双分子荧光互补（附设）检测蛋白质相互作用的洋葱细胞使用的Helios基因枪

Summary

本文介绍了如何正确使用BioRad公司赫利奥斯基因枪引入洋葱表皮细胞的质粒DNA，以及如何测试基于双分子荧光互补的原则（附设）洋葱细胞中的蛋白质 - 蛋白质相互作用

Abstract

在不同生物体的基因功能的研究依赖于基因产物如何彼此互动在正常的细胞环境的知识。双分子荧光互补（附设）含量

Protocol

一，质粒制备

轰击使用的质粒DNA必须是高纯度和浓度500ng/μl或更大。附设涉及两个质粒结构，需要25微克的每个质粒。换句话说，两个质粒的1:1摩尔比混合，给墨盒准备上升​​到50微克质粒DNA总量。要留意超过50微克，增加更多的DNA可能会导致金颗粒的集聚，并应避免。市售的质粒DNA提取试剂盒隔离质粒DNA的建议。

质粒载体应在pUC19中，如规模相对较小。我们克隆到的pUC19 - SPYNE的pUC19 - SPYCE，分别为³的cDNA SEU和LUH。 农杆菌介导的二进制向量过大和不适当的轰击。

二。墨盒准备

墨盒准备涉及涂料与质粒DNA和装入塑料管材，随后削减到半英寸长片，它可以加载到基因枪匣持有的金粒子。墨盒准备在一个单独的朱庇特第⁴条的详细描述，这里没有描述。洋葱细胞的轰击，我们建议12.5毫克每准备金颗粒，产量约在1微克DNA/0.25毫克黄金/盒，50墨盒50微克质粒DNA混合。每个墨盒是一炮打响。金颗粒可以是0.6微米，直径1.0微米（猫＃1652262或Cat＃1652263; BIORAD）。我们还建议使用的墨盒准备为0.5毫克/毫升PVP的解决方案。对于附设，结合每个公认的互动合作伙伴，在相同的墨盒准备的两个质粒DNA。

墨盒准备后，重要的是要测试发射在150到200 psi之间的氦气压力培养皿周围包裹成方形的封口膜，新提出的墨盒墨盒。这将测试如果金粒子可以有效地推动墨盒，你应该看到微弱的金颗粒上的封口膜。这使您每次拍摄将覆盖的区域的想法。您可能会注意到不同数量的金颗粒上的封口膜在不同氦气压力（150-200 psi范围）的推动。如果没有显着差异，选择压力较低的轰击。

三。准备洋葱组织

在拍摄当天，从一个大的黄皮洋葱的外层皮肤剥离。使用清洁和锋利的刀片，切4-5层约2 x 8厘米深的矩形区域。取出的矩形洋葱组织，放弃外两层，其余各层的洋葱切成约2X1.5厘米件。放置在培养皿滤纸盘（削减成圆圈的Whatman 3MM纸）洋葱片，用无菌水浸湿。盖培养皿中，他们已经准备好去。

四。轰击

1. 墨盒装入白色圆形盒持有人。应持有不同的墨盒装入含不同质粒结构的墨盒。每个墨盒持有人最多可容纳12墨盒为12杆。
2. 插入电池和新鲜桶内胆的Helios基因枪。确保桶内衬和枪有各自的O型圈连接。
3. 首先，插入一个空盒支架，基因枪与马克＃12墨盒上面临持有枪顶部。预先盒支架，一次或两次，以确保它是正确插入。
4. 附加枪氦坦克和调整的压力在150至200磅之间。
5. 穿耳朵的保护和消防枪持有空墨盒几次清理出枪室，并确保压力稳定。
6. 取出空墨盒的持有人，并插入持有装入墨盒。提前盒支架，使你想火墨盒墨盒持有人（6点）定位在底部。洋葱片在这里拍摄，提供了一个背景荧光阴性对照的形式。
7. 洋葱片放置在一个空的最内层朝上洋葱层的培养皿中。休息基因枪的培养皿桶内衬和消防枪扣动扳机的同时，按住侧面按钮。传输轰击洋葱含有湿润3MM滤纸的培养皿中。
8. 前进到下一个墨盒和火灾不同的洋葱片。重复此步骤，直到四，五个洋葱片拍摄。每个洋葱片拍摄一次。
9. 变更与含不同质粒或不同质粒组合的墨盒装入不同的墨盒持有人。请记住一个改变桶内衬小号以及防止污染。拍四，五个洋葱片。
10. 轰击后，返回所有的洋葱perti料理。盖有盖培养皿。包装用封口膜，以防止干燥。在16-48小时的黑暗，在室温下孵育洋葱片。
11. 关闭之前从氦气罐分离基因枪的气体，并释放压力。拧开桶内衬，并取出墨盒持有和使用（或闲置）墨盒。
12. 浸没在烧杯用肥皂水清洗墨盒持有人及桶内衬。在洗澡sonicator的烧杯中，超声20分钟。之后，用清水冲洗干净，除去所有肥皂残留物。 70％的乙醇浸泡一个小时，然后干纸巾。

五，观察

1. 孵化轰击洋葱件在室温为16-20小时后，我们可以使用蔡司Axio上Observer.z1如在这项研究中所使用的荧光显微镜观察GFP或YFP的荧光。
2. 使用镊子慢慢剥过的洋葱内表皮（层，直接面对在轰击枪）的单细胞层平面两端。放置到幻灯片上的水下降剥离。加盖玻片，但要小心，尽量减少气泡。
3. 明场显微镜下，首先检查细胞质流，以确保细胞是活的的。要做到这一点，揭露幻灯片明视场光几分钟热身洋葱组织，然后寻找移动质。细胞质流并不总是很容易看到，所以不要气馁，如果你不能看到任何。
4. 荧光检测，使用适当的激发和检测GFP或YFP过滤器。这一点很重要，包括阴性对照，如洋葱片拍摄与非荧光质粒。微弱的黄色信号，可能会出现受伤的细胞，气泡，或碎片。同样重要的是，包括阳性对照。一个组成型表达质粒含有荧光报告，如35S：：GFP是一个很好的的阳性对照。可见GFP的洋葱表皮细胞（图1A，D）的信号表明，墨盒，洋葱组织和基因枪射击适当的准备和执行。随后，我们观察到SEU - pSPYNE LUH - pSPYCE之间的相互作用，包含了35S的混合物墨盒轰击洋葱片：SEU - pSPYNE和35S：：LUH - pSPYCE的DNA。淡淡的YFP的荧光观察（图1 B，E），这表明仅在细胞核的SEU和LUH物理之间的直接互动，带来了在细胞核分裂YFP的片段。请注意，从附设的YFP的信号明显高于GFP信号较弱，从35S：：GFP。

代表性的成果

在这里我们的研究报告，35S：：GFP阳性对照质粒，充满整个细胞，包括细胞核和细胞质（图1A，D）的散发出强烈的荧光。 GFP蛋白是足够小，没有一个核定位信号核弥漫。相比之下，SEU和LUH两个拟南芥转录因子先前交互显示在酵母双杂交实验^2。 SEU - pSPYNE（SEU的YFP的N -端片段融合）LUH - pSPYCE（SEU的YFP的N -端片段融合），扩散到细胞核中，含有核定位信号^2,5太大。 YFP的荧光信号，在洋葱细胞核（图1 B，E）检测表明，SEU - pSPYNE LUH - pSPYCE可以在洋葱细胞核交互。无荧光信号检测与载体含有pSPYNE YFP的LUH - pSPYCE（图1C，F）的N -端片段的质粒混合轰击洋葱。

附设介导的YFP的荧光明显高于从35S绿色荧光蛋白介导的的荧光较弱：GFP质粒。在我们的研究中，他们也表现出不同的亚细胞定位（与B比较图1A）。此外，荧光细胞数为附设明显降低，为附设只有当两个伙伴的质粒成功进入，并表示在相同的洋葱细胞。

图1。荧光灯（A，B，C），和明场（D，E，F）的洋葱细胞的图像轰击不同质粒结构。 （一）和（D），洋葱细胞轰炸35S：：GFP的。绿色荧光蛋白扩散通过了细胞质和细胞核。 （二）及（E），洋葱细胞35S等于摩尔混合轰炸：SEU - pSPYNE（SEU的YFP的N -端片段融合）和35S：：LUH pSPYCE（LUH融合的C -末端片段）质粒DNA。 SEU - pSPYNE LUH - pSPYCE之间的相互作用是由荧光的细胞核。 （三）及（F），阴性对照显示洋葱细胞与载体pUC19 SPYNE LUH - pSPYCE plasmi混合轰炸DS。没有检测到荧光信号。

Discussion

1. 对于首次用户，我们建议实行整个过程，从墨盒准备观察，用一个单一的质粒构记者如35S：：GFP或35S：：GUS。我们使用了35S：：GFP质粒从博士获得。史蒂夫山和小宁张^6（图1A，D）。不适合植物基因出手控制RioRad（猫165-2244）出售的墨盒。
2. 对于附设，第二个阳性对照是必要的，应当由两个已知的交互融合YFP的C端和N -末端片段的合作伙伴，分别。
3. 对于附设，这是必要的，包括一些负面控制：（1）的YFP的N -端片段，再加上一个向量的C -末端片段编码蛋白质X融合;（2）C -末端片段的融合蛋白Ÿ YFP的加N -端片段编码的一个载体;（3）载体。
4. 可以使用一个扩散屏幕的Helios基因枪桶的基础上，烧成时的出手，这有助于减少组织损伤。在我们的研究中，我们没有使用扩散屏幕。
5. 附设，曝光时间，以激发光介导YFP的荧光显微镜观看期间应尽量减少照片漂白。
6. 存储在闪烁瓶含有干燥剂的墨盒好几个月。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yellow onion	Any Supplier
Helios Gene Gun	Bio-Rad
Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP	Zeiss, Nikon, Olympus