Summary
Bu makale BioRad düzgün soğan epidermal hücrelerin içine plazmid DNA tanıtmak için Helios Gen Tabancası ve nasıl Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) ilkesine dayalı soğan hücreleri protein-protein etkileşimleri test etmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir
Abstract
Çeşitli organizmaların gen fonksiyonu incelenmesi gen ürünleri, normal hücresel bir ortamda birbirleri ile nasıl etkileşimde bilgisine dayanmaktadır. Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi
Protocol
I. Plazmid hazırlık
Bombardıman için kullanılan plazmid DNA 500ng/μl veya daha büyük bir konsantrasyon ve yüksek saflıkta olmalıdır. BiFC iki plazmid yapıları içeren, her plazmid 25 mg gereklidir. Diğer bir deyişle, iki plazmid 1:1 molar oranda kartuşlarının hazırlanması için 50 mg toplam plazmid DNA doğuran karıştırılmalıdır. 50 mg daha fazla DNA ekleyerek altın parçacıkları yığılma neden olabilir ve kaçınılmalıdır dikkatli olun. Ticari olarak mevcut plazmid DNA ekstraksiyon kitleri plazmid DNA'ları izole etmek için tavsiye edilir.
Plazmid vektörler bu pUC19 olarak boyutu oldukça küçük olmalıdır. Biz SEU ve LUH cDNA içine sırasıyla 3 pUC19 SPYNE ve pUC19 SPYCE, klonlanmış. İkili vektörler Agrobacterium dönüşüm için çok büyük ve bombardıman için uygunsuz.
II. Kartuş hazırlık
Kartuş hazırlık plazmid DNA ve daha sonra gen tabancası kartuşu sahipleri yüklenebilir yarım inç uzun parçalar halinde kesilmiş plastik boru içine yükleme kaplama altın parçacıkları içerir. Kartuş hazırlanması ayrı bir Jüpiter 4. maddesi çok detaylı olarak açıklanan ve bu yüzden burada açıklanan olmasıdır . Soğan hücreleri bombardıman için, biz, 12.5 mg ile 1 mg DNA/0.25 mg altın / kartuş 50 kartuşları hakkında verimleri hazırlık başına altın parçacıkları, plazmid DNA 50 mg karıştırma önerilir. Her kartuş, bir çekim için. Altın parçacıkları çapı 0.6 mm veya 1.0 mikron (Biorad Kedi # 1.652.262 ya da Cat # 1.652.263) ya olabilir. Ayrıca kartuş hazırlanması için 0.5 mg / ml PVP çözüm kullanmanızı öneririz. BiFC için, olası etkileşim ortağı aynı kartuş hazırlanmasında her iki plazmid DNA'lar birleştirir.
Kartuş hazırlanmasından sonra, bir Petri kabı sarılı bir kare Parafilm içine helyum basınç altında, 150 ila 200 psi arasında yeni yapılan kartuşları ateş kartuşları test etmek için önemlidir. Altın parçacıkları kartuşları verimli hareketli olabilir, bu test edecek; Parafilm soluk altın parçacıkları görmelisiniz. Bu alanın her çekimde kapsayacak bir fikir verir. Farklı helyum basıncı (150-200 psi aralığında) Parafilm üzerine yürür altın parçacıkları farklı miktarlarda fark edebilirsiniz. Anlamlı bir fark varsa, bombardıman için düşük basınç seçin.
III. Soğan dokuların hazırlanması
Çekim gününde, büyük bir sarı soğan dış deri soyulabilir. Temiz ve keskin bir jilet kullanarak yaklaşık 2 X 8 cm, derin bir dikdörtgen alan 4-5 kesilmiş katlar. Dikdörtgen soğan dokusu dışarı atın dış iki kat atmak, 2x1.5 cm parçalar halinde kalan katmanları soğan kesmek. Steril su ile ıslatılmış filtre kağıdı (whatman 3MM kağıt daireler halinde kesilir) içeren bir Petri kabındaki soğan parçalarını yerleştirin. Petri kabı Kapak ve onlar gitmek için hazırsınız.
IV. Bombardıman
- Beyaz yuvarlak kartuş sahipleri kartuşları yükleyin. Kartuşları farklı plazmid yapıları içeren farklı bir kartuş sahipleri yüklenmiş olması gerekir. Her kartuş tutucu 12 çekimler için 12 kartuş kadar tutabilir.
- Helios Gen Tabancası içine pil ve taze varil gemisi yerleştirin. Namlu astar ve silah hem de bağlı o-ringler ilgili olduğundan emin olun.
- İlk olarak, kartuş tutucu tabancanın üst bakan işareti # 12 ile boş bir kartuş sahibi, gen tabancasının içine yerleştirin. Advance kartuş tutucu bir veya iki kez doğru takılı olduğundan emin olun.
- Helyum tank silahı takın ve 150 ila 200 psi arasındaki basınç ayarlayın.
- Silah odasında temiz ve boş kartuş tutucu basıncı sabit olduğundan emin olmak için, kulak koruma ve yangın silah birkaç kez giyin.
- Boş kartuş yuvasını çıkarın ve yüklü bir kartuş tutucuya yerleştirin. Yangın istediğiniz kartuş kartuş tutucu (6 saat) alt kısmında konumlandırılmış böylece kartuş tutucu ilerletin. Burada bir parça soğan Atış, negatif kontrol için arka plan floresan bir form sağlar.
- Yukarı bakacak şekilde soğan en iç tabakası ile boş bir Petri kabı orta soğan parçalarını yerleştirin. Petri kabı gen tabancası varil liner Dinlenme ve tetiği çekerken yan düğmesini basılı tutarak tüfek ateşiyle. Nemli 3MM filtre kağıdı içeren Petri bombardıman soğan aktarın.
- Sonraki kartuş Advance ve farklı bir soğan parçası ateş. 4-5 adet soğan vurdu kadar bu adımı yineleyin. Her soğan parça bir kez vurulur.
- Farklı bir plazmid veya farklı plazmid kombinasyonu içeren kartuşlar yüklü farklı bir kartuş sahibine değiştirin. Bir varil liner değiştirmeyi unutmayınler de bulaşmasını önlemek için. 04:56 soğan adet çekin.
- Bombardımanından sonra, perti yemekleri tüm soğan dönün. Petri kapları kapakları ile kaplayın. Kurumasını önlemek için onları Parafilm ile sarın. Soğan adet oda sıcaklığında 16-48 saat boyunca karanlıkta inkübe edin.
- Helyum tankı gen tabancası ayrılmakta önce gaz ve serbest basınç kapatın. Sökün varil liner, kartuş tutucu ve kullanılan veya kullanılmayan kartuşları çıkarın.
- Temizleme sabunlu su ile bir behere daldırarak kartuşu sahipleri ve varil gömlekleri. Banyo sonikatör behere koyun ve 20 dakika sonikasyon. Daha sonra, tüm sabun artıkları çıkarmak için su ile durulayınız. % 70 etanol içinde bir saat bekletin ve sonra kağıt havlu üzerinde kurutun.
V. Gözlem
- Oda sıcaklığında 16-20 saat boyunca bombardıman soğan adet kuluçka sonra, biz bu çalışmada kullanılan Zeiss Axio Observer.z1 gibi bir floresan mikroskop kullanılarak GFP veya YFP floresan izleyebilirsiniz.
- Yavaş için soğan iç epidermis (bombardımanı sırasında silah doğrudan karşı karşıya katman) kapalı bir tek hücre tabakası kabuğu düz uçlu forseps kullanın. Slayt üzerinde bir damla su üzerine kabuğu koyun. Lamel ekle ama kabarcıkları en aza indirmek için dikkatli olun.
- Parlak alan mikroskobu altında, ilk sitoplazmik akışı için kontrol hücreler canlı olduğundan emin olmak için. Bunu yapmak için, hareketli plastidlerin bakın sonra soğan doku ısınmak için bir kaç dakika boyunca parlak bir alan ışık slayt ortaya çıkarmak ve. Sitoplazmik akış görmek için her zaman kolay değildir, bu yüzden herhangi bir göremiyorsanız cesareti alamadım.
- Floresan tespiti için, GFP veya YFP için uygun uyarma ve algılama filtreleri kullanın. Olmayan bir floresan plazmid ile çekilmiş soğan parçaları gibi negatif kontroller dahil etmek önemlidir. Soluk sarı sinyalleri yaralı hücreleri, hava kabarcıkları veya enkaz görünebilir. Pozitif kontrol için de önemlidir. 35S gibi bir plazmid içeren yapısal ifade floresan muhabiri: GFP mükemmel bir pozitif kontrol. Soğan epidermal hücreler (Şekil 1A, D) Görünür GFP sinyalleri kartuşları, soğan doku ve gen tabancası ateş hazırlanır ve yürütülür. : SEU pSPYNE ve 35S:: LUH pSPYCE DNA'lar Daha sonra, biz 35S bir karışımını içeren kartuşlar ile bombardımana soğan adet SEU pSPYNE ve LUH-pSPYCE arasındaki etkileşimleri gözlemledi. Faint YFP çekirdeğinde bulunan bölünmüş YFP parçaları bir araya getirdi SEU ve LUH arasında doğrudan fiziksel bir etkileşim gösteren floresan sadece çekirdeğinde, (Şekil 1 B, E) gözlenmiştir. : GFP: BiFC YFP sinyal 35S GFP sinyale göre önemli ölçüde daha zayıf olduğunu unutmayın.
Temsilcisi Sonuçlar
Bizim çalışmamızda, burada 35S bildirdi: plazmid GFP pozitif kontrol kapalı çekirdek ve sitoplazma (Şekil 1A, D) her ikisi de dahil olmak üzere tüm hücre, doldurur güçlü floresan verir. GFP protein kadar küçük bir nükleer lokalizasyon sinyal olmadan çekirdeği diffüz. Buna karşılık, SEU ve LUH, daha önce bir maya iki hibrit tahlil 2 etkileşim gösterilmiştir iki Arabidopsis transkripsiyonel faktörler . SEU-pSPYNE (SEU YFP N-terminal parçası erimiş) ve LUH-pSPYCE (SEU YFP N-terminal parçası erimiş), çekirdeğin içine diffüz nükleer lokalizasyon sinyaller içeren 2,5 hem de çok büyük. Soğan hücre çekirdeği (Şekil 1 B, E) tespit YFP floresan sinyal SEU pSPYNE ve LUH-pSPYCE soğan çekirdekleri etkileşim gösterir. YFP ve LUH-pSPYCE (Şekil 1C, F), N-terminal parçasını içeren vektör plazmid pSPYNE plazmid karışımı ile bombardımana soğan yok floresan sinyal tespit edilir.
BiFC aracılı YFP floresan 35S GFP-aracılı floresan göre anlamlı derecede zayıf: GFP plazmid. Bizim çalışmamızda, onlar da (B) Şekil 1A karşılaştırmak farklı hücre içi lokalizasyonu gösterdi. Ayrıca, her iki ortak plazmid başarıyla girer ve aynı soğan hücreleri ifade BiFC sadece eser olarak floresan hücrelerinin sayısı, BiFC için oldukça düşüktür.
Şekil 1. Floresan (A, B, C) ve parlak bir alan (D, E, F) soğan hücreleri görüntüleri farklı plazmid yapıları ile bombaladı. (A) ve (D), Soğan hücreleri 35S ile bombaladı: GFP. GFP sitoplazma ve çekirdek boyunca yayılır. (B) ve (E), Soğan hücreleri 35S eşit molar karışımları ile bombardıman: SEU-pSPYNE (SEU YFP N-terminal parçası erimiş) ve 35S: LUH pSPYCE (LUH C-terminal parçası için erimiş ) plazmid DNA. SEU-pSPYNE ve LUH pSPYCE arasında bir etkileşim, bir floresan çekirdeği tarafından gösterilir. (C) ve (F), soğan hücreleri gösteren bir negatif kontrol vektör pUC19 SPYNE ve LUH pSPYCE plasmi karışımları ile bombaladıds. Yok floresan sinyal tespit edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
- GFP veya 35S:: GUS ilk kez kullanıcılar için, biz böyle 35S gibi tek bir plazmid kurucu muhabiri, kartuş hazırlanması gözlem, tüm prosedürü uygulamak öneririz. Biz 35S kullandı: plazmid GFP elde edilen Dr. Steve Mount ve Xiaoning Zhang 6 (Şekil 1A, D). RioRad (Kedi 165-2244) satılan gen atış kontrol kartuşları bitkiler için uygun değildir.
- BiFC için, ikinci bir pozitif kontrol sırasıyla YFP C-terminal ve N-terminal parçalara kaynaşmış iki bilinen etkileşim ortakları, oluşmalıdır gereklidir.
- BiFC için, birkaç negatif kontroller için gerekli olan: (1) protein X YFP N-terminal parçasının yanı sıra C-terminal parçası için bir vektör kodlama erimiş; (2) protein Y, C-terminal parçası erimiş YFP artı N-terminal parçası için bir vektör kodlama; sadece (3) vektör.
- Doku hasarı azaltmak için hizmet çekim, ateş bir difüzyon ekran Helios Gen Tabancası varil kaide üzerinde kullanılabilir. Bizim çalışmamızda, difüzyon ekran kullanımı yoktu.
- BiFC, ikaz ışığı maruz kalma süresi ile aracılı YFP floresans mikroskopik görüntüleme sırasında fotoğraf beyazlatma azaltmak için minimize edilmelidir.
- Kurutucular içeren sintilasyon şişeleri saklanan Kartuşları birkaç ay için iyi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Dr teşekkür ederim. 35S Steve Mount ve Xiaoning Zhang: GFP pGlowbug inşa ve Z. L's laboratuvarda CH Araştırma Hokensen Doktora Bursu, ABD Ulusal Bilim Vakfı (IOB0616096 ve MCB0744752) tarafından desteklenmektedir. ZL, Maryland Zirai Araştırma İstasyonu Üniversitesi tarafından kısmen destekleniyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yellow onion | Any Supplier | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
