Summary
Cet article illustre comment utiliser correctement l'Helios BioRad Gene Gun pour introduire l'ADN plasmidique dans les cellules de l'épiderme et l'oignon comment tester interactions protéine-protéine dans les cellules de l'oignon basé sur le principe de complémentation par fluorescence bimoléculaire (BiFC)
Abstract
Enquête sur la fonction des gènes dans des organismes variés s'appuie sur la connaissance de la façon dont les produits des gènes interagissent les uns avec les autres dans leur environnement cellulaire normal. La complémentation bimoléculaire fluorescence (BiFC) Assay
Protocol
I. préparation de plasmide
L'ADN plasmidique utilisé pour le bombardement doit être de haute pureté et à une concentration de 500ng/μl ou supérieure. Pour BiFC impliquant deux constructions plasmidiques, 25 pg de chaque plasmide est nécessaire. En d'autres termes, rapport molaire 1:1 des deux plasmides doivent être mélangés pour donner naissance à 50 pg d'ADN plasmidique total pour la préparation des cartouches. Soyez conscient que l'ajout de plus d'ADN de 50 mg peut provoquer une agglomération des particules d'or et devrait être évitée. Disponibles dans le commerce des kits d'extraction d'ADN plasmidique sont recommandés pour les isoler des ADN plasmidiques.
Les vecteurs plasmidiques devraient être relativement de petite taille tels que pUC19. Nous avons cloné SEU et LUH ADNc dans pUC19-SPYNE et pUC19-SPYCE, respectivement 3. Vecteurs binaires pour transformation par Agrobacterium sont trop grosses et inadaptées pour le bombardement.
II. Cartouche préparation
Préparation des cartouches implique des particules d'or revêtement avec l'ADN plasmidique et leur chargement dans le tuyau en plastique qui est ensuite découpé en morceaux moitié pouce de long, qui peut être chargé dans la cartouche porteurs du gène pistolet. Préparation des cartouches est décrit en détail une grande dans un article séparé Jove 4 et n'est donc pas décrite ici. Pour le bombardement de cellules d'oignon, nous vous recommandons de mélanger 50 ug d'ADN plasmidique avec 12,5 mg de particules d'or par la préparation, ce qui donne environ jusqu'à 50 cartouches à 1 ug DNA/0.25 mg d'or / cartouche. Chaque cartouche est d'un seul coup. Les particules d'or peut être soit 0,6 um ou 1,0 m de diamètre (Cat # 1652262 # 1652263 ou Cat; Biorad). Nous recommandons aussi d'utiliser 0,5 mg / ml solution PVP pour la préparation des cartouches. Pour BiFC, combiner les deux ADN plasmidique de chaque partenaire d'interaction putative dans la préparation même cartouche.
Après une préparation cartouche, il est important de tester les cartouches en tirant des cartouches nouvellement faite à une pression d'hélium entre 150 à 200 psi dans un Parafilm carré qui est enroulé autour d'une boîte de Pétri. Ce sera de tester si les particules d'or peut être propulsé de manière efficace à partir des cartouches, vous devriez voir les particules d'or pâle sur le Parafilm. Cela vous donne une idée de la zone qui couvrira chaque tir. Vous remarquerez peut-être différentes quantités de particules d'or propulsé sur la Parafilm à différentes pressions d'hélium (à 150-200 gamme de psi). S'il n'y a pas de différence significative, choisissez la basse pression pour le bombardement.
III. Préparation des tissus d'oignon
Le jour du tournage, décollez la peau extérieure d'un gros oignon jaune. En utilisant une lame de rasoir propre et bien aiguisé, couper 4-5 couches profondes d'une zone rectangulaire d'environ 2 x 8 cm. Sortez le tissu rectangulaires oignons, jetez les deux couches extérieures, couper les autres couches de l'oignon en morceaux environ 2x1.5 cm. Placez les morceaux d'oignon dans une boîte de Petri contenant du papier filtre (papier Whatman 3MM couper en cercles) humidifié avec de l'eau stérile. Couvrir le plat de Pétri et ils sont prêts à aller.
IV. Bombardement
- Charger les cartouches dans le porte cartouche ronde blanche. Cartouches contenant différentes constructions plasmidiques doivent être chargés en porte-cartouches différentes. Chaque support de la cartouche peut contenir jusqu'à 12 cartouches pour 12 tirs.
- Insérez la batterie et la doublure baril frais dans le pistolet à gènes Helios. Assurez-vous que le liner baril et le pistolet ont respectifs joints toriques joints.
- D'abord, insérez un support cartouche vide dans le canon à gènes, avec la marque N ° 12 sur le support de la cartouche vers le sommet de l'arme. Support de la cartouche d'avance une ou deux fois pour s'assurer qu'elle est insérée correctement.
- Fixez pistolet au réservoir d'hélium et d'ajuster la pression entre 150 à 200 psi.
- Porter une protection auditive et le pistolet feu à quelques reprises avec le support de la cartouche vide pour nettoyer la chambre de l'arme et de s'assurer que la pression est stable.
- Retirez le support de la cartouche vide et insérer un support de la cartouche chargée. Faire progresser le support de la cartouche de sorte que la cartouche que vous voulez le feu est placé au fond (06 heures) du support de la cartouche. Tir d'un morceau d'oignon ici fournit une forme de contrôle négatif pour la fluorescence de fond.
- Placez les morceaux d'oignon au milieu d'un plat vide Petri avec la couche la plus interne de l'oignon vers le haut. Reste paquebot le baril du pistolet gène sur boîte de Pétri et le feu au pistolet en appuyant sur le bouton latéral tout en tirant sur la gâchette. Transférer les oignons bombardé à une boîte de Petri contenant humides papier 3MM filtre.
- Avance à la cartouche suivante et le feu un morceau d'oignon différent. Répétez cette étape jusqu'à ce que quatre à cinq morceaux d'oignons sont fusillés. Chaque morceau d'oignon est tiré une fois.
- Changer pour un support de cartouche différents chargé avec des cartouches contenant une combinaison de différents plasmides ou différents plasmides. N'oubliez pas de changer le liner le baril unes bien pour empêcher la contamination. Tirez sur quatre à cinq morceaux d'oignon.
- Après le bombardement, retourner toutes les oignons aux plats perti. Couvrir les boîtes de Pétri avec des couvercles. Enveloppez-les avec du Parafilm pour éviter le dessèchement. Incuber les morceaux d'oignon à la température ambiante dans l'obscurité pendant 16 à 48 heures.
- Éteignez la pression du gaz et de libération avant de détacher le pistolet à gènes à partir du réservoir d'hélium. Dévissez la doublure baril, et retirez le support de la cartouche et les cartouches utilisées (ou non).
- Nettoyage porte-cartouches et les doublures baril en les submergeant dans un bécher avec de l'eau savonneuse. Placer le bécher dans un bain d'ultrasons et soniquer pendant 20 minutes. Ensuite, les rincer à l'eau pour enlever tous les résidus de savon. Faites-les tremper dans de l'éthanol à 70% pour une heure, puis les sécher sur du papier absorbant.
V. Observation
- Après une incubation morceaux d'oignon bombardé pendant 16-20 heures à température ambiante, on peut observer la GFP ou YFP fluorescence en utilisant un microscope à fluorescence comme le Zeiss Axio Observer.z1 utilisées dans cette étude.
- Utilisez une pince à bouts plats lentement peler une couche de cellule unique hors de l'épiderme interne de l'oignon (la couche qui donne directement sur le pistolet pendant le bombardement). Placez le zeste sur une goutte d'eau sur une diapositive. Ajouter lamelle mais attention à minimiser les bulles.
- Sous champ lumineux du microscope, vérifiez d'abord pour le streaming cytoplasmique de s'assurer que les cellules sont vivantes. Pour ce faire, exposer la diapositive à la lumière brillante de terrain pendant quelques minutes pour réchauffer le tissu oignon et ensuite chercher plastes mouvement. Le streaming cytoplasmique n'est pas toujours facile à voir, donc ne vous découragez pas si vous ne pouvez pas voir toute.
- Pour la détection de fluorescence, l'utilisation d'excitation appropriée et des filtres de détection de la GFP ou YFP. Il est important d'inclure des contrôles négatifs, comme les morceaux d'oignon tourné avec un plasmide non fluorescent. Faint signaux jaune peut apparaître à partir des cellules blessés, des bulles d'air, ou de débris. Il est également important d'inclure des contrôles positifs. Un plasmide contenant journaliste exprimée de façon constitutive fluorescents tels que 35S:: GFP est un excellent contrôle positif. Signaux GFP visibles à partir des cellules épidermiques d'oignon (figure 1A, D) a indiqué que les cartouches, les tissus d'oignon, et le tir au canon de gènes sont bien préparés et exécutés. Par la suite, nous avons observé les interactions entre SEU-pSPYNE et LUH-pSPYCE en morceaux l'oignon bombardés avec des cartouches contenant un mélange de 35S:: SEU-pSPYNE et 35S:: LUH-pSPYCE ADN. Faint fluorescence YFP a été observée dans le noyau uniquement (figure 1 B, E), indiquant l'interaction physique directe entre SEU et LUH qui a amené les fragments YFP diviser ensemble dans le noyau. Notez que le signal de la YFP BiFC est significativement plus faible que le signal GFP du 35S:: GFP.
Les résultats représentatifs
Dans notre étude rapportée ici, le 35S:: contrôle positif GFP plasmide dégage une forte fluorescence qui remplit toute la cellule, y compris à la fois le noyau et le cytoplasme (figure 1A, D). Protéine GFP est assez petit pour se diffuser dans le noyau sans un signal de localisation nucléaire. En revanche, SEU et LUH sont deux facteurs de transcription chez Arabidopsis déjà montré à interagir dans un double-hybride en levure de test 2. Seu-pSPYNE (SEU fusionné au fragment N-terminal de la YFP) et LUH-pSPYCE (SEU fusionné au fragment N-terminal de la YFP), à la fois trop grand pour diffuser dans le noyau, contenant des signaux de localisation nucléaire de 2,5. Le signal de fluorescence détecté YFP dans le noyau de la cellule d'oignon (figure 1 B, E) indique que SEU-pSPYNE et LUH-pSPYCE peuvent interagir dans les noyaux d'oignon. Aucun signal fluorescent est détecté dans les oignons bombardés avec un mélange plasmide de pSPYNE vecteur plasmidique contenant le fragment N-terminal de la YFP et Luh-pSPYCE (figure 1C, F).
La fluorescence BiFC médiée YFP est significativement plus faible que la fluorescence de la GFP-médiatisée de la 35S:: GFP plasmide. Dans notre étude, ils ont également montré différentes localisation subcellulaire (comparer avec la figure 1A B). De plus, le nombre de cellules fluorescentes est significativement plus faible pour BiFC, comme BiFC ne fonctionne que lorsque les deux plasmides partenaires réussir à entrer et sont exprimés dans les cellules d'oignon mêmes.
Figure 1. Fluorescent (A, B, C) et le champ lumineux (D, E, F) des images de cellules d'oignon bombardés avec différentes constructions plasmidiques. (A) et (D), des cellules d'oignon bombardés par 35S:: GFP. GFP se diffuse à travers le cytoplasme et le noyau. (B) et (E), des cellules d'oignon bombardés par l'égalité de mélange molaire de 35S:: SEU-pSPYNE (SEU fusionné au fragment N-terminal de la YFP) et 35S:: LUH-pSPYCE (LUH fusionné au fragment C-terminal ) d'ADN plasmidique. Une interaction entre SEU-pSPYNE et LUH-pSPYCE est représenté par un noyau fluorescent. (C) et (F), un contrôle négatif montrant des cellules d'oignon bombardés avec des mélanges de vecteur pUC19-SPYNE et LUH-pSPYCE plasmiDS. Aucun signal fluorescent est détecté.
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Discussion
- Pour les utilisateurs de première fois, nous vous recommandons de pratiquer toute la procédure, de la préparation Cartouche d'observation, avec un seul reporter constitutive plasmide tel que 35S:: GFP ou 35S:: GUS. Nous avons utilisé un 35S:: plasmide GFP obtenu de MM. Steve Mount et Zhang Xiaoning 6 (figure 1A, D). Les cartouches gène tiré de contrôle vendus à RioRad (Cat 165-2244) ne sont pas appropriées pour les plantes.
- Pour BiFC, un deuxième contrôle positif est nécessaire, ce qui devrait se composent de deux partenaires d'interaction connue fusionnés à des fragments C-terminale et N-terminale de la YFP, respectivement.
- Pour BiFC, il est nécessaire d'inclure plusieurs contrôles négatifs: (1) X protéine fusionnée au fragment N-terminal de la YFP plus un vecteur codant pour le fragment C-terminal, (2) Y protéine fusionnée au fragment C-terminal de YFP plus un vecteur codant pour le fragment N-terminal (3); seul vecteur.
- Un écran de diffusion peuvent être utilisés sur la base du baril Helios Gene Gun lors du tir du coup de feu, qui sert à réduire les dommages tissulaires. Dans notre étude, nous n'avons pas utilisé l'écran de diffusion.
- Pendant la microscopie par fluorescence des YFP médiée par BiFC, temps d'exposition à la lumière d'excitation doit être minimisée pour réduire photoblanchiment.
- Cartouches stockés dans des flacons à scintillation contenant déshydratants sont bonnes pour plusieurs mois.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions les Drs. Steve Mount et Zhang Xiaoning pour le 35S:: GFP pGlowbug construire et l'Hokensen Bourse de doctorat au CH de recherche dans le laboratoire de Z. L's est soutenue par le US National Science Foundation (IOB0616096 et MCB0744752). ZL est partiellement pris en charge par l'Université du Maryland de la station expérimentale agricole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yellow onion | Any Supplier | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
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