Summary
यह आलेख दिखाता है कि कैसे ठीक से इस्तेमाल करने के लिए BioRad जीन गन Helios प्याज epidermal कोशिकाओं में प्लास्मिड डीएनए परिचय और प्याज कोशिकाओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत bimolecular प्रतिदीप्ति complementation के सिद्धांत (BiFC) पर आधारित के लिए परीक्षण
Abstract
विविध जीवों में जीन समारोह की जांच कैसे जीन उत्पादों अपने सामान्य सेलुलर वातावरण में एक दूसरे के साथ बातचीत के ज्ञान पर निर्भर करता है. Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation परख (BiFC)
Protocol
I. प्लाज्मिड तैयारी
प्लाज्मिड बमबारी के लिए इस्तेमाल किया डीएनए उच्च शुद्धता और 500ng/μl या अधिक से अधिक के एकाग्रता में किया जाना चाहिए. BiFC दो प्लाज्मिड constructs शामिल करने के लिए, प्रत्येक प्लाज्मिड के 25 μg की जरूरत है. दूसरे शब्दों में, 1:01 दाढ़ अनुपात दो plasmids के कारतूस की तैयारी के लिए 50 μg कुल प्लास्मिड डीएनए को जन्म दे मिलाया जाना चाहिए. ध्यान में रखना होगा कि 50 μg से अधिक डीएनए जोड़ने सोने के कणों के ढेर के कारण और बचा जाना चाहिए सकता है. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लाज्मिड डीएनए निष्कर्षण किट प्लाज्मिड DNAs को अलग करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं.
प्लाज्मिड वैक्टर अपेक्षाकृत छोटे pUC19 जैसे आकार में होना चाहिए. हम एस ई यू और LUH pUC19 SPYNE और pUC19 SPYCE, 3 क्रमशः में सीडीएनए क्लोन. Agrobacterium की मध्यस्थता परिवर्तन के लिए बाइनरी वैक्टर बहुत बड़ी है और बमबारी के लिए अनुपयुक्त हैं.
द्वितीय. कारतूस तैयारी
कारतूस तैयारी कोटिंग प्लाज्मिड डीएनए और उन्हें प्लास्टिक टयूबिंग है कि बाद में आधा इंच लंबे टुकड़े, जो जीन बंदूक कारतूस धारकों में लोड किया जा सकता है है में कटौती है में लोड के साथ सोने के कणों शामिल है. कारतूस तैयारी एक अलग जौव 4 लेख में महान विवरण में वर्णित है और इस तरह यहाँ वर्णित नहीं है . प्याज कोशिकाओं की बमबारी के लिए, हम तैयारी सोना प्रति कण, जो के बारे में पैदावार 1 μg DNA/0.25 मिलीग्राम सोने / कारतूस पर 50 कारतूस के 12.5 मिलीग्राम के साथ प्लास्मिड डीएनए के 50 μg मिश्रण करने की सलाह देते हैं. प्रत्येक कारतूस एक शॉट के लिए है. सोने के कणों या तो 0.6 सुक्ष्ममापी या व्यास में 1.0 सुक्ष्ममापी (; Biorad बिल्ली # 1652262 या 1652263 # कैट) किया जा सकता है. हम भी कारतूस तैयार करने के लिए 0.5 मिलीग्राम / एमएल PVP समाधान का उपयोग करने की सलाह देते हैं. BiFC के लिए, समान कारतूस तैयारी में प्रत्येक ख्यात बातचीत साथी के दो प्लाज्मिड DNAs गठबंधन.
कारतूस की तैयारी के बाद, यह महत्वपूर्ण है एक वर्ग Parafilm है कि एक पेट्री डिश के चारों ओर लपेटा जाता है में 150 से 200 साई के बीच एक हीलियम दबाव में नव बनाया कारतूस फायरिंग से कारतूस परीक्षण है. यह अगर सोने के कणों कारतूस से कुशलता स्वचालित कर सकते हैं परीक्षण करेंगे, आप Parafilm पर बेहोश सोने के कणों को देखना चाहिए. आप इस क्षेत्र है कि हर शॉट को कवर किया जाएगा के एक विचार देता है. आप अलग हीलियम दबाव (150-200 साई रेंज में) पर Parafilm पर स्वचालित सोने के कणों के विभिन्न मात्रा में नोटिस सकता है. अगर कोई महत्वपूर्ण अंतर है, बमबारी के लिए कम दबाव का चयन करें.
III. तैयारी प्याज ऊतकों
शूटिंग के दिन, एक बड़े पीले प्याज से बाहरी त्वचा से छील. एक स्वच्छ और तेज धार का प्रयोग, 4-5 परतों गहरी के बारे में 2 X 8 सेमी का एक आयताकार क्षेत्र में कटौती. आयताकार प्याज ऊतक लो, बाहरी दो परतों त्यागें, के बारे में 2X1.5 सेमी टुकड़ों में प्याज की शेष परतों में कटौती. फिल्टर पेपर (वाटमान 3mm कागज के हलकों में कटौती) युक्त एक पेट्री डिश में प्याज के टुकड़े प्लेस बाँझ पानी के साथ सिक्त. पेट्री डिश कवर और वे जाने के लिए तैयार हैं.
चतुर्थ. गोलाबाज़ी
- सफेद दौर कारतूस धारकों में कारतूस लोड. अलग प्लाज्मिड constructs युक्त कारतूस विभिन्न कारतूस धारकों में लोड किया जाना चाहिए. प्रत्येक कारतूस धारक को 12 शॉट के लिए 12 कारतूस पकड़ कर सकते हैं.
- जीन Helios गन में बैटरी और ताजा बैरल लाइनर डालें. सुनिश्चित करें कि दोनों बैरल लाइनर और बंदूक संलग्न O-छल्ले संबंधित है.
- सबसे पहले, जीन बंदूक में कारतूस धारक बंदूक के ऊपर का सामना करना पड़ पर # 12 निशान के साथ एक खाली कारतूस धारक, सम्मिलित है. एडवांस कारतूस धारक एक या दो बार बनाने के लिए यकीन है कि इसे सही ढंग से डाला जाता है.
- संलग्न हीलियम टैंक बंदूक और 150 से 200 साई के बीच के दबाव को समायोजित.
- कान संरक्षण और आग बंदूक खाली कारतूस धारक के साथ एक बार कुछ पहनें के लिए बंदूक के कक्ष को साफ और लगता है कि दबाव स्थिर है.
- खाली कारतूस धारक निकालें और एक भरी हुई कारतूस धारक सम्मिलित. कारतूस धारक है ताकि आप आग चाहते कारतूस के तल पर तैनात है कारतूस धारक (6 बजे) अग्रिम. प्याज का एक टुकड़ा यहाँ शूटिंग पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए नकारात्मक नियंत्रण के एक फार्म प्रदान करता है.
- सामना करना पड़ रहा प्याज की सबसे भीतरी परत के साथ एक खाली पेट्री डिश के बीच में प्याज के टुकड़े रखें. जीन बंदूक पेट्री डिश पर बैरल लाइनर रखें और नीचे की ओर बटन पकड़ जबकि ट्रिगर खींच द्वारा बंदूक आग. एक पेट्री नम 3mm फिल्टर पेपर युक्त पकवान बमबारी प्याज स्थानांतरण.
- अगले कारतूस के लिए अग्रिम और एक अलग प्याज टुकड़ा आग. इस चरण को दोहराएँ जब तक प्याज के चार से पांच टुकड़ों को गोली मार दी हैं. प्रत्येक प्याज टुकड़ा एक बार गोली मार दी है.
- एक अलग कारतूस धारक एक अलग प्लाज्मिड या अलग प्लाज्मिड संयोजन से युक्त कारतूस के साथ लोड करने के लिए बदलें. बैरल लाइनर परिवर्तन एक याद रखेंअच्छी तरह से प्रदूषण को रोकने. चार से पांच प्याज टुकड़े मारो.
- बमबारी के बाद, perti बर्तन को सभी प्याज वापसी. Lids के साथ पेट्री डिश को कवर. उन्हें Parafilm साथ लपेटें करने के लिए सुखाने को रोकने. 16-48 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर प्याज के टुकड़े को सेते हैं.
- हीलियम टैंक से जीन बंदूक detaching से पहले गैस और रिलीज के दबाव मुड़ें. खोल देना बैरल लाइनर और कारतूस धारक और इस्तेमाल किया है (या अप्रयुक्त) कारतूस को हटाने.
- उन्हें साबुन पानी के साथ एक बीकर में submerging द्वारा सफाई कारतूस धारकों और बैरल liners. एक स्नान sonicator में बीकर प्लेस और 20 मिनट के लिए sonicate. बाद में, उन्हें पानी से कुल्ला सभी साबुन अवशेषों को हटाने. उन्हें 70% इथेनॉल में एक घंटे के लिए भिगोएँ और फिर उन्हें कागज तौलिए पर सूखी.
वी. अवलोकन
- कमरे के तापमान पर 16-20 घंटे के लिए बमबारी प्याज टुकड़े incubating के बाद, हम GFP या YFP प्रतिदीप्ति निरीक्षण इस अध्ययन में इस्तेमाल जैसे Zeiss Axio Observer.z1 एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर सकते हैं.
- प्याज के भीतर epidermis (परत है कि सीधे बमबारी के दौरान बंदूक चेहरे) बंद एक एकल कोशिका परत छील करने के लिए धीरे धीरे फ्लैट के साथ समाप्त होता है संदंश का प्रयोग करें. किसी स्लाइड पर पानी की एक बूंद पर छील रखें. Coverslip जोड़ें लेकिन बुलबुले को कम करने के लिए सावधान रहना.
- माइक्रोस्कोप के उज्ज्वल क्षेत्र के तहत, cytoplasmic स्ट्रीमिंग के लिए पहले की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को जीवित कर रहे हैं. ऐसा करने के लिए, कुछ मिनट के लिए प्रकाश उज्ज्वल क्षेत्र के लिए स्लाइड बेनकाब प्याज ऊतक को गर्म और तब चलती प्लास्टिड के लिए देखो. Cytoplasmic स्ट्रीमिंग हमेशा आसान नहीं है देखने के लिए, तो निराश मत हो अगर आप किसी भी नहीं देख सकते हैं.
- प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए, उचित उत्तेजना और GFP या YFP के लिए पता लगाने फिल्टर का उपयोग करें. यह प्याज टुकड़े एक गैर फ्लोरोसेंट प्लाज्मिड के साथ शॉट के रूप में नकारात्मक नियंत्रण को शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है. बेहोश पीला संकेत घायल कोशिकाओं, हवा बुलबुले, या मलबे से प्रकट हो सकता है. यह भी महत्वपूर्ण सकारात्मक नियंत्रण शामिल है. एक प्लाज्मिड युक्त constitutively व्यक्त 35S जैसे फ्लोरोसेंट संवाददाता: GFP एक उत्कृष्ट सकारात्मक नियंत्रण है. प्याज epidermal कोशिकाओं (चित्रा 1 ए, डी) से दर्शनीय GFP संकेतों ने संकेत दिया है कि कारतूस, प्याज ऊतकों, और जीन बंदूक फायरिंग ठीक से तैयार हैं निष्पादित. एस ई यू - pSPYNE और 35S:: LUH - pSPYCE DNAs बाद में, हम प्याज टुकड़े 35S का एक मिश्रण युक्त कारतूस के साथ बमबारी में एस ई यू pSPYNE और LUH - pSPYCE के बीच बातचीत मनाया. बेहोश YFP प्रतिदीप्ति केवल नाभिक में मनाया गया (चित्रा 1 बी ई), एस ई यू और LUH के बीच प्रत्यक्ष शारीरिक संपर्क कि विभाजन YFP टुकड़े नाभिक में एक साथ लाया का संकेत है. ध्यान दें कि BiFC से YFP संकेत काफी 35S से GFP संकेत की तुलना में कमजोर है: GFP.
प्रतिनिधि परिणाम
यहाँ हमारे अध्ययन में, 35S रिपोर्ट: GFP सकारात्मक प्लाज्मिड नियंत्रण बंद मजबूत प्रतिदीप्ति है कि दोनों नाभिक और cytoplasm (चित्रा 1 ए, डी) सहित पूरे सेल, भरता देता है. GFP प्रोटीन काफी छोटे परमाणु स्थानीयकरण संकेत के बिना नाभिक में फैलाना है. इसके विपरीत, एस ई यू और LUH दो Arabidopsis transcriptional पहले एक दो संकर 2 परख खमीर में बातचीत करने के लिए दिखाया कारकों कर रहे हैं. एस ई यू - pSPYNE (एस ई यू एन टर्मिनल YFP का टुकड़ा करने के लिए इनकार) और LUH pSPYCE (एस ई यू एन टर्मिनल YFP का टुकड़ा करने के लिए इनकार), दोनों भी नाभिक में फैलाना, परमाणु स्थानीयकरण संकेतों शामिल 2,5 बड़े. YFP फ्लोरोसेंट प्याज सेल नाभिक (चित्रा 1 बी ई) में पाया संकेत इंगित करता है कि एस ई यू pSPYNE और LUH - pSPYCE प्याज नाभिक में बातचीत कर सकते हैं. कोई फ्लोरोसेंट संकेत वेक्टर प्लाज्मिड YFP और LUH pSPYCE (चित्रा 1C, एफ) के एन टर्मिनल टुकड़ा युक्त pSPYNE के प्लाज्मिड मिश्रण के साथ बमबारी प्याज में पता चला है.
BiFC की मध्यस्थता YFP प्रतिदीप्ति GFP 35S से प्रतिदीप्ति की मध्यस्थता से काफी कमजोर है: GFP प्लाज्मिड. हमारे अध्ययन में, वे भी अलग subcellular स्थानीयकरण दिखाया (चित्रा 1A तुलना बी के साथ). इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या काफी BiFC लिए कम है, के रूप में BiFC केवल काम करता है जब दोनों साथी plasmids सफलतापूर्वक दर्ज करें और ही प्याज की कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं.
चित्रा 1. प्रतिदीप्त (ए, बी, सी) और चमकीले क्षेत्र (डी, ई, एफ) प्याज कोशिकाओं की छवियों को अलग प्लाज्मिड constructs के साथ बमबारी. (ए) और (डी), प्याज कोशिकाओं 35S के साथ बमबारी: GFP. GFP cytoplasm और नाभिक के बाहर के माध्यम से diffuses. (बी) और (ई), प्याज कोशिकाओं 35S के बराबर दाढ़ घोला जा सकता है के साथ बमबारी: एस ई यू - pSPYNE (एस ई यू एन टर्मिनल YFP का टुकड़ा करने के लिए इनकार) और 35S: LUH pSPYCE (LUH सी - टर्मिनल टुकड़ा करने के लिए इनकार ) डीएनए प्लाज्मिड. एस ई यू pSPYNE और LUH - pSPYCE के बीच बातचीत एक फ्लोरोसेंट नाभिक द्वारा दिखाया गया है. (सी) और (एफ), एक नकारात्मक नियंत्रण प्याज कोशिकाओं दिखा वेक्टर pUC19 SPYNE और LUH pSPYCE plasmi के घोला जा सकता है के साथ बमबारीडी एस. कोई फ्लोरोसेंट संकेत का पता चला है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
- पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए, हम पूरी प्रक्रिया का अभ्यास करने की सलाह देते हैं, एक एकल 35S जैसे प्लाज्मिड विधान संवाददाता के साथ कारतूस तैयारी से अवलोकन करने के लिए: GFP या 35S: गस. हम एक 35S इस्तेमाल किया: प्लाज्मिड GFP डीआरएस से प्राप्त. स्टीव माउंट और Xiaoning जांग 6 (चित्रा 1 ए, डी). जीन शॉट नियंत्रण RioRad (165-2244 कैट) में बेचा कारतूस संयंत्रों के लिए उपयुक्त नहीं हैं.
- BiFC के लिए, एक दूसरे सकारात्मक नियंत्रण आवश्यक है, जो दो ज्ञात बातचीत YFP के सी - टर्मिनल और एन टर्मिनल टुकड़े के लिए जुड़े हुए भागीदारों, क्रमशः से मिलकर चाहिए.
- BiFC के लिए, यह आवश्यक है कई नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं: (1) प्रोटीन एक्स YFP का टुकड़ा एन टर्मिनल प्लस एक वेक्टर सी - टर्मिनल टुकड़ा के लिए कोडिंग के लिए जुड़े हुए, (2) प्रोटीन वाई सी टर्मिनल का टुकड़ा इनकार YFP प्लस एक वेक्टर एन टर्मिनल टुकड़ा के लिए कोडिंग, (3) केवल सदिश.
- एक प्रसार स्क्रीन जीन Helios गन बैरल के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है जब गोली मार दी, जो ऊतकों को नुकसान को कम करने में कार्य करता है फायरिंग. हमारे अध्ययन में, हम प्रसार स्क्रीन का उपयोग नहीं किया.
- YFP प्रतिदीप्ति सूक्ष्म देखने BiFC द्वारा मध्यस्थता है, उत्तेजना प्रकाश के लिए जोखिम समय के दौरान विरंजन फोटो को कम करने के लिए कम से कम किया जाना चाहिए.
- जगमगाहट desiccants युक्त शीशियों में संग्रहीत कारतूस कई महीनों के लिए अच्छे हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम डीआरएस धन्यवाद. स्टीव माउंट और Xiaoning झांग 35S के लिए: GFP pGlowbug निर्माण और जेड एस ल प्रयोगशाला में Hokensen दर्पण अनुसंधान डॉक्टरेट फैलोशिप अमेरिका के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IOB0616096 और MCB0744752) द्वारा समर्थित है. ZL आंशिक रूप से मैरीलैंड कृषि प्रयोग स्टेशन के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yellow onion | Any Supplier | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
