Summary
הטלומרים חיוניים יציבות הכרומוזום ואת מבנה הטלומרים G-הסככה חיוני תחזוקה telomerase בתיווך הטלומרים. אימצנו לאחרונה שתי שיטות לאיתור מבנה הטלומרים G-הסככה ב
Abstract
מבנה ה-G-הסככה הטלומרים זוהתה אאוקריוטים רבים, כולל שמרים, חוליות, ו Trypanosoma brucei. היא משמשת מצע עבור telomerase עבור סינתזה דה נובו הטלומרים בדנ"א, ולכן הוא חשוב לצורך תחזוקה הטלומרים. ט brucei הוא טפיל protozoan שגורמת מחלת השינה בבני אדם nagana בבקר. המארח יונקים נגועים פעם, ט תא brucei בקביעות מתגים אנטיגן פני השטח שלו להתחמק ההתקפה החיסונית של המארח. אנחנו הוכיחו לאחרונה כי ט מבנה brucei הטלומרים ממלא תפקיד חיוני בוויסות ביטוי הגנים אנטיגן פני השטח, שהוא קריטי עבור T. brucei בפתוגנזה. עם זאת, ט ' מבנה brucei הטלומרים לא נחקרה בהרחבה עקב הגבלה של שיטות ניתוח של מבנה זה המקצועית. יש לנו עכשיו אימצו בהצלחה את הילידים ג'ל הכלאה ו בתיווך קשירת תחל הרחבה שיטות בדיקה של מבנה ה-G-הסככה הטלומרים וכן קשירת מתאם שיטה לקביעת המסוף הטלומרים נוקלאוטיד ב ט brucei תאים. כאן, נתאר את הפרוטוקולים בפירוט ולהשוות יתרונות שונים שלהם ואת המגבלות.
Protocol
1. זיהוי ט brucei הטלומרים G-הסככה באמצעות שפת In-ג'ל הכלאה 3
עקרון (איור 1): תחת מצב הילידים, קץ שכותרתו (CCCTAA) 4 (TELC) אוליגו בדיקה רק יכול להכליא את הטלומרים חד גדילי ה-G-הסככה האזור. עוצמת הכלאה הוא יחסי האורך של הסככה. לאחר denaturation ו נטרול, בדיקה אותה יוכלו להכליא באזור הטלומרים כולו. עוצמת הכלאה מייצג את הסכום הכולל דנ"א הטלומרים והוא יכול לשמש כביקורת הטעינה. שני הפקדים הרגילים לצורך הניסוי הזה הם הכלאה משתמש הקצה שכותרתו (TTAGGG) 4 (TELG) אוליגו בדיקה, אשר לא צריכים להניב כל אות כ ט תא brucei אין מבנה הטלומרים C-הסככה, ואת לטפל הדנ"א הגנומי עם 3'ספציפי יחיד תקועים exonucleases כגון EXO EXO אני או T לפני הכלאה, שאמור לחסל את האות יליד הכלאה TELC.
שלב 1. הכינו אטמי DNA עבור ג'ל אלקטרופורזה פעמו שדה (PFGE)
כרומוזומים שלם יופרדו על ידי PFGE. לכן, הדנ"א הגנומי מוכן כמו אטמי ה-DNA.
- התחל עם 100 מ"ל של תאים טופס הדם (ב 1.5 -2,000,000 תאים / מ"ל), או 20 מ"ל של תאים procyclic (ב 10 מיליון תאים / מ"ל).
- ממיסים 1.6% נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose ב L חיץ (0.01 מ 'טריס • CL-pH 7.6, 0.02 M NaCl, 0.1 M EDTA pH 8.0) ולשמור אותו חמים על 50 ° C.
- קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 1.5 krpm, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend תא גלולה עם חיץ L לריכוז סופי של 5 מיליון תאים / מ"ל.
- דגירה ההשעיה התא ב 42-50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- הוסף 1 נפח LMP agarose נפח 1 של תאים. מערבבים היטב, אך במהירות.
- 85 Aliquot μL ההשעיה התא היטב כל עובש תקע חד פעמיות (BioRad).
- לאחר 50-10 דקות או עד תקעים הם הקרושה, תקעים להעביר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם חיץ מ"ל 5 L / Sarkosyl 1%. הוספת 100 μL של 250 מ"ג / מ"ל proteinase K או קמצוץ proteinase K אבקה, לערבב היטב, דגירה על 50 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
- מחק את המאגר, לשטוף תקעים עם 5 מ"ל של חיץ L פעמיים וחזור העיכול proteinase K לעוד 48 שעות. לשטוף עם אטמי חיץ L טרי שוב. חנות תקעים בבית 4 ° C במאגר L. תקעים אלה יש להשתמש בתוך 2 שבועות.
שלב 2. ט שלמים ונפרדים brucei הכרומוזומים באמצעות ג'ל אלקטרופורזה פעמו שדה
- הכן agarose ג'ל
- הכן 2-3 L של המאגר TBE 0.5 x ולהעביר לחדר ג'ל ריצה של יחידת DRII (BioRad) שף. הגדר את הטמפרטורה פועל, הפעל את המשאבה, ואז להתחיל את יחידת הקירור.
- הכן 100 מ"ל של 1.2% agarose ג'ל חיץ 0.5 x TBE. מגניב agarose תוך הגדרת מגש ג'ל.
- החלט את הסדר המדגם. זכור לכלול את תקן ה-DNA. יבש את המסרק ולהניח אותה על משטח שטוח. המקום כל תקע ה-DNA על השן המתאים. הסר חוצץ מוגזם סביב לחבר את ה-DNA על ידי כך השאיפה לחבר את ידבק השן.
- יוצקים את הג'ל agarose ללא החדרת מסרק. תן לזה להתקרר עד 40-50 ° C (מספר דקות), לאט לאט להכניס את המסרק עם אטמי המצורף לתוך הג'ל. ודא כי המצתים לא להחליק את המסרק. בואו לחזק את הג'ל. הסר מסרק מן ג'ל לאט.
- שדה פעמו ג'ל אלקטרופורזה
הפעל ג'ל ביחידה השף DRII: 700 s-1500 של קטניות, 2.5 V / cm, ב 12 מעלות צלזיוס למשך 120 שעות.
שלב 3. הכתם destain הג'ל agarose
הכתם ג'ל עם ברומיד Ethidium 1μg / מ"ל ב 0.5 x TBE ב RT עבור שעה 1 אז 0.5 x TBE ללא ברומיד Ethidium עבור שעה 1 עם נדנדה עדין. קח תמונה של הג'ל.
שלב 4. יבש את הג'ל agarose
מניחים את הג'ל agarose על שתי שכבות של נייר 3 מ"מ Whatman ולכסות את הג'ל בניילון נצמד. יבש את הג'ל ב RT (הג'ל לא אמור להיות סוער יותר מ -50 ° C כדי למנוע denaturation של דגימות DNA). החלף את ניירות רטוב Whatman עם אלה יבש לאחר 2 ו - 4 שעות של ייבוש, בהתאמה. שמור ייבוש עד הג'ל יבשה לחלוטין. זה עלול לקחת בין לילה תלוי המייבש.
שלב 5. לייבל בדיקות אוליגו
מערבבים 1 μL של TELC ng / μL 50 או TELG אוליגו עם μL 1 מתוך 10 x חיץ Polynucleotide קינאז (PNK), 5 μL של γ [32P] ATP, 2 μL של DDH 2 O, ו - 1 μL של PNK T4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הוסף 90 μL של TNES חיץ (10 mM טריס Cl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 1% SDS) לתערובת התגובה.
בעוד תיוג oligoes, להכין עמודה G-25: לשים קצת צמר זכוכית לתוך מזרק 3 סמ"ק וכאלה אותו בחוזקה עם קצה פיפטה. מלאו את המזרק עם Sephadex G-25 דק (autoclaved ב TE) ועד 3 מ"ל סימן. תן לו להתיישב לפי משקל. כדי לטהר את החללית שכותרתו: לטעון את החללית על גבי העמוד. לשטוף עם μL 700 של חיץ TNES ו elute עם μL 600 של חיץ TNES. לחלופין, לטהר את תווית בדיקה באמצעות ספין מהירים מיני ™ עמודה (Roche Applied Science).
שלב 6: הכלאה
- בקצרה להרטיב את הג'ל מיובשים במים מזוקקים לשטוף כל נייר Whatman תקוע על הג'ל
- מניחים את הג'ל בשק הכלאה ולהוסיף 20 מ"ל של חיץ hybridiztion (0.25M Na 2 HPO 4 pH7.2: 1 mM EDTA, 7% SDS, 1% ארגון ה-BSA, מסונן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר). דגירה באמבט מים ב 50 ° C עם נדנדה עדין במשך שעה לפחות 1.
- הסר את חוצץ מראש הכלאה. מרתיחים את החללית שכותרתו 5 דקות ולהוסיף אותו 25 מ"ל של חיץ הכלאה טריים, מסנן לעקר את לערבב עם מסנן 0.22 מיקרומטר מזרק ומוסיפים את תערובת הכלאה ישירות בתיק הכלאה. חותם את התיק במקום במיכל רדוד עם מים חמים. מניחים את מיכל שלם לאמבטיה מים. לדגור על 50 מעלות צלזיוס לילה עם נדנדה עדין.
- גזור פתח קטן בתיק הכלאה. יוצקים החוצה ככל האפשר לערבב את ההכלאה ולשמור אותו צינור חרוטי 50 מ"ל. שמור את החללית קפוא ב -20 ° C. הסר את הג'ל מתיק הכלאה ושמתי אותו במיכל.
בשלב הזה הכל יהיה חם צריך לנקות נרחב (, ספסל SCREEN, מספריים, וכו '. הקפד ללבוש שתי שכבות של כפפות! - שטפו את ג'ל 4 x SSC למשך 30 דקות ב 50 ° C. החלף חיץ טרי לשטוף וחזור פעמיים.
- שטפו את ג'ל 4 x SDS SSC/0.1% ב 50 ° C.
- מכניסים את הג'ל על פיסת נייר Whatman 3 מ"מ קלות לייבש את הג'ל.
- עטפו את הג'ל בניילון נצמד לחשוף phosphorimager עבור ~ 3 ימים
- סרוק את phosphorimager
- דגירה ג'ל חיץ denaturing (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) בשעה RT למשך 30 דקות
- שטפו את הג'ל במאגר נטרול (3 M NaCl, 0.5 מ 'טריס • / Cl-pH 7.0) בשעה RT למשך 30 דקות
- שטפו במים מזוקקים במשך 3 דקות
- טרום להכליא על 55 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה
- חזור על הכלאה באמצעות בדיקה המכילים אותו תמהיל הכלאה על 55 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף כמתואר לעיל, למעט ב 55 ° C.
- עטפו את הג'ל ולחשוף את phosphorimager עבור ~ 2 שעות.
- סרוק את phosphorimager. נרמל את האות הכלאה שהושג לפני denaturation עם זה שהושג לאחר denaturation.
2. קבע את מסוף הטלומרים נוקלאוטיד ידי קשירת מתאם 6
עקרון (איור 2A & 2B): 5 "סוף שכותרתו oligonucleotide ייחודי ligated ל 3" סוף הסככה-G. מטרה זו מושגת על ידי חישול אוליגו ספציפיים מדריך משלימים. רק נושאי ייחודי / המדריך אוליגו מתאם רצפים תואם ה-G-הסככה רצפים הטלומרים מסוף יהיה ligated. עבור T. brucei, הטלומרים רשאית להפסיק בכל אחד מששת נוקלאוטידים שונים של חוזר TTAGGG. לפיכך six oligoes מדריך שונים משמשים (TG1-TG6, איור 2 א). לאחר קשירת, ה-DNA הוא מתעכל עם endonucleases הגבלה והחליט על ג'ל agarose.
- קינאז הטיפול אוליגו הייחודי.
מערבבים 6 μL של pmole 10 / אוליגו ייחודי μL עם μL 3 של הצפת PNK 10x, 5 μL של γ [32 טז] ATP, 14 μL של DDH 2 O, ו - 2 μL (10 U) של PNK T4. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. - הסר נוקלאוטיד חם מאוגדים.
השתמש ערכת Qiaquick הסרת נוקלאוטיד כדי להסיר את חם מאוגדים ATP ו elute הקצה שכותרתו עם אוליגו 60 μL של הצפת elution (הריכוז הסופי יהיה ~ 1 pmole / μL). - לחשל אוליגו ייחודית מדריך אוליגו (כדי ליצור את המתאם).
הוסף 10 μL של מטוהרים אוליגו ייחודית μL 2 של כל אוליגו מדריך 1 חיץ חישול μL (200 mM NaCl, 100 מ"מ טריס-HCl pH 8.0). שים צינורות לתוך בלוק 85 חום מעלות צלזיוס לכבות את גוש חום. תן צינורות חום לחסום מגניב RT. זה ייקח כמה שעות. אם בתוך צינור, ממהר להעביר לאחר 5 דקות כל אחד עד 65 מעלות צלזיוס, אז 37 ° C, ואז לתת לה להתקרר RT. - מתאמי ולקשור לסך הדנ"א הגנומי.
כדי μL 2.5 של הדנ"א הגנומי שלמים, להוסיף 4 μL של חיץ האנזים 5 x, 10 μL של oligos annealed, 2.5 μL של DDH 2 O, ו - 1 μL של האנזים T4 DNA. לדגור על 16 מעלות צלזיוס למשך הלילה. - Endonuclease הגבלת עיכול
כדי 20 μL של המוצר קשירת להוסיף 3 μL של 10 x חוד חוצץ 4, 1.5 ו μL של AluI MboI כל אחד, 4 μL של DDH 2 O. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. - אלקטרופורזה.
הוסף 3 μL של 10 x G צבע כתום (גליצרול 50%, 0.5% אורנג' G) מדגם זה. טען את דגימות DNA על 0.7% 20x20 ס"מ agarose ג'ל 0.5 x TBE עם 0.2 מיקרוגרם / מ"ל Ethidium ברומיד. הפעלה על 30V למשך 30 דקות, אז גontinue עם מתח גבוה יותר אך פחות מ 120V לסך של 1000 v hr. קח תמונה של ג'ל עם סרגל ליד סמן את ה-DNA. - ג'ל יבש לחשוף.
מכניסים את הג'ל agarose על שכבה של נייר DE81 לסנן שתי שכבות של נייר Whatman 3 מ"מ לכסות את הג'ל בניילון נצמד. ג'ל יבש ב RT. לחשוף את הג'ל יבשים phosphorimager לילה.
3. מתווכת קשירת פריימר הרחבה 6
עקרון (איור 2A & 2C): oligonucleotide ייחודי ligated ל 3 'G-הסככה עם רצף מסוף מסוים, שנקבע על ידי רצפי משלים שלה מתאם (מדריך) אוליגו. לאחר הטיהור, אוליגו מדריך שכותרתו שנשאר annealed את אוליגו G-overhang/unique היא תחל המורחבת לצומת SS-DS באמצעות DNA פולימרז T4, שאין עקירה גדיל ופעילויות exonuclease "5'-3. הארכת מוצרי פריימר ולכן לתת את אורך הסככה-G.
- קינאז טיפול של oligoes מדריך ייחודי
- מערבבים 20 μL של pmole 10 / אוליגו ייחודי μL עם μL של 10 x 10 PNK חיץ, 5 x 20 μL חיץ האנזים (אשר מכיל 10 mM ATP), 3 μL (30 U) של PNK T4, ו 47 μL של DDH 2 O . דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- מערבבים 1 μL של pmole 10 / מדריך אוליגו μL עם μL 1 מתוך 10 x PNK חיץ, 2 μL של γ [32 טז] ATP, 1 μL (10 U) של PNK T4 ו 5 μL של DDH 2 O. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- לחשל מדריך אוליגו וייחודי אוליגו
הוסף 10 μL (20 pmole) של אוליגו הייחודי phosphorylated ו 10 μL (10 pmole) של סוף שכותרתו מדריך אוליגו בתוך צינור 1.5 Eppendorf מ"ל (יחס של 2:01 ייחודית מדריך אוליגו מבטיח כי כל אוליגו המדריך הוא annealed ). בצע את ההליך המתואר באותו פרוטוקול II עבור חישול oligoes. - ולקשור את המדריך annealed / מתאם אוליגו ייחודית קצוות הטלומרים
בצע את ההליך המתואר באותו פרוטוקול II עבור קשירת ה-DNA. - המשקע DNA עם נפח 1 / 10 של נתרן אצטט ו 2.5 נפח אתנול קרים כקרח ב -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. ספין למטה DNA גלולה בשעה 12 krpm, 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לשטוף DNA עם 70% אתנול ו להמיס בתוך המזרן μL 10 של DDH 2 O.
- פריימר הארכה
כדי דגימת DNA 10 כל μL להוסיף 2 μL של 10 x חיץ T4 DNA פולימראז, 1 μL של BSA 1 מ"ג / מ"ל, 1 μL של 25 מ"מ dATP, dCTP, ואת כל dTTP, 1 μL (3 U) של ה-DNA פולימראז T4, ו 3 μL של DDH 2 O.
הכן תערובת הורים עם פולימראז, חיץ, וכו 'כמות aliquot המתאים לערבב את המאסטר מדגם ה-DNA. לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. ואז להוסיף 1.2 μL של EDTA 0.5m מיד התגובה. - אלקטרופורזה
הפעל המוצרים הרחבה על acrylamide של 10% / 7 ג'ל M urea/1xTBE. טעינת 4 μL של כל דגימה. מרתיחים את הדגימות למשך 10 דקות לפני הטעינה. הפעלה ב 800V ב TBE 1x עד צבע כחול מגיע לתחתית הג'ל. יבש את הג'ל על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ואז RT למשך 30 דקות ולחשוף את phosphorimager עבור 2 שעות.
כדי להכין 100 מ"ל של ג'ל polyacrylamide 10%, לפזר 41 גרם דשן ו 21 מ"ל של תמיסת Acrylamide 40% (acrylamide / bis-acrylamide 29:1) בתוך 30 מ"ל של מים מזוקקים, להוסיף 10 מ"ל של TBE 10x. הרכבת לוחות זכוכית. ממש לפני יציקת ג'ל, הוסף 1 מ"ל של APS 10% ו 100 μL של TEMED. יוצקים את הג'ל ולנסות למנוע בועות.
4. נציג תוצאות:
זיהוי ט brucei הטלומרים G-הסככה מבנה באמצעות ילידים ג'ל הכלאה
אינטקט ט הכרומוזומים brucei מופרדות PFGE מוצגים איור 3A ו - 3B (פאנלים משמאל). ט תאים brucei בדרך כלל מכילים ~ 100 עותקים של minichromosomes, עם כל גודל דומה (50-150 kb) ולהעביר לאותו המיקום על הג'ל (MC). בשל עובדה זו, לאחר הכלאה עם TELC אוליגו החללית, האות G-הסככה הטלומרים הוא הבולט ביותר על minichromosomes (איור 3A, פאנל באמצע). הכלאה עם TELG אוליגו בדיקה בדרך כלל לא תשואה כל אות הכלאה (איור 3B, פאנל באמצע) כי טי תאים brucei אין מבנה הטלומרים C-הסככה. לאחר denaturation ו נטרול, הכלאה עם או TELC או TELG אוליגו בדיקה צריך לחשוף אותות הטלומרים בכל קצות הכרומוזומים (איור 3A & 3B, לוחות מימין).
קבע את מסוף הטלומרים נוקלאוטיד ידי קשירת מתאם
טוען כמות שווה של דנ"א בנתיב זה חיוני assay זה, זה מוצג על ידי מכתים ברומיד Ethidium של הג'ל. דוגמה לכך היא שמוצג באיור 4 א, הפאנל השמאלי.
בפרוטוקול זה, סוף שכותרתו הייחודי אוליגו ומדריך מתאמי אוליגו ligated הם רק קצה הכרומוזום כאשר הטלומרים G-המסוכך וכלה רצפים התואמים אוליגו מדריך. סי nce אוליגו ייחודי מקצה תווית, המוצר קשירת יהיה רדיואקטיבי ולתת אות חזק. כפי שניתן לראות בתרשים 4A, הפאנל הימני, נתיב 1 נותן איתות חזק, המציין כמות גדולה של מתאם unique/TG1 כבר ligated לסיים את הטלומרים. TG1 יש רצף סיום 5'CCCTAA3 ". מכאן הטלומרים G-המסוכך ligated לסיים את המתאם 5'TTAGGG3 ". אין כמות משמעותית של מוצרי קשירת הוא ציין באמצעות oligoes מדריך אחר, המציין כי הטלומרים שהסתיימו TTAGGG יש להן משקל מכריע ט brucei תאים.
טיפול הדנ"א הגנומי עם EXO EXO אני או T, אשר nucleases הסככה ספציפי "3, הביא להפסד של המוצרים קשירת (איור 4A, פאנל הנכון, נתיבי 2 ו -3), המציין כי קשירת אכן נבע הטלומרים-G מבנה הסככה
מתווכת קשירת פריימר Extension
ללא קשירת, סוף שכותרתו מדריך אוליגו הוא 22 NT ארוך. טוען הקצה שכותרתו מדריך אוליגו ישמש שליטה שלילי סמן גודל. (איור 4B, מסלול 11, כוכבית מציינת את סוף שכותרתו מדריך אוליגו). בדרך כלל אנחנו גם רואים להקה של ~ 44 NT בשליטה זו שלילית (איור 4 ב ', מסלול 11, משולש פתוח), אשר קרוב לוודאי לא מפוגל מתאמי שאריות. לאחר קשירת לסוף הכרומוזום, בגודל של מוצר המורחבת משקף את אורכו של מבנה ה-G-הסככה. רוב ט brucei הטלומרים G-המסוכך להסתיים 5'TTAGGG3 "(איור 4 א). עם זאת, אלה G-המסוכך להיראות קצר מאוד (רק ~ 10 nt ארוך), כמו מוצרי המורחבת מן ligated TG1 מדריך אוליגו אינם הרבה יותר מאשר אוליגו המדריך עצמו (איור 4 ב ', מסלול 10), אבל הם מאפשרים קשירת של TG1 מתאם (איור 4A, הפאנל הימני, במסלול 1). אמנם רק כמות קטנה של מתאם TG4 היה ligated עד קצה הטלומרים (איור 4A, הפאנל הימני, נתיב 6), מוצרי המורחבת TG4 ligated הם הרבה יותר (איור 4 ב ', נתיב 7, ראשי חץ), עם המוצר הכי הרבה זמן להיות ~ 55 NT. לפיכך, ראינו שני סוגים של הטלומרים G-הסככה ב ט brucei תאים. השולט הטלומרים G-המסוכך על הקצה "5'TTAGGG3 אבל הם רק ~ 10 nt ארוך. מעטים הטלומרים G-המסוכך להסתיים 5'GGGTTA3 "אבל יכול להיות upto 40 nt ארוך. שני סוגים של הסככה-G רגישים EXO T (או EXO אני) טיפול (איור 4A, פאנל הנכון, מסלול 2, 3 ו 7; איור 4B, מסלול 1, חיצים).
באיור 1. עקרון הכלאה של ג'ל הילידים. שמאלי, בתנאי הילידים, הקצה שכותרתו TELC אוליגו בדיקה רק יכול להכליא עם הסככה ה-G-עשיר חד גדילי הטלומרים. עוצמת הכלאה משקף את אורך הסככה G-הטלומרים. נכון, אחרי denaturation, אוליגו TELC בדיקה יהיה להכליא עם ה-DNA כל הטלומרים. עוצמת הכלאה זה מייצג את הסכום הכולל של ה-DNA הטלומרים והוא משמש כביקורת טוען, ורמת הסופי G-הסככה מחושב על ידי חלוקת האות על ידי הכלאה מקורית כי המתקבל לאחר denaturation.
איור 2. עקרון קשירת מתאם ו בתיווך קשירת הרחבה פריימר. (א) רצפים של oligoes מדריך ייחודי שש. (ב) קבע את מסוף הטלומרים נוקלאוטיד ידי קשירת מתאם. אוליגו ייחודי מקצה שכותרתו (המסומנים בכוכבית אדומה), annealed את oligoes מדריך ligated לסיים את הטלומרים. רק כאשר מתאם ייחודי / מדריך דובים הסככה '3 התואם את רצף הטלומרים מסוף יהיה מתאם להיות ligated. (ג) הארכת תחל בתיווך קשירת, אוליגו המדריך הוא הקצה שכותרתו (המסומנים בכוכבית אדומה) ו annealed כדי אוליגו הייחודי לפני ligated עד קצה הכרומוזום. רק מתאם / מדריך ייחודי הנושא הסככה תואמת הסככה-G '3 יהיה ligated. ^ מציין את הקשר phophordiester ligated. לאחר הסרת זוגות אוליגו unligated, הארכת תחל יבוצע עם DNA פולימראז T4, שאין עקירה גדיל ופעילויות exonuclease "5'-3. אורכו הסופי של המורחבת מדריך אוליגו ולכן משקף את אורך הסככה-G.
איור 3. ט brucei הטלומרים G-הסככה מבנה ונותחו על ידי ילידים ג'ל הכלאה. (א) ג'ל הכלאה עם TELC אוליגו בדיקה. (ב) ג'ל הכלאה עם TELG אוליגו בדיקה. בשני (א) ו - (ב) מוכתם שמאל, Ethedium PFG ברומיד. התיכון, בעקבות הכלאה מקורית. נכון, שלאחר denaturation תוצאה הכלאה. Wild מסוג T. תאים brucei היו בשימוש. שלם או EXO טיפלתי הדנ"א הגנומי הופרדו על ידי PFGE. משולש פתח מייצג את הכרומוזומים megabase; IC, כרומוזומים בגודל ביניים; MC, minichromosomes.
"/>
איור 4. ט brucei הטלומרים G-הסככה מבנה ונותחו על ידי הרחבה, קשירת בתיווך פריימר. (א) רוב ט brucei הטלומרים G-המסוכך לסיים ב 5'TTAGGG3 ". השמאל, ברומיד Ethedium מוכתם DNA ג'ל. סכום השווה בערך של ה-DNA טעון בנתיב אחד. נכון, בעקבות החשיפה של ג'ל אותו לאחר הייבוש. תמים, אני EXO שטופלו או EXO T-DNA היה מטופל ligated עד שישה שונה מקצה תווית ייחודית / מדריך מתאמי אוליגו כמצוין. (ב) ט הטלומרים brucei יש קצר G-הסככות. שלם או EXO T-שטופלו הדנ"א הגנומי היה ligated עד שישה ייחודי / מדריך מתאמים שונים אוליגו ואחריו סיומת פריימר באמצעות DNA פולימרז T4. קצה שכותרתו TG4 אוליגו נטען כביקורת שלילית (מסלול 11). אוליגו עצמו פועל ב 22 NT (*) אלא גם נתן את האות נחלש ב ~ 44 NT (Δ). רק unique/TG4 מתאם הניבו המוצרים הרחבה משמעותית יותר אוליגו המדריך עצמו (ראשי החץ, במסלול 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trypanosoma brucei גורם מחלת השינה אצל בני אדם. מחלה זו, אם אינו מטופל, הוא קטלני באופן בלתי נמנע. ט תאים brucei ב המארחים יונקים לעבור וריאציה antigenic בקביעות כדי להתחמק ההתקפה החיסונית של המארח 7. לכן קשה מאוד לחסל ט תאים brucei פעם דלקת היא הוקמה. אנחנו הוכיחו לאחרונה כי הטלומרים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות של הביטוי של ט ' אנטיגן brucei משטח הגן 8. לכן, חשוב עוד יותר להבין את הפונקציות של הטלומרים ואת מנגנוני תחזוקה הטלומרים ב ט brucei תאים.
מבנה הטלומרים G-הסככה חיוני תחזוקה telomerase בתיווך הטלומרים 5. שיטות למדידת אורך הטלומרים הסככה הם בעלי ערך ללימוד מנגנוני תחזוקה הטלומרים. אימצנו בהצלחה את הילידים ג'ל 3 ו הכלאה קשירת בתיווך הארכת תחל 6 שיטה לניתוח ט brucei הטלומרים G-הסככה מבנה קשירת מתאם שיטה לקביעת מסוף הטלומרים נוקלאוטיד. שניהם ילידי ג'ל הכלאה ושיטת קשירת מתאם יכול לחשוף את הסכום הכולל של הסככה G בתא, אלא רק את הסיומת בתיווך קשירת פריימר יכול לחשוף את אורך המדויק הסככה G.
עבור הילידים הכלאה ג'ל, חשוב שלא לפגל דגימת DNA בכל הצעדים הכנה. זה יכול להיות נשלט על ידי ה-DNA והכלאה עם TELG אוליגו בדיקה. מכיוון שאין הטלומרים C-הסככה, הכלאה TELG יליד לא צריך להניב כל אות אלא אם הדגימות הן מפוגל חלקית. המדגם צריך לשמש גם בתוך שבועיים את הטלומרים G-הסככה רגיש מאוד לכל פעילות nuclease.
עבור קשירת מתאם הרחבה פריימר, oligoes מטוהרים להניב תוצאות ברורות. EXO T הוא יעיל יותר מאשר אני EXO עבור ביקוע גדילי דנ"א יחיד ספציפי '3 הסככה. טעינת שוויון של דגימות annealed חיוניים כימות הסכום הכולל של הטלומרים G-הסככה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
ברצוננו להודות מחיר ד"ר קרולין לדיונים מדעיים הצעות תובנה. עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק AI066095 (PI: Bibo Li).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SeaKem LE Agarose | Lonza Inc. | 50004 | |
| Agarose Type VII (low melting agarose) | Sigma-Aldrich | A4018 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche Group | 03 115801001 | |
| Exo I | New England Biolabs | M0293 | |
| Exo T | New England Biolabs | M0265 | |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
| QIAquick nucleotide removal kit | Qiagen | 28304 |
References
- Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. t-loops at trypanosome telomeres. EMBO J. 20, 579-588 (2001).
- Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2. Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).
- Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell. 72, 51-60 (1993).
- McElligott, R., Wellinger, R. J. The terminal DNA structure of mammalian chromosomes. EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).
- Harrington, L. A., Greider, C. W. Telomerase primer specificity and chromosome healing. Nature. 353, 451-454 (1991).
- Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres. Embo J. 20, 4299-4308 (2001).
- Barry, J. D., McCulloch, R. Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite. Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).
- Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137, 99-109 (2009).
