Summary
Denna video visar en teknik för att extrahera DNA från de arter av mikrober bosatt i termit hindgut. Beredningen av en våt montera bild, vilket är användbart för att visualisera samhället tarmen mikrobiella illustreras också, och en tur genom artrika gut miljö ges.
Abstract
Termiter är bland de få djur som är kända för att ha kapacitet att överleva enbart genom att konsumera trä. Den termit tarmen tarmkanalen innehåller en tät och artrik mikrobiell population som hjälper nedbrytningen av lignocellulosa främst i acetat, den viktigaste näringsämne bränslepåfyllning termit metabolism (Odelson & Breznak, 1983). Inom dessa mikrobiella populationer är bakterier, metanbildande arkéer och i vissa ("lägre") termiter, eukaryota protozoer. Således termiter är utmärkta försökspersoner för att studera samspelet mellan mikroorganismer och de många biokemiska funktioner de utför till förmån för sin värd. Artsammansättningen av mikrobiella populationer i termit tarmar samt viktiga gener som är involverade i olika biokemiska processer har undersökts med hjälp av molekylära tekniker (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Dessa tekniker är beroende av utvinning och rening av hög kvalitet nukleinsyror från termiter tarmen miljö. Utvinning teknik som beskrivs i den här videon är en modifierad sammanställning av protokoll som utvecklats för extraktion och rening av nukleinsyror från miljöprover (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) och det ger DNA från termiter hindgut material som lämpar sig för användning som mall för polymeraskedjereaktion (PCR).
Protocol
Sammanfattas förfarandet för termit hel-gut DNA-extraktion:
- Chill termiter på is, ta bort tarmen med hjälp av steril pincett och stabilisera tarmen prover i buffert.
- Homogenisera proverna i PVPP / SDS / fenol buffert.
- Utdrag och rena DNA från råolja lysat använda Qiagen DNeasy kolumner.
Protokoll:
- På is, ta bort inälvor från termiter arbetstagaren kast med steril pincett.
- Omgående överlåta tarmar och innehåll till en steril, nukleasfritt rör som innehåller 50 mikroliter iskall 1x molekylärbiologi kvalitet TE buffert (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Frys proverna vid -20 ° C, eller gå vidare direkt med homogenisering.
- Överför tarmen proverna och buffert till en steril, nukleasfritt 2 ml skruv maximerad rör förinstallerad med 500 mg sterilt zirkonium / kiseldioxid kulor (0,1 mm) och 700 l 1X TE buffert innehållande 1% w / v polyvinylpolypyrrolidon (PVPP ).
- Tillsätt 50 l på 20% natriumdodecylsulfat (SDS) och 500 l fenol i proverna.
- Homogenisera (pärla slå) på den högsta inställningen med hjälp av tre cykler av 30 sek homogenisering och 30 sek av kylning på is.
- Sediment olösligt material i 1 min vid 8000 x g..
- Rena 300-l alikvoter i vattenfasen (översta) lager med Qiagen DNeasy kolumner enligt metoden för råolja lysat rening.
- Kvantifiera nukleinsyra innehåll och prover fryser vid -20 ° C för senare användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enligt vår erfarenhet är DNA ur mikrobiella samhällen i trä-utfodring termit arter som Zootermopis nevadensis tillräckligt rent för PCR-mall efter en runda av extraktion och rening. Dock kan vissa termiter som skräp-matning och jord-matning arter har en högre koncentration av humus i tarmen innehåll och kan kräva ytterligare rening av tarmen mikrobiella DNA. Den totala DNA avkastningen från inälvor av 5 Z. nevadensis arbetstagare är i intervallet 10-30 mikrogram. För termit arter betydligt mindre eller större än denna art, kan fler eller färre exemplar behövas för att få ett liknande belopp av DNA.
Denna metod kan lätt anpassas så att RNA-extraktion. För RNA-extraktion, ersättare 1x RNAprotect Bakterier reagens från Qiagen (catlog nr. 76.506) för det iskalla TE buffert som beskrivs i steg 2 i protokollet. Qiagen RNeasy reagenser och kolumner (catlog nr. 74.104) bör användas i stället för den DNeasy rening som beskrivs ovan. Som DNA kan renas från RNAprotect stabiliserad prov och endast 300 mikroliter av ca. 700 mikroliter vattenskiktet hämtas i steg 7 krävs för nukleinsyra rening, kan denna metod användas för att hämta både DNA och RNA parallellt från ett enda prov.
Dessa tekniker är beroende av utvinning och rening av hög kvalitet nukleinsyror från termiter tarmen miljö. Utvinning teknik som beskrivs i den här videon är en modifierad sammanställning av protokoll som utvecklats för extraktion och rening av nukleinsyror från miljöprover (fler et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) och det ger DNA från termiter hindgut material som lämpar sig för användning som mall för polymeraskedjereaktion (PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
| TE | Buffer | Sigma-Aldrich | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
| zirconia/silica beads | Supplies | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reagent | Sigma-Aldrich | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
| SDS | Reagent | Sigma-Aldrich | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
| Phenol | Reagent | Sigma-Aldrich | 77607 | TE-saturated, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Tool | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1 M soln. of NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |
References
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
