Summary
Telomerler kromozom istikrar için çok önemlidir ve telomer G-çıkıntı yapısı, telomeraz aracılı telomer bakımı için önemlidir. Biz son zamanlarda telomer G-çıkıntı yapı tespit etmek için iki yöntem kabul
Abstract
Maya, omurgalıların ve Trypanosoma brucei dahil olmak üzere pek çok ökaryotlarda telomer G-çıkıntı yapı tespit edilmiştir. Telomeraz için de novo telomer DNA sentezi için substrat olarak görür ve bu nedenle telomer bakımı için önemlidir. T. brucei sığır ve nagana insanlarda uyku hastalığa neden olan bir protozoa bir parazittir . Hastalığa yakalandıktan sonra konak memeli, T. brucei hücre yüzey antijeni konağın bağışıklık saldırı kaçınmak için düzenli geçer. Yakın zamanda göstermiştir ki T. brucei telomer yapısı T. için kritik yüzey antijeni gen ekspresyonu, düzenlenmesinde önemli bir rol oynar brucei patogenezinde. Ancak, T. brucei telomer yapısı bu özel yapının analizi için yöntemler sınırlaması nedeniyle yoğun çalışma yapılmamıştır. Şimdi başarıyla hibridizasyon ve telomer G-çıkıntı yapısının incelenmesi ve T. telomer terminal nükleotid belirlenmesi için bir adaptör ligasyonu yöntemi ligasyonu aracılı astar uzatma yöntemleri jel doğal kabul brucei hücreleri. Burada ayrıntılı olarak protokolleri anlatmak ve onların farklı avantajları ve sınırlamaları karşılaştırın.
Protocol
1. Algılama T. brucei Telomer Native kullanarak G-çıkıntı-jel Hibridizasyon 3
Prensibi (Şekil 1): yerli koşul altında, bir uç-etiketlenmiş (CCCTAA) 4 (TELC) oligo prob sadece tek iplikçikli telomer G-çıkıntı bölge melezleşme yapabilirsiniz. Hibridizasyon yoğunluğu çıkıntı uzunluğu ile doğru orantılıdır. Denatürasyon ve nötralizasyon sonra, aynı prob tüm telomer bölgesi melezleşme mümkün olacak. Hibridizasyon yoğunluğu toplam telomer DNA miktarını temsil eder ve yükleme kontrolü olarak kullanılabilir. Bu deney için iki standart kontroller T. olarak herhangi bir sinyal vermeyecektir son etiketli (TTAGGG) 4 (TELG) oligo probu, kullanılan hibridizasyon brucei hücre yerli TELC hibridizasyon sinyali ortadan kaldırılması gereken, telomer C-çıkıntı yapısı yok, önce hibridizasyon Exo I veya Exo T gibi 3'-özel tek telli exonucleases genomik DNA tedavisinde.
1. Adım. Pulsed Field Jel Elektroforezi (PFGE) DNA fişler hazırlayın
Sağlam kromozomlar PFGE ayrılacaktır. Bu nedenle, genomik DNA DNA fişler gibi hazırlanır.
- 100 mL (1.5 -2 milyon hücre / ml) kan dolaşımına formu hücreleri veya procyclic hücreleri (10 milyon hücre / ml) 20 ml ile başlayın.
- Düşük erime noktası (LMP) agaroz L tamponu (0.01 M Tris • CL pH 7.6, 0.02 M NaCl, 0,1 M EDTA pH 8.0) ve 50 sıcak tutmak ° C.% 1.6 çözülür
- 1.5 krpm de santrifüj yoluyla hasat hücreleri, 4 ° C 10 dakika. 5 milyon hücre / mL nihai konsantrasyonu L tamponu ile tekrar süspansiyon supernatant ve hücre pelletini çıkarın.
- Hücre süspansiyonu 42-50 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- LMP agaroz 1 hacim 1 hacim hücre ekleyin. Iyi ama hızlı bir şekilde karıştırın.
- Kısım 85 hücre süspansiyonu her bir kuyu için tek bir fiş kalıp (BioRad) mcL.
- 5-10 dakika sonra kadar veya fişlerin transfer fişleri 15 ml konik bir tüp 5 ml L tampon /% 1 Sarkosyl ile, katılaşmış. , 250 mg / ml proteinaz K veya bir tutam toz proteinaz K 100 mcL ekleyin, iyice karıştırın ve 50 ° C'de 48 saat için.
- Tampon atın, iki kez 5 ml L tampon fişler yıkama ve 48 saat için proteinaz K sindirimi tekrarlayın. Fişler taze L tamponu ile tekrar yıkayın. 4 Mağaza fişler ° C L tampon. Bu fişler, 2 hafta içinde kullanılmalıdır.
2. Adım. Ayrı sağlam T. Pulsed Field Jel Elektroforez kullanarak brucei kromozom
- Agaroz jel hazırlayın
- 0,5 x TBE tampon ve CHEF DRII (BioRad) ünitesi jel çalışan odasına 2-3 L hazırlayın. Çalışan sıcaklığı ayarlama, pompa start sonra soğutma ünitesi başlatın.
- 0,5 x TBE tamponu 100 ml% 1.2 agaroz jel hazırlayın. Soğuk agaroz jel tepsisi kurarken.
- Numune sipariş karar verin. DNA standardı eklemeyi unutmayın. Tarak Kuru ve düz bir yüzey üzerinde yatıyordu. Her DNA fişini uygun diş üzerine yerleştirin. Fişi diş sopa böylece aspirasyon DNA fiş çevresinde aşırı tamponu çıkarın.
- Tarak takılmadan agaroz jel dökün. 40-50 ° C (bir kaç dakika) soğuması, yavaş yavaş, jel içine takılı fişleri ile tarak yerleştirin. Fişleri tarak kapalı slayt olmadığını emin olun. Katılaşmaya jel edelim. Yavaş yavaş jel tarak çıkarın.
- Pulsed Field Jel Elektroforezi
120 saat için 12 700 s-1500 bakliyat, 2.5 V / cm ° C: CHEF DRII ünitesi jel çalıştırın.
Adım 3. Agaroz jel Leke ve destain
Ethidium Bromür için nazik sallanan ile 1 saat sonra 0,5 x TBE olmadan 1 saat süreyle oda sıcaklığında 0,5 x TBE 1μg / mL Ethidium Bromür jel Leke. Jel bir fotoğraf çekin.
Adım 4. Agaroz jel Kuru
3 mm whatman kağıt iki kat agaroz jel yerleştirin ve plastik wrap ile jel kapsayacak. Kuru jel RT (jel ısıtılmış olmamalıdır 50 daha fazla ° C DNA örnekleri herhangi bir denatürasyon önlemek için). Sırasıyla, 2 ve 4 saat sonra kurutma ıslak whatman kağıtları kuru olanlarla değiştirin. Jel tamamen kuruyana kadar kuruma tutun. Bu kurutma makinası göre gece sürebilir.
Adım 5. Oligo probları Etiket
10 x Polinükleotid kinaz (PNK) tampon, 5 mcL 1 mcL ile 50 ng / mcL TELC veya TELG oligo 1 mcL karıştırın γ [32P] ATP GKD 2 O 2 mcL ve T4 PNK 1 mcL. 37 ° C'de 1 saat inkübe. TNES tamponu (10 mM Tris Cl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8.0,% 1 SDS) 90 mcL reaksiyon karışımı ekleyin.
Oligoes etiketleme, G-25 sütun hazırlamak: 3 cc şırınga içine bazı cam yünü koyun ve bir pipet ile sıkı bir şekilde aşağı şeyler. Sephadex ince G-25 (autocl şırınga doldurun3 ml işareti) TE aved. Kilo dinlendiriniz. Etiketli prob arındırmak için: prob sütun üstüne yerleştirin. TNES tampon 700 mcL ile yıkayın ve TNES tampon 600 mcL ile Zehir. Alternatif olarak, bir mini Hızlı Spin kullanarak etiketli prob arındırmak ™ sütun (Roche Uygulamalı Bilimler).
Adım 6: Hibridizasyon
- Kısaca distile su ile kurutulmuş jel, ıslak ve jel takılıp whatman kağıt yıkayacak
- Hibridizasyon bir torba içinde jel yerleştirin ve 20 ml hybridiztion tampon eklemek (0.25m Na 2 HPO 4 pH7.2, 1 mM EDTA,% 7 SDS,% 1 BSA, filtre 0,22 mikron süzgecinden). 50 ° C nazik sallanan en az 1 saat süreyle su banyosunda inkübe edin.
- Ön hibridizasyon tamponu çıkarın. Etiketli prob 5 dakika boyunca kaynatın ve 25 ml taze hibridizasyon tampon eklemek 0.22 mikron şırınga filtresi ile karışımı filtre sterilize ve hibridizasyon torba doğrudan hibridizasyon karıştırılır. Çanta ve sığ bir kapta sıcak su ile yer Seal. Su banyosu içine bütün kap yerleştirin. Nazik sallanan ile 50 ° C gece inkübe edin.
- Hibridizasyon çanta içinde küçük bir açılış kesin. Kadar mümkün olduğunca hibridizasyon karışımı dökün ve 50 ml Konik tüp kaydedin. -20 ° C'de dondurulmuş prob tutun Hibridizasyon çanta jel çıkarın ve bir kap içine koyun.
BU ADIM AT HER ŞEY SICAK VE GENİŞ TEMİZLİK (BENCH, EKRAN, MAKAS, VB. ELDİVEN VE ÇİFT TABAKA GİYİM EMİN OLUN! İHTİYAÇ OLACAK! - 50 - 30 dakika için 4 x SSC jel yıkayın ° C Taze yıkama tamponu ile değiştirin ve iki kez tekrarlayın.
- 4 x SSC/0.1% SDS jel yıkayın 50 ° C.
- 3 mm whatman kağıt parçasının üzerine koyun ve jel jel hafifçe kurulayın.
- Plastik wrap ile jel sarın ve maruz phosphorimager ~ 3 gün
- Tarama phosphorimager
- Jel RT denatüre tamponu (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) 30 dakika inkübe
- Nötralizasyon tampon jel Wash (3 M NaCl, 0.5 M Tris • / Cl, pH 7.0) 30 dakika süreyle oda sıcaklığında
- 3 dakika distile su ile durulayın
- 1 saat için 55 ° C'de ön-melezleşme
- Hibridizasyon aynı prob hibridizasyon karışımı içeren 55 ° C gecede kullanarak tekrarlayın.
- 55 dışında yukarıda açıklandığı gibi yıkayın ° C
- Jel sarın ve yaklaşık 2 saat phosphorimager maruz.
- Phosphorimager tarayın. Denatürasyon önce denatürasyon sonra elde edilen elde edilen hibridizasyon sinyali Normale.
2. Telomer Terminal Adaptör ligasyon 6 Nükleotid belirleyin
Prensibi (Şekil 2A ve 2B): 5, G-çıkıntı sonu 'uç-etiketlenmiş benzersiz oligonükleotid 3 bağlandı'. Bu özel tamamlayıcı kılavuzu oligo tavlama yapılır. Sadece telomer G-çıkıntı terminal dizileri uyumlu benzersiz / kılavuzu oligo adaptörü taşıyan dizileri bağlandı olacaktır. T. için brucei, telomer TTAGGG tekrarlar altı farklı nükleotidlerin biri feshedebilir. Bu nedenle altı farklı kılavuzu oligoes (TG1-TG6, Şekil 2A) kullanılır. Bağlanmasından sonra, DNA kısıtlama endonükleazları sindirilir ve bir agaroz jel üzerinde çözümlenen.
- Kinaz tedavi benzersiz oligo.
10x PNK Tampon 3 mcL ile 10 pmole / mcL benzersiz oligo 6 mcL karıştırın, 5 mcL γ [32 P] ATP, 14 mcL GKD 2 O, ve T4 PNK 2 mcL (10 U). Karışım 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin. - Tüzel kişiliği olmayan sıcak nükleotid çıkarın.
Tüzel kişiliği olmayan sıcak ATP kaldırmak ve Elüsyon Buffer 60 mcL (son konsantrasyon mcL ~ 1 pmole / olurdu) uç-etiketlenmiş oligo Zehir Qiaquick nükleotid kaldırma kiti kullanın. - Tavlama kılavuzu oligo özgü oligo (adaptör oluşturmak için).
Her kılavuzu oligo ve 1 mcL tavlama tampon (200 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH: 8.0) 2 mcL benzersiz oligo saflaştırılmış 10 mcL ekleyin. Tüpler 85 ° C ısıtma bloğu içine koyun ve ısıtma bloğu kapatın. RT serin tüpler ve ısı bloğu olsun. Bu birkaç saat sürebilir. Eğer acele transfer tüp içinde 65 her biri 5 dakika sonra ° C, daha sonra 37 ° C ve daha sonra RT soğumasını bekleyin. - Arter adaptörleri genomik DNA toplam.
2.5 mcL sağlam genomik DNA için 4, 5 x ligaz tamponu, tavlı oligos 10 mcL, 2.5 mcL GKD 2 O, ve T4 DNA ligaz 1 mcL mcL ekleyin. 16 ° C'de bir gece inkübe edin. - Kısıtlama Endonuclease Sindirim
Ligasyonu ürün için 20 mcL 3 mcL 10 x NEB tampon 4, 1.5 ALUI ve MboI her mcL, ve GKD 2 O. 4 mcL ekleyin ° C gecede 37 karışımı inkübe edin. - Elektroforez.
Her bir numune için 10 x Turuncu G boya (% 50 gliserol,% 0,5 'Turuncu G) 3 mcL ekleyin. 20X20 cm boyutlarında% 0.7 agaroz jel üzerinde DNA örnekleri, 0.2 mikrogram / mL Ethidium bromür ile 0,5 x TBE yükleyin. Sonra, 30 dakika için 30V Run at cyüksek voltaj 1000 v saat olmak üzere toplam 120V daha az ontinue. DNA marker yanındaki bir cetvel ile jel bir fotoğraf çekin. - Kuru jel ve maruz kalmaktadır.
Agaroz jel DE81 filtre kağıdı ve 3 mm whatman kağıt iki katman katman üzerine koyun ve plastik wrap ile jel kapsayacak. RT Kuru jel. Açığa gecede phosphorimager kurutulmuş jel.
3. Ligasyonu aracılığı ile Primer Uzantısı 6
Prensibi (Şekil 2A ve 2C): benzersiz bir oligonükleotid adaptörü (rehber) oligo tamamlayıcı dizileri tarafından belirlenen 3 'G-çıkıntı belirli bir terminal sırası ile bağlandı. Saflaştırma sonrasında, G-overhang/unique oligo tavlı kalır etiketli kılavuzu oligo iplikçik deplasman ve 5'-3 'eksonükleaz faaliyetleri yoksun T4 DNA polimeraz kullanılarak ss-ds kavşak astardır. Astar uzantısı ürünleri, bu nedenle G-çıkıntı uzunluğu verir.
- Kılavuz ve benzersiz oligoes Kinaz tedavisi
- Karıştırın, 10 x PNK tampon, 20 mcL 5 x ligaz tamponu (10 mM ATP içerir), T4 PNK 3 mcL (30 U) ve 47 mcL GKD 2 O 10 mcL 10 pmole / mcL benzersiz oligo 20 mcL . Karışım 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
- 10 x PNK tampon, 2 mcL 1 mcL ile 10 pmole / mcL kılavuzu oligo 1 mcL karıştırın γ [32 P] ATP, 1 mcL T4 PNK (10 U) ve GKD 2 O 5 mcL Karışım 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
- Tavlama kılavuzu oligo ve benzersiz oligo
10 mcL, 1.5 ml Eppendorf tüp sonuna etiketli kılavuzu oligo (oligo rehberlik edecek benzersiz 2:1 oranında tüm kılavuzu oligo tavlı kalmasını sağlar fosforile benzersiz oligo ve 10 mcL (10 pmole) (20 pmole) .) Oligoes tavlama için protokol II açıklanan aynı işlemi uygulayın. - Telomer uçlarında tavlanmış kılavuz / benzersiz oligo adaptörü Arter
DNA ligasyon için protokol II açıklanan aynı işlemi uygulayın. - Çökelme DNA ve Sodyum Asetat hacmi ile 1 / 10 -80 az buz Etanol hacmi 2.5 ° C de 30 dakika. 12 krpm, 4 ° C de 15 dakika için DNA pelet aşağı spin. Etanol,% 70 ile DNA yıkayın ve GKD 2 O. 10 mcL palet çözülür
- Primer uzatma
Her 10 mcL DNA örneği için 2 mcL 10 x T4 DNA Polimeraz tampon, 1, 1 mg / ml BSA mcL, 25 mM dATP, dCTP 1 mcL, ve dTTP her T4 DNA Polimeraz 1 mcL (3 U) eklemek, GKD 2 O 3 mcL
Polimeraz, tampon, vb kısım uygun miktarda ana karışımı her DNA örneği ile bir master karışımı olun. 30 ° C'de 30 dakika inkübe. Sonra hemen reaksiyon 0,5 M EDTA 1.2 mcL ekleyin. - Elektroforez
% 10'luk akrilamid / 7 M urea/1xTBE jel uzatma ürünleri çalıştırın. Her numune 4 mcL yükleyin. Örnekleri yüklemeden önce 10 dakika boyunca kaynatın. Mavi boya jel alt ulaşıncaya kadar 1x TBE 800V az çalıştırın. Kuru jel 65 ° C, 30 dakika RT sonra 30 dakika ve 2 saat için phosphorimager maruz.
% 10 poliakrilamid Jeli 100 ml hazırlamak için, 10 ml 10x TBE eklemek Üre% 40 Akrilamid solüsyonu (akrilamid / bis-akrilamid 29:1) 41 g ve 21 ml, 30 ml distile su içinde çözülür. Cam plakalar birleştirin. Jel dökülmeden önce sağ,% 10 APS 1 ml ve 100 mcL TEMED ekleyin. Jel dökün ve varsa kabarcıkları önlemek için deneyin.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Algılama T. -jel hibridizasyon yerli kullanarak brucei telomer G-çıkıntı yapı
Bozulmamış T. PFGE ayrılmış brucei kromozom Şekil 3A ve 3B (sol paneller) T. gösterilmiştir. brucei hücreleri normalde tüm minichromosomes ~ 100 kopya, benzer boyutu ile (50-150 kb) içerir ve jel üzerinde aynı pozisyonda (MC) göç. Buna bağlı olarak, TELC oligo probu, telomer G-çıkıntı sinyal minichromosomes (Şekil 3A, orta panel) en önde gelen hibridizasyon sonra. TELG oligo prob ile hibridizasyon, normalde herhangi bir hibridizasyon sinyali vermezse (Şekil 3B, orta paneli), çünkü T. brucei hücreleri telomer C-çıkıntı yapısı yoktur. TELC veya TELG oligo prob ile denatürasyon ve nötralizasyon, melezleşme (Şekil 3A, 3B, sağ paneller) tüm kromozom uçlarında telomer sinyalleri ortaya sonra.
Telomer terminal adaptör ligasyonu ile nükleotid belirleyin
Her kulvardaki eşit miktarda DNA yükleme testi için önemlidir ve bu jel Ethidium Bromür boyama ile gösterilir. Şekil 4A, sol paneldeki bir örnek gösterilmiştir.
Bu protokolde, sonuna etiketli benzersiz oligo ve kılavuz oligo adaptörleri sadece kromozom sonuna kadar bağlandı kılavuzu oligo uyumlu dizileri ile biten telomer G-çıkıntılar. Si benzersiz oligo sonu etiketli nce, ligasyonu ürün radyoaktif ve güçlü bir sinyal vermek. Şekil 4A, sağ panelde görüldüğü gibi, şerit 1 telomer sonuna kadar büyük bir miktarda unique/TG1 adaptörü bağlandı edildiğine dair güçlü bir sinyal veriyor. TG1 '5'CCCTAA3, bir bitiş sırası vardır. Bu nedenle telomer G-çıkıntılar 5'TTAGGG3 'Bu adaptör sonuna kadar bağlandı. Ligasyonu ürünlerin önemli miktarda yok TTAGGG biten telomer T. baskın olduğunu belirterek, diğer rehber oligoes kullanarak görülmektedir brucei hücreleri.
3 'çıkıntı özel nükleazlar Exo veya Exo T ile genomik DNA Tedavisi ligasyonu gerçekten telomer kaynaklandığı belirten ligasyon ürün kaybı (Şekil 4A, sağ panel, 2 ve 3 şeritli) sonuçlandı G- çıkıntı yapı
Ligasyonu aracılığı ile Primer Uzantısı
Ligasyonu olmadan, sonuna etiketli kılavuzu oligo 22 nt uzunluğunda. Yükleniyor sonuna etiketli kılavuzu oligo bir negatif kontrol ve bir boyut işaretleyici olarak hizmet edecektir. (Şekil 4B, 11 şeritli, yıldız sonunda etiketli gösterir kılavuzu oligo). Biz normalde, aynı zamanda, büyük olasılıkla kalıntı olmayan denatüre adaptörleri bu negatif kontrol (Şekil 4B, şerit 11, açık üçgen), ~ 44 nt bir grup gözlemliyoruz. Kromozom sonuna kadar ligasyonu sonra, genişletilmiş ürün boyutu G-çıkıntı yapısı uzunluğunu yansıtır. En T. 5'TTAGGG3 brucei telomer G-çıkıntılar sonunda '(Şekil 4A). Ancak, bu G-çıkıntılar ürünleri kılavuzu oligo kendisi (Şekil 4B, şerit 10) daha çok uzun değildir bağlanan TG1 kılavuzu oligo genişletilmiş olarak, çok kısa olması (sadece ~ 10 nt uzunluğunda) görünür, ancak ligasyonu izin TG1 adaptörü (Şekil 4A, sağ panel, şerit 1). TG4 adaptörü sadece küçük bir miktar telomer uçlarında (Şekil 4A, sağ panel, şerit 6) bağlandı olmasına rağmen, bağlanan TG4 kapsamlı ürün, uzun ürün olan (Şekil 4B, şerit 7, ok başları) çok daha uzun ~~ 55 nt. Dolayısıyla, T. telomer iki tür G-çıkıntı gözlenen brucei hücreleri. Ama 5'TTAGGG3 'baskın telomer G-çıkıntılar sonunda uzun süre sadece ~ 10 nt. 5'GGGTTA3 birkaç telomer G-çıkıntılar sonuna 'ama' ye kadar 40 nt uzun olabilir. G-çıkıntı Her iki tip de Exo T (ya da Exo) tedavi (Şekil 4B, şerit 1, oklar Şekil 4A, sağ panel, 2, 3 ve 7 şeritli) duyarlıdır.
Şekil 1. Yerli-jel hibridizasyon Prensibi Sol, ana koşul altında, son etiketli TELC oligo prob sadece tek telli G-zengin telomer çıkıntı ile melezleşme. Hibridizasyon yoğunluğu, telomer G-çıkıntı uzunluğu yansıtır. Sağ, denatürasyon sonra, TELC oligo prob tüm telomer DNA ile melezleşme olacaktır. Telomer DNA toplam tutarı temsil eder ve bu melezleşme yoğunluğu yükleme kontrol olarak kullanılan ve son G-çıkıntı düzeyinde denatürasyon sonra elde edilen doğal bir hibridizasyon sinyali bölünmesi ile hesaplanır.
Şekil 2. Benzersiz ve altı kılavuz oligoes Adaptör ligasyonu ve ligasyonu aracılı astar uzantısı Prensibi (A) Diziler. (B) telomer terminal adaptör ligasyonu ile nükleotid belirleyin. Eşsiz oligo uç-etiketlenmiş (kırmızı yıldız ile işaretli), kılavuz oligoes tavlanmış ve telomer sonuna kadar bağlandı. Sadece benzersiz / kılavuzu adaptörü adaptörü bağlandı olacak terminal telomer dizisi ile uyumlu bir 3 'çıkıntı taşır. (C) ligasyonu aracılı astar uzantısı olarak, kılavuzu oligo uç-etiketlenmiş (kırmızı yıldız işareti ile işaretlenmiş) ve kromozom ucuna bağlandı önce benzersiz oligo tavlanır. Sadece 3 'G-çıkıntı ile uyumlu bir çıkıntı taşıyan benzersiz / kılavuzu adaptörü bağlandı olacaktır. ^ Bağlanan phophordiester bağı gösterir. Unligated oligo çiftleri çıkarıldıktan sonra, astar uzantısı iplikçik deplasman ve 5'-3 'eksonükleaz faaliyetleri yoksun T4 DNA polimeraz ile yürütülen olacaktır. Genişletilmiş kılavuzu oligo son uzunluğu, bu nedenle G-çıkıntı uzunluğu yansıtır.
Şekil 3 T. brucei telomer G-çıkıntı yapısı incelendiğinde yerlisi tarafından jel melezleşme. TELC oligo prob ile (A) jel hibridizasyon. (B)-jel TELG oligo prob ile hibridizasyon. Hem de (A) ve (B) Sol, Ethedium Bromür boyanmış PFG. Orta, yerli melezleme sonucu. Sağ, post-denatürasyon melezleme sonucu. Wild-tip T. brucei hücreleri kullanıldı. Genomik DNA tedavi bozulmamış ya da Exo PFGE ayrıldı. Açık üçgen megabase kromozomlar için duruyor; IC, orta ölçekli kromozom, MC, minichromosomes.
"/>
Şekil 4 T. brucei telomer G-çıkıntı yapısı ligasyonu aracılı astar uzantısı tarafından analiz (A) En T. brucei telomer G-çıkıntılar 5'TTAGGG3 yılında sonlanırken. Sol, Ethedium bromür boyanan DNA jel. DNA yaklaşık eşit miktarda her kulvarda yüklenir. Sağ, kuruduktan sonra aynı jel maruz kalma sonucu. Bozulmamış, Exo-tedavi ya da belirtildiği gibi Exo T-tedavi edilen DNA altı farklı sonu etiketli eşsiz bir rehber / oligo adaptörleri bağlandı. (B) T. brucei telomer kısa G-çıkıntılar var. Bozulmamış veya Exo T-tedavi edilen genomik DNA T4 DNA polimeraz kullanılarak astar uzantısı tarafından altı farklı eşsiz bir rehber / oligo adaptörleri bağlandı oldu. Sona etiketli TG4 oligo (şeritli 11) negatif kontrol olarak yüklenmiştir. 22 oligo kendisi nt (*) çalışıyor fakat aynı zamanda ~ 44 nt (Δ) bir sönük sinyali verdi. Sadece unique/TG4 adaptörü kılavuzu oligo kendisi (ok uçları, şerit 7) göre önemli ölçüde daha uzun uzatma ürünleri vermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trypanosoma brucei insanlarda hastalık uyku neden olur. Bu hastalık, tedavi edilmediği takdirde, kaçınılmaz olarak ölümcül T. memeli ev sahipliği brucei hücrelerin düzenli konağın bağışıklık saldırı 7 kaçınmak için antijenik değişim yaşanmadığını. Bu nedenle T. ortadan kaldırmak için çok zordur. brucei bir enfeksiyon kez hücreleri kurulmuştur. Biz son zamanlarda telomer T. ifade düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir brucei yüzey antijeni geni 8. Bu nedenle, T. telomer bakım için daha fazla telomer ve mekanizmaların fonksiyonlarını anlamak önemlidir . brucei hücreleri.
Telomer G-çıkıntı yapısı telomeraz aracılı telomer bakım 5 için gerekli. Telomer çıkıntı uzunlukları ölçmek için Yöntemleri telomer bakım mekanizmaları çalışmak için değerlidir. Biz başarıyla hibridizasyon 3-jel doğal kabul edilen ve T. analiz etmek için ligasyonu aracılı astar uzantısı 6 yöntemi var nükleotid telomer terminal belirlenmesi için brucei telomer G-çıkıntı yapısı ve adaptör ligasyonu yöntemi. -Jel Hem yerli hibridizasyon ve adaptör ligasyonu yöntemi, hücre içindeki G çıkıntı toplam tutarı ne olursa olsun, ama sadece ligasyonu aracılı astar uzantısı tam G çıkıntı uzunluğu ortaya çıkarabilir.
Jel hibridizasyon yerli, hazırlık adımları boyunca DNA denatüre önemlidir. Bu TELG oligo prob ile DNA literatürde tarafından kontrol edilebilir. Hiçbir telomer C-çıkıntı olduğundan, yerli TELG hibridizasyon örnekleri kısmen denatüre sürece herhangi bir sinyal vermeyecektir gerekir. Telomer G-çıkıntı herhangi bir nukleaz aktivite çok hassas olduğundan örneği de iki hafta içinde kullanılmalıdır.
Adaptör ligasyonu ve astar uzantısı için, saflaştırılmış oligoes daha net sonuçlar verir. Exo T Exo ben 3 özel tek telli çıkıntı DNA yarma için daha etkili. Tavlanmış örnekleri Eşit yükleme telomer toplam tutarı G-çıkıntı ölçümü için çok önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz bilimsel tartışmalar ve anlayışlı önerileri için Dr. Carolyn Fiyat teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe AI066095 (PI: Bibo Li) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SeaKem LE Agarose | Lonza Inc. | 50004 | |
| Agarose Type VII (low melting agarose) | Sigma-Aldrich | A4018 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche Group | 03 115801001 | |
| Exo I | New England Biolabs | M0293 | |
| Exo T | New England Biolabs | M0265 | |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
| QIAquick nucleotide removal kit | Qiagen | 28304 |
References
- Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20, 579-588 (2001).
- Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2. Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).
- Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell. 72, 51-60 (1993).
- McElligott, R., Wellinger, R. J. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes. EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).
- Harrington, L. A., Greider, C. W. Telomerase primer specificity and chromosome healing. Nature. 353, 451-454 (1991).
- Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres. Embo J. 20, 4299-4308 (2001).
- Barry, J. D., McCulloch, R. Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite. Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).
- Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137, 99-109 (2009).
