Summary
Este artículo muestra cómo utilizar correctamente el BioRad Helios pistola de genes para introducir ADN plásmido en las células epidérmicas de cebolla y la forma de prueba para las interacciones proteína-proteína en las células de la cebolla basa en el principio de fluorescencia de Complementación bimolecular (BiFC)
Abstract
Investigación de la función de genes en diversos organismos se basa en el conocimiento de cómo los productos de los genes interactúan unos con otros en su ambiente celular normal. La complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) Ensayo
Protocol
I. plásmido preparación
El ADN plásmido utilizado para el bombardeo debe ser de gran pureza y una concentración de 500ng/μl o mayor. Para BiFC que participan dos construcciones de plásmidos, 25 mg de cada plásmido se necesita. En otras palabras, una relación de 1:1 molar de los dos plásmidos se mezclan para dar lugar a 50 ug de plásmido ADN total de la preparación de los cartuchos. Tenga en cuenta que la adición de más de 50 mg de ADN puede causar la aglomeración de las partículas de oro y deben ser evitados. Kits comerciales de extracción de ADN plásmido se recomiendan para el aislamiento de ADN de plásmido.
Vectores del plásmido debe ser relativamente pequeño en tamaño, tales como pUC19. Hemos clonado SEU y LUH cDNA en pUC19 y pUC19-Spyne SPYCE, respectivamente 3. Vectores binarios para la transformación mediada por Agrobacterium son demasiado grandes e inadecuado para el bombardeo.
II. Cartucho de preparación
Preparación del cartucho consiste en partículas de recubrimiento de oro con el ADN del plásmido y colocarlos en un tubo de plástico que posteriormente se corta en trozos media pulgada de largo, que se pueden cargar en los titulares de cartucho de pistola de genes. Preparación del cartucho se describe en gran detalle en un artículo separado Jove 4 y por lo tanto no se describe aquí. Para el bombardeo de las células de la cebolla, se recomienda mezclar 50 g de ADN plásmido con 12,5 mg de partículas de oro por la preparación, que produce alrededor de un 50 cartuchos a 1 g de oro DNA/0.25 mg / cartucho. Cada cartucho es de un solo disparo. Las partículas de oro pueden ser 0,6 m ó 1,0 m de diámetro (Cat # 1652262 # 1652263 o gato, BioRad). También recomendamos el uso de 0,5 mg / ml de solución de PVP para la preparación del cartucho. Para BiFC, combine los dos ADN plásmido de cada socio que interactúan putativo en la preparación de un mismo cartucho.
Después de la preparación del cartucho, es importante para poner a prueba los cartuchos por el disparo de los cartuchos nuevos hechos a una presión de helio de 150 a 200 psi en un Parafilm cuadrados que se envuelve alrededor de una placa de Petri. Esto pondrá a prueba si las partículas de oro pueden ser impulsados de manera eficiente de los cartuchos, usted debe ver las partículas de oro débil en el Parafilm. Esto le da una idea del área que cubrirá cada disparo. Usted puede notar diferentes cantidades de partículas de oro impulsó a la Parafilm a diferentes presiones de helio (en el rango de 150 a 200 psi). Si no hay una diferencia significativa, elegir el de menor presión para el bombardeo.
III. La preparación de los tejidos de cebolla
En el día de rodaje, despegue la piel exterior de una cebolla amarilla grande. Usando una hoja de afeitar limpias y afiladas, corte 4-5 capas profundas de un área rectangular de aproximadamente 2 x 8 cm. Sacar el tejido rectangular cebolla, deseche el exterior dos capas, corte el resto de las capas de la cebolla en trozos de 2x1.5 cm. Coloque los trozos de cebolla en una placa de Petri con papel filtro (papel Whatman 3MM cortado en círculos) humedecido con agua estéril. Cubrir la placa de Petri y que están dispuestos a ir.
IV. Bombardeo
- La carga de los cartuchos en los soportes del cartucho redondo blanco. Cartuchos que contienen diferentes construcciones de plásmidos se deben cargar en los titulares de cartucho diferente. Cada titular de cartucho puede almacenar hasta 12 cartuchos de 12 tiros.
- Inserte la batería y el revestimiento de barril fresca en la pistola de genes Helios. Asegúrese de que tanto el revestimiento de barril y el arma han respectivas juntas tóricas adjunto.
- En primer lugar, insertar un soporte para el cartucho vacío en la pistola de genes, con la marca # 12 en el soporte del cartucho hacia la parte superior de la pistola. Titular de avance cartucho de una o dos veces para asegurarse de que está correctamente colocada.
- Adjuntar pistola en el tanque de helio y ajustar la presión de 150 a 200 psi.
- Use protección para los oídos y un arma de fuego un par de veces con el soporte del cartucho vacío para limpiar la cámara de la pistola y para asegurarse de que la presión es estable.
- Retire el soporte del cartucho vacío e insertar un soporte para el cartucho cargado. Avanzar en el soporte del cartucho para que el cartucho que desea el fuego se coloca en el fondo (6:00) del soporte del cartucho. Disparar a un pedazo de cebolla aquí proporciona una forma de control negativo para la fluorescencia de fondo.
- Coloque pedazos de la cebolla en el centro de un plato vacío de Petri con la capa más interna de la cebolla hacia arriba. Resto de línea de la pistola de genes de barril en una placa de Petri y disparar el arma pulsando el botón lateral, mientras que apretar el gatillo. La transferencia de la cebolla bombardeados con una placa de Petri que contiene el papel de filtro húmedo 3MM.
- Avanzar a la siguiente cartucho y fuego un pedazo de cebolla diferentes. Repita este paso hasta cuatro a cinco piezas de la cebolla se disparó. Cada pieza de cebolla se disparó una sola vez.
- Cambiar al titular de un cartucho cargado con diferentes cartuchos que contienen una combinación diferente plásmido plásmido o diferentes. Recuerde que para cambiar el revestimiento barrils bien para prevenir la contaminación. Dispara cuatro hasta cinco trozos de cebolla.
- Después del bombardeo, devolver todas las cebollas a los platos de Perti. Cubrir las placas con las tapas. Envuelva con Parafilm para evitar la desecación. Incubar los trozos de cebolla a temperatura ambiente en la oscuridad durante 16-48 horas.
- Apague la presión del gas y la liberación antes de desmontar la pistola de genes desde el tanque de helio. Desenroscar el barril de línea, y quitar el soporte del cartucho y los cartuchos usados (o no).
- Limpieza de cartucheras y fundas barril sumergiéndolas en un vaso con agua y jabón. Colocar el vaso en un baño de ultrasonido y sonicar durante 20 minutos. Después, enjuague con agua para eliminar todos los residuos de jabón. Ponga en remojo en el 70% de etanol durante una hora y luego séquelas con toallas de papel.
V. Observación
- Después de la incubación bombardeado trozos de cebolla durante 16-20 horas a temperatura ambiente, se puede observar las buenas prácticas agrarias o de fluorescencia YFP utilizando un microscopio de fluorescencia, como el Observer.z1 Zeiss Axio utilizados en este estudio.
- El uso de fórceps con los extremos planos que poco a poco la cáscara de una capa única célula de la epidermis interna de la cebolla (la capa que está directamente enfrente de la pistola durante el bombardeo). Colocar la cáscara en una gota de agua sobre un portaobjetos. Añadir cubreobjetos pero tenga cuidado para minimizar las burbujas.
- En campo claro del microscopio, en primer lugar comprobar corriente citoplasmática para asegurarse de que las células están vivas. Para ello, exponen en la diapositiva a la luz brillante campo durante unos minutos para calentar el tejido de la cebolla y luego buscar plástidos en movimiento. Corriente citoplasmática no siempre es fácil de ver, así que no se desanime si no puede ver.
- Para la detección de fluorescencia, excitación uso apropiado y filtros de detección de buenas prácticas agrarias o YFP. Es importante incluir controles negativos, tales como trozos de cebolla disparó con un plásmido que no fluorescente. Débiles señales amarillas pueden aparecer a partir de células heridos, las burbujas de aire, o los escombros. También es importante incluir controles positivos. Un plásmido que contiene el reportero expresa constitutivamente fluorescentes, como 35S:: GFP es un excelente control positivo. Señales visibles las buenas prácticas agrarias de las células epidérmicas de cebolla (Figura 1 A, D) indicó que los cartuchos, los tejidos de cebolla, y el despido pistola de genes están debidamente preparados y ejecutados. Posteriormente, se observaron interacciones entre SEU-pSPYNE y LUH pSPYCE en trozos de cebolla bombardeados con cartuchos que contienen una mezcla de 35S:: SEU-pSPYNE y 35S:: LUH-pSPYCE AND. Débil fluorescencia YFP se observó en el único núcleo (Figura 1 B, E), lo que indica la interacción física directa entre SEU y LUH que llevó a los fragmentos de YFP dividir juntos en el núcleo. Tenga en cuenta que la señal de YFP BiFC es significativamente más débil que la señal de las buenas prácticas agrarias del 35S:: GFP.
Resultados representante
En nuestro presente estudio, el 35S:: control de plásmido GFP emite fluorescencia positiva fuerte que llena toda la celda, incluyendo el núcleo y el citoplasma (Figura 1 A, D). La proteína GFP es lo suficientemente pequeño como para difundir en el núcleo, sin una señal de localización nuclear. Por el contrario, SEU y LUH son dos factores de transcripción Arabidopsis demostrado previamente para participar en una levadura de dos híbridos de ensayo 2. SEU-pSPYNE (SEU fusionado con el fragmento N-terminal de YFP) y LUH-pSPYCE (SEU fusionado con el fragmento N-terminal de YFP), a la vez demasiado grande para difundir en el núcleo, contienen señales de localización nuclear 2,5. La señal fluorescente YFP detectados en el núcleo de la célula de cebolla (Figura 1 B, E) indica que el SEU-pSPYNE y LUH pSPYCE-pueden interactuar en los núcleos de cebolla. No hay señal de fluorescencia se detecta en las cebollas bombardeados con la mezcla de plásmidos de pSPYNE vector plásmido que contenía el fragmento N-terminal de YFP y LUH-pSPYCE (Figura 1 C, F).
La fluorescencia BiFC mediada YFP es significativamente más débil que la fluorescencia de GFP-mediado desde el 35S:: GFP plásmido. En nuestro estudio, también mostraron la localización subcelular diferente (comparar Figura 1 A con B). Además, el número de células fluorescentes es significativamente menor para BiFC, como BiFC sólo funciona cuando ambos plásmidos asociados con éxito entrar y se expresan en las células de la cebolla mismo.
Figura 1. Fluorescente (A, B, C) y de campo claro (D, E, F) las imágenes de las células de cebolla bombardeados con diferentes construcciones de plásmidos. (A) y (D), las células de cebolla bombardeados con 35S:: GFP. GFP se difunde en todo el citoplasma y núcleo. (B) y (E), las células de cebolla bombardeados con la misma mezcla molar del 35S:: SEU-pSPYNE (SEU fusionado con el fragmento N-terminal de YFP) y 35S:: LUH-pSPYCE (LUH fusionados al fragmento C-terminal ) del ADN del plásmido. Una interacción entre el SEU-pSPYNE y LUH pSPYCE-se muestra por un núcleo fluorescente. (C) y (F), un control negativo que muestra las células de cebolla bombardeados con mezclas de vector pUC19-Spyne y plasmi LUH-pSPYCEds. No se detecta la señal fluorescente.
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Discussion
- Para los usuarios de primera vez, se recomienda la práctica de todo el procedimiento, desde la preparación del cartucho a la observación, con un único plásmido reportero constitutiva como 35S:: GFP o 35S:: GUS. Se utilizó un 35S:: GFP plásmido obtenido de los Dres. Steve Monte y Zhang Xiaoning 6 (Figura 1 A, D). Los cartuchos de inyección de genes de control en la venta RioRad (Cat. 165-2244) no son adecuados para las plantas.
- Para BiFC, un control positivo es necesario, que debe constar de dos socios conocidos que interactúan fundido a la C-terminal y N-terminal de fragmentos de YFP, respectivamente.
- Para BiFC, es necesario incluir varios controles negativos: (1) X proteína de fusión con el fragmento N-terminal de YFP además de un vector que codifica para el fragmento C-terminal, (2) Y proteína de fusión con el fragmento C-terminal de YFP además de un vector que codifica para el fragmento N-terminal, (3) único vector.
- Una pantalla de difusión se puede utilizar en la base del cañón de genes Helios arma al disparar el tiro, que sirve para reducir el daño tisular. En nuestro estudio, no hizo uso de la pantalla de difusión.
- Durante la observación microscópica de YFP fluorescencia mediada por BiFC, tiempo de exposición a la luz de excitación debe ser minimizado para reducir la foto de blanqueo.
- Cartuchos almacenados en los viales de centelleo que contiene desecantes se conserva durante varios meses.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a los Dres. Steve Monte y Zhang Xiaoning para el 35S:: GFP pGlowbug la construcción y la Comunidad Hokensen Doctorado de Investigación en el laboratorio de CH Z. L's es apoyado por los EE.UU. National Science Foundation (IOB0616096 y MCB0744752). ZL es parcialmente financiado por la Universidad de Maryland Estación Experimental Agrícola.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yellow onion | Any Supplier | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
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