С в буфере L. Эти вилки должны быть использованы в течение 2 недель.
Шаг 2. Отдельные нетронутыми Т. brucei хромосом использованием импульсного гель-электрофореза поле
- Подготовка агарозном геле
- Подготовка 2-3 л 0,5 х TBE буфере и трансфер в гель работает палаты CHEF DRII (BioRad) единицы. Установить рабочей температуры, включите насос, а затем начать холодильным агрегатом.
- Подготовка 100 мл 1,2% агарозном геле в буфере 0,5 х TBE. Прохладный агарозы при настройке гель лоток.
- Решите заказа образца. Не забудьте включить ДНК стандарта. Сухой расческу и положить его на плоскую поверхность. Место каждого ДНК плагин на соответствующий зуб. Удалить чрезмерного буфер вокруг ДНК плагин стремлением так плагин будет прилипать к зубу.
- Налейте в агарозном геле, не вставляя гребень. Дайте ему остыть до 40-50 ° С (несколько минут), медленно вставьте расческу с прилагаемыми пробками в гель. Убедитесь, что пробки не соскальзывают расческой. Пусть гель затвердеть. Удалите гребенку из геля медленно.
- Импульсное поле гель-электрофореза
Выполнить геля в единицу CHEF DRII: 700 S-1500 с импульсами, 2,5 В / см, при температуре 12 ° С в течение 120 часов.
Шаг 3. Красителей и destain агарозном геле
Пятно гель с 1 мкг / мл бромистого этидия в 0,5 х КЭ при комнатной температуре в течение 1 часа, то в 0,5 х КЭ без бромистого этидия в течение 1 часа с нежным качалки. Возьмите картину гель.
Шаг 4. Сухой агарозном геле
Место агарозном гель на два слоя 3 мм бумага ватман и покрытие гелем полиэтиленовой пленкой. Сухой гель при комнатной температуре (гель не следует нагревать выше 50 ° С, чтобы избежать денатурации образцов ДНК). Заменить мокрую работ ватмана с сухим через 2 и 4 часа сушки, соответственно. Держите сушки, пока гель полностью не высохнет. Это может занять всю ночь в зависимости от сушилки.
Шаг 5. Этикетка олиго зондов
Смешайте 1 мкл 50 нг / мкл TELC или TELG олиго с 1 мкл 10 х полинуклеотидкиназы (ПНК) буфера, 5 мкл γ [32Р] АТР, 2 мкл DDH 2 O и 1 мкл Т4 ПНК. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Добавить 90 мкл TNES буфера (10 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, рН 8,0, 1% SDS) в реакционной смеси.
Хотя маркировка oligoes, подготовить G-25 колонке: поставить некоторые стекловаты в 3 мл шприц и прочее затянуть с кончика пипетки. Заполните шприц с Сефадекс G-25 штраф (autoclaved в ТЕ) по 3 мл отметки. Пусть это решить по весу. Для очистки меченым зондом: нагрузка зонда на верхней части колонны. Промыть 700 мкл буфера TNES и элюции с 600 мкл буфера TNES. Кроме того, очистить меченым зондом использованием мини быстрой спиновой ™ колонки (Roche Applied Science).
Шаг 6: Гибридизация
- Кратко мокрой высушенный гель в дистиллированной воде и смыть любого ватмане застрял на гелем
- Место гель в гибридизации сумку и добавить 20 мл hybridiztion буфера (0,25 М Na 2 HPO 4 pH7.2, 1 мМ ЭДТА, 7% SDS, 1% BSA, фильтруют через 0,22 мкм фильтр). Инкубировать на водяной бане при температуре 50 ° C с нежным качалки, по крайней мере 1 час.
- Удалите предварительно гибридизации буфера. Отварите меченым зондом в течение 5 мин и добавить его в 25 мл свежего буфера гибридизации, фильтры-стерилизовать смешать с 0,22 мкм фильтр шприца и добавить гибридизации смеси непосредственно к гибридизации сумку. Печать пакет и положите в неглубокую емкость с теплой водой. Место весь контейнер в водяной бане. Инкубировать при 50 ° С в течение ночи с нежным качалки.
- Вырезать маленькое отверстие в сумке гибридизации. Вылейте в максимально возможной гибридизации смеси и сохранить его в 50 мл коническую трубку. Держите зонд замораживали при -20 ° C. Удаление геля из гибридизации мешок и положил его в контейнер.
На данном этапе ВСЕ БУДЕТ ГОРЯЧЕЙ И ПОТРЕБНОСТЕЙ ШИРОКИЙ очистки (BENCH, экран, ножницы, ETC. УБЕДИТЕСЬ НОСИТЬ двойных слоев ПЕРЧАТКИ! - Вымойте геля в 4 х SSC в течение 30 мин при 50 ° C. Замените свежие промывочным буфером и повторите дважды.
- Вымойте геля в 4 х SSC/0.1% SDS при 50 ° C.
- Поместите гель на листке бумаги 3 мм ватмана и слегка сухого геля.
- Оберните гель с пластмассовой оберткой и подвергать phosphorimager для ~ 3 дня
- Сканирование phosphorimager
- Инкубировать гель в денатурирующих буфера (1,5 М NaCl, 0,5 М NaOH) при комнатной температуре в течение 30 минут
- Вымойте геля в нейтрализации буфера (3 М NaCl, 0,5 М Трис • / Cl рН 7,0) при комнатной температуре в течение 30 минут
- Промыть в дистиллированной воде в течение 3 мин
- Предварительно гибридизуются при 55 ° С в течение 1 часа
- Повторите гибридизации с использованием тех же зонд содержащих смесь гибридизации при 55 ° С в течение ночи.
- Вымойте, как описано выше, за исключением при 55 ° C.
- Оберните гель и подвергать phosphorimager для ~ 2 часа.
- Сканирование phosphorimager. Нормализация сигнала гибридизации, полученные до денатурации с полученным после денатурации.
2. Определите теломер Терминал нуклеотидных по Адаптер Лигирование 6
Принцип (рис. 2А и 2В): 5 'конце меченного олигонуклеотида уникальный лигируют к 3' концу G-навес. Это достигается путем отжига до конкретных дополнительных олиго руководства. Только уникальные / гид олиго адаптера подшипника последовательности совместимы с теломер G-навес последовательностями терминала будет лигировали. Для Т. brucei, теломеры может прекратить действие в одном из шести разных нуклеотидов TTAGGG повторяется. Следовательно, шесть различных oligoes руководство используются (TG1-TG6, рисунок 2А). После перевязки, ДНК переваривается с рестриктаз и решаться на агарозном геле.
- Киназы лечении уникального олиго.
Смешать 6 мкл 10 пмоль / мкл уникальный олиго с 3 мкл 10х буфера PNK, 5 мкл γ [32 P] ATP, 14 мкл DDH 2 O и 2 мкл (10 U) Т4 ПНК. Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение 1 часа. - Удалить неинкорпорированных горячей нуклеотида.
Используйте Qiaquick нуклеотидных комплект удаление, чтобы удалить неинкорпорированных горячей АТФ и элюировать конце меченных олиго с 60 мкл буфера элюции (конечная концентрация была бы ~ 1 пмоль / мкл). - Отжиг уникальный олиго для руководства олиго (для создания адаптера).
Добавьте 10 мкл очищенной уникальным олиго до 2 мкл каждого руководство олиго и 1 мкл отжига буфера (200 мМ NaCl, 100 мМ Трис-HCl, рН 8,0). Положите трубы в 85 ° C тепла блока и выключите огонь блока. Пусть трубы и тепловой блок здорово РТ. Это займет несколько часов. Если в спешке, подводящий патрубок через 5 минут каждый до 65 ° С, затем 37 ° С, а затем дайте ему остыть до комнатной температуры. - Лигировать адаптеры для общего геномной ДНК.
Для 2,5 мкл нетронутыми геномной ДНК, добавить 4 мкл 5 х лигазы буфера, 10 мкл отожженных олигонуклеотидов, 2,5 мкл DDH 2 O и 1 мкл T4 ДНК-лигазы. Инкубировать при 16 ° С в течение ночи. - Пищеварение эндонуклеаза рестрикции
К 20 мкл продукта лигирования добавить 3 мкл 10 х NEB буфер 4, 1,5 мкл AluI и MboI каждая, и 4 мкл DDH 2 O. Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение ночи. - Электрофореза.
Добавить 3 мкл 10 х Оранжевый G красителя (50% глицерина, 0,5% Оранжевый G) для каждого образца. Нагрузка на образцы ДНК 20X20 см на 0,7% агарозном геле в 0,5 х КЭ с 0,2 мкг / мл бромистого этидия. Выполнить при 30В в течение 30 мин, затем сontinue с более высоким напряжением, но менее 120 в общей сложности до 1000 г в час. Возьмите картину гель с правителем рядом с ДНК маркера. - Сухой гель и разоблачить.
Положите гель агарозы на слой DE81 фильтровальную бумагу и двумя слоями бумаги 3 мм ватман и покрытие гелем полиэтиленовой пленкой. Сухой гель при комнатной температуре. Expose высушенный гель для phosphorimager ночь.
3. Лигирование опосредованного удлинения праймера 6
Принцип (рис. 2А и 2С): уникальная олигонуклеотид лигируют с 3 'G-навес с определенной последовательности терминала, определяется его комплементарными последовательностями в адаптере (гид) олиго. После очистки меченых руководство олиго, что остается отожженного до G-overhang/unique олиго является грунтовка распространяется на сс-DS узел использованием Т4 ДНК-полимеразы, в котором отсутствуют перемещения нитей и 5'-3 'экзонуклеазная деятельности. Продуктов удлинения праймера поэтому дают длина G-навес.
- Киназы лечение руководства и уникальных oligoes
- Смешать 20 мкл 10 пмоль / мкл уникальный олиго по 10 мкл 10 х PNK буфера, 20 мкл 5 х лигазы буфера (содержащего 10 мМ АТФ), 3 мкл (30 U) Т4 ПНК, и 47 мкл DDH 2 O . Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение 60 минут.
- Смешайте 1 мкл 10 пмоль / мкл руководство олиго с 1 мкл 10 х PNK буфера, 2 мкл γ [32 P] ATP, 1 мкл (10 U) Т4 ПНК и 5 мкл DDH 2 O. Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение 60 минут.
- Отжиг руководство олиго и уникальные олиго
Добавьте 10 мкл (20 пмоль) из фосфорилированных уникальный олиго и 10 мкл (10 пмоль) конечного меченных руководство олиго в 1,5 мл трубки Эппендорф (соотношение 2:1 уникальных для руководства олиго гарантирует, что все руководство олиго отжигают ). Выполните ту же процедуру, описанную в протоколе II для отжига oligoes. - Лигировать отожженных гид / уникальный адаптер олиго к теломер концах
Выполните ту же процедуру, описанную в протоколе II для лигирования ДНК. - Осадок ДНК с 1 / 10 объема ацетата натрия и 2,5 объема ледяной этанола при -80 ° С в течение 30 мин. Спином вниз ДНК гранул в 12 krpm, 4 ° С в течение 15 мин. Вымойте ДНК с 70% этанола и растворяют поддон в 10 мкл DDH 2 O.
- Грунтовка расширение
Каждому 10 мкл образца ДНК добавляют 2 мкл 10 х T4 ДНК-полимеразы буфера, 1 мкл 1 мг / мл БСА, 1 мкл 25 мМ дАТФ, дЦТФ и dTTP каждый, 1 мкл (3 U) Т4 ДНК-полимеразы, и 3 мкл DDH 2 O.
Сделать мастер смешать с полимераза, буфер, и т.д., и аликвоту соответствующее количество мастер микс на каждый образец ДНК. Инкубировать при температуре 30 ° С в течение 30 мин. Затем добавить 1,2 мкл 0,5 М ЭДТА немедленно реакцию. - Электрофорез
Выполнить расширение продукции на 10% акриламида / 7 M urea/1xTBE геля. Нагрузка 4 мкл каждого образца. Отварите образцы в течение 10 минут перед загрузкой. Выполнить на 800V в 1x КЭ до синего красителя достигает нижней части геля. Сухой гель при температуре 65 ° С в течение 30 мин, затем при комнатной температуре в течение 30 мин и подвергать phosphorimager течение 2 часов.
Для подготовки 100 мл 10%-ном полиакриламидном гель, растворите 41 г мочевины и 21 мл 40% акриламида решение (акриламид / бис-акриламида 29:1) в 30 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл 10-кратным TBE. Соберите стеклянных пластин. Прямо перед заливкой геля, добавить 1 мл 10% APS и 100 мкл TEMED. Вылейте гель и стараются избегать пузырьков.
4. Представитель Результаты:
Обнаружение T. brucei теломер G-навес структуры с помощью родных в-гель гибридизации
Неповрежденная Т. brucei хромосом, разделенных PFGE показаны на рисунке 3A и 3B (левая панель). Т. brucei клетки обычно содержат ~ 100 экземпляров minichromosomes, все с аналогичного размера (50-150 кб) и перейти на ту же позицию на гель (MC). В связи с этим, после гибридизации с TELC олиго зонд, теломер G-навес сигнал наиболее заметно на minichromosomes (рис. 3А, средняя панель). Гибридизация с TELG олиго зонда обычно не привело ни к каким гибридизации сигнала (рис. 3Б, средняя панель), потому что Т. brucei клетки не имеют теломеры C-навес структуры. После денатурации и нейтрализации, либо гибридизации с TELC или TELG олиго зонд должен раскрыть теломер сигналов на всех концах хромосом (рис. 3А и 3Б, правой панели).
Определите теломер терминал нуклеотидных через адаптер перевязки
Загрузка равное количество ДНК в каждой полосы имеет важное значение для этого анализа, и это свидетельствует бромистый этидий окрашивания геля. Пример показан на рисунке 4A, левой панели.
В этом протоколе конце меченных уникальный олиго и руководство олиго адаптеры только лигировали концу хромосомы, когда теломеры G-свесы заканчивая последовательностей, которые совместимы с руководством олиго. Си NCE уникальный олиго является конечным помечены, перевязка продукт будет радиоактивных и дать сильный сигнал. Как показано на рисунке 4A, правая панель, переулок 1 дает сильный сигнал, указывая, что большое количество unique/TG1 адаптер был лигировали теломер конца. TG1 имеет окончание последовательности 5'CCCTAA3. Следовательно теломер G-свесы лигировали этот адаптер в конце 5'TTAGGG3. Нет значительное количество продуктов лигирования наблюдается с помощью других oligoes руководство, указывая, что теломеры, оканчивающиеся на TTAGGG преобладают в Т. brucei клеток.
Лечение геномной ДНК с Exo я или Exo T, которые 3 'навеса конкретных нуклеаз, привело к потере лигирование продуктов (рис. 4а, правой панели, дорожки 2 & 3), указывая, что перевязка действительно результате теломер G- свес структуры
Лигирование опосредованного удлинения праймера
Без труб, в конце меченных руководство олиго составляет 22 нт долго. Загрузка конце меченных руководство олиго будет служить в качестве отрицательного контроля и размер маркера. (Рис. 4В, переулок 11, звездочка указывает на конец меченных руководство олиго). Обычно мы также наблюдаем полосе ~ 44 NT в этом отрицательного контроля (рис. 4В, переулок 11, открытый треугольник), которые, скорее всего, остаток неденатурированный адаптеров. После перевязки к концу хромосомы, размер расширенной продукт отражает длину G-навес структуры. Большинство Т. brucei теломер G-свесы закончится 5'TTAGGG3 '(рис. 4А). Однако, эти G-свесы, кажется, очень короткий (всего ~ 10 NT в длину), как продукты продлен с лигируют TG1 руководство олиго не намного дольше, чем само руководство олиго (рис. 4В, переулок 10), но они позволяют перевязки TG1 адаптера (рис. 4а, правая панель, переулок 1). Хотя только небольшое количество TG4 адаптер лигировали с теломер концы (рис. 4а, правая панель, переулок 6), продукции увеличен с лигируют TG4 намного длиннее (рис. 4В, переулок 7, наконечники стрел), с длинным продукта ~ 55 NT. Таким образом, мы наблюдали два типа теломер G-навес в T. brucei клеток. Преобладающей теломер G-свесы закончится 5'TTAGGG3 ", но только ~ 10 NT долго. Мало теломер G-свесы закончится 5'GGGTTA3 ", но может быть до 40 нт долго. Оба типа G-навес чувствительны к Exo T (или Exo I), лечение (рис. 4а, правая панель, 2 переулок, 3, 7, рисунок 4B, переулок 1, стрелки).
Рисунок 1. Принцип родным в-гель гибридизации. Влево, под родной состоянии, в конце меченных TELC олиго зонд может скрещиваться с одноцепочечной G-богатой теломер свес. Интенсивность гибридизации отражает длину теломер G-навес. Право, после денатурации, TELC олиго зонд скрещиваться со всеми ДНК теломер. Интенсивность этого гибридизация представляет собой общее количество теломер ДНК и используется в качестве управления загрузкой, а окончательный G-навес уровня рассчитывается путем деления родной сигнал гибридизации тем, что полученные после денатурации.
Рисунок 2. Принцип перевязки Адаптер и перевязки опосредованной удлинения праймера. (А) Последовательности уникальным и шесть oligoes руководства. (Б) Определить теломер терминал нуклеотидных через адаптер труб. Уникальный олиго является конечным (маркированы красной звездочкой), отожженных в руководстве oligoes и лигировали теломер конца. Только тогда, когда уникальный / гид адаптер медведи навеса 3 ', которая совместима с последовательностью терминал теломер будет адаптера быть перевязаны. (C) В перевязки опосредованной удлинения праймера, руководство олиго является конечным (маркированы красной звездочкой) и отожженного до уникальных олиго до лигировали хромосоме заканчивается. Только уникальные / гид адаптера подшипника навеса 3 'совместима с G-навеса будут перевязаны. ^ Обозначает лигируют связь phophordiester. После удаления unligated пар олиго, удлинения праймера будет осуществляться с T4 ДНК-полимеразы, в котором отсутствуют перемещения нитей и 5'-3 'экзонуклеазная деятельности. Окончательная длина расширенной руководство олиго поэтому отражает длину G-навес.
Рисунок 3. Т. brucei теломер G-навес структуры проанализированы в родном-гель гибридизации. () В-гель гибридизации с TELC олиго зонда. (Б) В-гель гибридизации с TELG олиго зонда. В обоих случаях (А) и (Б) влево, Ethedium метила окрашенный PFG. Средние родной результате гибридизации. Право, после денатурации гибридизации результат. Дикого типа T. brucei клетки были использованы. Нетронутыми или Exo я относился к геномной ДНК были разделены PFGE. Открытый треугольник означает megabase хромосом; IC, промежуточных размеров хромосом; MC, minichromosomes.
"/>
Рисунок 4. Т. brucei теломер G-навес структуры проанализированы лигирования-опосредованной удлинения праймера. () Больше всего Т. brucei теломер G-свесы прекращается в 5'TTAGGG3. Влево, Ethedium бромид окрашенных геля ДНК. Примерно равное количество ДНК, загружаемой в каждый переулок. Право, экспозиция результат того же геля после высыхания. Неповрежденными, Exo я обращению, или Т-Exo лечение ДНК лигировали до шести различных конечных помечены уникальный / гид олиго адаптеров, как указано. (Б) Т. brucei имеют короткие теломеры G-свесы. Нетронутыми или Exo Т обработанных геномной ДНК лигировали с шестью различными уникальными / гид олиго адаптеры следуют удлинения праймера использованием Т4 ДНК-полимеразы. Конец меченных TG4 олиго был загружен в качестве отрицательного контроля (дорожка 11). Олиго сам работает на частоте 22 П (*), но и дала слабый сигнал на ~ 44 NT (Δ). Только unique/TG4 адаптер дали расширение продукции значительно дольше, чем руководство олиго себя (наконечники стрел, переулок 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trypanosoma brucei причины сонной болезни у людей. Это заболевание, если его не лечить, неизбежно фатальным. Т. brucei клеток млекопитающих хостов пройти антигенные изменения регулярно, так как уклониться от иммунной атаки хозяина 7. Следовательно, очень трудно устранить Т. brucei клетки когда-то инфекции устанавливается. Недавно мы показали, что теломеры играют важную роль в регуляции экспрессии Т. brucei поверхностного антигена гена 8. Поэтому, очень важно для дальнейшего понимания функций теломер и механизмы для поддержания теломер в T. brucei клеток.
Теломер G-навес структура будет необходима для теломеразы опосредованной теломер техническое обслуживание 5. Методы измерения длины теломер навеса являются ценными для изучения механизмов теломер обслуживания. Мы успешно принята в родной-гель 3 гибридизации и лигирования-опосредованной удлинения праймера 6 метод анализа Т. brucei теломер G-навес структуры и метод перевязки адаптер для определения теломеров терминал нуклеотида. Оба в родном-гель гибридизации и метода адаптера перевязки можно выявить общую сумму навеса G в клетке, но только перевязка опосредованной удлинения праймера можно выявить точную длину свеса G.
Для родных в геле гибридизации, важно не для денатурации образцов ДНК по всему предварительные шаги. Это можно контролировать путем гибридизации ДНК с олиго TELG зонда. Поскольку не существует теломер C-навес, родной гибридизации TELG не должны давать какой-либо сигнал, если образцы частично денатурированным. Выборка должна быть также использованы в течение двух недель, как теломеры G-свес очень чувствителен к любой деятельности нуклеазы.
Для перевязки адаптер и удлинения праймера, очищенная oligoes выход четкие результаты. Exo Т является более эффективным, чем я Exo для расщепления конкретных одноцепочечной навеса 3 'ДНК. Равные загрузки отожженных образцов имеют важное значение для количественной оценки общей суммы теломер G-навес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить доктора Каролин Цена для научных дискуссий и проницательный предложения. Эта работа проводится при поддержке гранта NIH AI066095 (PI: Бибо Li).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SeaKem LE Agarose | Lonza Inc. | 50004 | |
| Agarose Type VII (low melting agarose) | Sigma-Aldrich | A4018 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche Group | 03 115801001 | |
| Exo I | New England Biolabs | M0293 | |
| Exo T | New England Biolabs | M0265 | |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
| QIAquick nucleotide removal kit | Qiagen | 28304 |
References
- Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20, 579-588 (2001).
- Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2. Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).
- Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell. 72, 51-60 (1993).
- McElligott, R., Wellinger, R. J. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes. EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).
- Harrington, L. A., Greider, C. W. Telomerase primer specificity and chromosome healing. Nature. 353, 451-454 (1991).
- Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres. Embo J. 20, 4299-4308 (2001).
- Barry, J. D., McCulloch, R. Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite. Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).
- Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137, 99-109 (2009).
