Summary
Cette vidéo illustre la technique d'extraction d'ADN à partir des espèces de microbes réside dans l'intestin postérieur des termites. La préparation d'une lame de montage humide, ce qui est utile pour visualiser la communauté microbienne intestinale est également illustré, et une tournée à travers les riches en espèces environnement intestinal est donné.
Abstract
Les termites sont parmi les rares animaux connus pour avoir la capacité de subsister uniquement par le bois de consommation. Le tractus intestinal des termites contient une population microbienne dense et riche en espèces qui assiste à la dégradation de la lignocellulose en majorité dans l'acétate, le nutriment clé alimente le métabolisme des termites (Odelson & Breznak, 1983). Au sein de ces populations microbiennes sont des bactéries, les archées méthanogènes et, dans certains termites («inférieure»), eucaryotes protozoaires. Ainsi, les termites sont des sujets d'excellentes recherches pour étudier les interactions entre les espèces microbiennes et les nombreuses fonctions biochimiques qu'ils effectuent au profit de leur hôte. La composition des espèces des populations microbiennes dans les intestins des termites ainsi que des gènes clés impliqués dans divers processus biochimiques a été explorée en utilisant des techniques moléculaires (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Ces techniques dépendent de l'extraction et la purification de haute qualité acides nucléiques à partir de l'environnement intestinal termites. La technique d'extraction décrite dans cette vidéo est une compilation modifiée de protocoles développés pour l'extraction et la purification des acides nucléiques à partir d'échantillons environnementaux (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) et il produit l'ADN à partir de matériaux hindgut termites pouvant servir de modèle pour la réaction en chaîne polymérase (PCR).
Protocol
Résumé de la procédure d'extraction d'ADN de termite ensemble de l'intestin:
- Réfrigérer les termites sur la glace, enlever l'intestin en utilisant une pince à épiler stérile et stabiliser les échantillons dans un tampon de l'intestin.
- Homogénéiser les échantillons dans PVPP / SDS / tampon phénol.
- Extraire et purifier l'ADN de lysat brut à l'aide de colonnes Qiagen DNeasy.
Protocole:
- Sur la glace, enlever les entrailles des termites castes travailleur qui utilise une pince stérile.
- Transférer immédiatement les tripes et le contenu d'une solution stérile, sans nucléase tube contenant 50 ul glacée 1x biologie moléculaire de grade tampon TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Congeler les échantillons à -20 ° C, ou procéder directement à l'homogénéisation.
- Transférer les échantillons intestin et tampon stérile, sans nucléase tube 2 ml à vis plafonné pré-chargé avec 500 mg de stériles zircone / silice perles (0,1 mm) et 700 ul de tampon TE 1x contenant 1% p / v polyvinylpolypyrrolidone (PVPP ).
- Ajouter 50 ul de dodécylsulfate de sodium à 20% (SDS) et 500 ul de phénol pour les échantillons.
- Homogénéiser (battement talon) sur le réglage le plus élevé en utilisant trois cycles de 30 sec homogénéisation et 30 sec de réfrigération de la glace.
- Les sédiments insoluble pendant 1 min à 8000 x g.
- Purifier 300 ul aliquotes de la phase aqueuse (supérieure) couche avec des colonnes Qiagen DNeasy utilisant la méthode décrite pour la purification de lysat brut.
- Quantifier le contenu d'acides nucléiques et les congeler à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.
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Discussion
Dans notre expérience, l'ADN extrait des communautés microbiennes des espèces de termites du bois-alimentation, comme nevadensis Zootermopis est suffisamment pur pour le modèle PCR après un tour d'extraction et de purification. Cependant, certains termites comme de la litière et le sol maternel espèces se nourrissant peut avoir une concentration plus élevée d'acides humiques dans leur contenu intestinal et peut nécessiter une purification supplémentaire de l'ADN microbien intestinal. Le rendement d'ADN total des tripes de 5 travailleurs nevadensis Z. est de l'ordre de 10 à 30 ug. Pour les espèces de termites nettement plus petit ou plus grand que cette espèce, les spécimens plus ou moins peuvent être nécessaires pour obtenir un montant similaire de l'ADN.
Cette méthode peut facilement être adapté pour permettre l'extraction d'ARN. Pour l'extraction d'ARN, substitut 1x RNAprotect bactéries réactif de Qiagen (catlog pas. 76506) pour le tampon TE glacée décrite à l'étape 2 du protocole. Qiagen RNeasy réactifs et des colonnes (catlog pas. 74104) doit être utilisé à la place de la procédure de purification DNeasy décrit ci-dessus. Comme l'ADN peut être purifié à partir d'échantillons RNAprotect stabilisés et seulement 300 pi de l'env. 700 uL couche aqueuse récupérée à l'étape 7 est requis pour la purification d'acides nucléiques, cette méthode peut être utilisée pour récupérer les ADN et ARN en parallèle à partir d'un seul échantillon.
Ces techniques dépendent de l'extraction et la purification de haute qualité acides nucléiques à partir de l'environnement intestinal termites. La technique d'extraction décrite dans cette vidéo est une compilation modifiée de protocoles développés pour l'extraction et la purification des acides nucléiques à partir d'échantillons environnementaux (Plus et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) et il produit l'ADN à partir de matériaux hindgut termites pouvant servir de modèle pour la réaction en chaîne polymérase (PCR).
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
| TE | Buffer | Sigma-Aldrich | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
| zirconia/silica beads | Supplies | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reagent | Sigma-Aldrich | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
| SDS | Reagent | Sigma-Aldrich | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
| Phenol | Reagent | Sigma-Aldrich | 77607 | TE-saturated, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Tool | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1 M soln. of NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |
References
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
