Summary
هذه المقالة يوضح كيفية استخدام صحيح BioRad هيليوس غون جين لإدخال الحمض النووي في الخلايا البلازميد البصل البشرة وكيفية اختبار للبروتين تفاعلات البروتين في الخلايا البصل على أساس مبدأ التكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC)
Abstract
التحقيق في وظائف الجينات في الكائنات المتنوعة تعتمد على معرفة كيف يمكن للمنتجات الجينات تتفاعل مع بعضها البعض في بيئتها الطبيعية الخلوية. والتكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC) الفحص
Protocol
أولا إعداد البلازميد
يجب أن الحمض النووي بلازميد تستخدم لقصف تكون ذات درجة نقاوة عالية وبتركيز 500ng/μl أو أكبر. BiFC لتشمل اثنين يبني البلازميد ، هناك حاجة 25 ميكروغرام لكل البلازميد. وبعبارة أخرى ، ينبغي أن تكون مختلطة نسبة 1:1 المولي من سنتين إلى البلازميدات تؤدي إلى 50 ميكروغرام DNA البلازميد الإجمالية لإعداد الخراطيش. أن تضع في اعتبارها أن إضافة مزيد من الحمض النووي من 50 ميكروغرام قد يسبب تجمع من جزيئات الذهب ويجب تجنبها. ينصح المتاحة تجاريا استخراج الحمض النووي البلازميد مجموعات لعزل السلطات الوطنية المعينة بلازميد.
وينبغي أن تكون ناقلات البلازميد صغيرة الحجم نسبيا مثل pUC19. نحن المستنسخة SEU وLUH [كدنا] في SPYNE - pUC19 وpUC19 SPYCE ، على التوالي 3. ناقلات ثنائية لالأجرعية بوساطة تحول كبيرة جدا وغير مناسب للقصف.
II. خرطوشة إعداد
خرطوشة إعداد ينطوي على جزيئات الذهب طلاء مع DNA البلازميد وتحميلها في الأنابيب البلاستيكية التي يتم خفض لاحقا الى قطع نصف المدة بوصة ، والتي يمكن تحميلها في حاملي الجين خرطوشة بندقية. يوصف خرطوشة إعداد كبيرة في التفاصيل في مقالة منفصلة إن الرب (4) وبالتالي ليس وصفها هنا. للقصف من خلايا البصل ، نوصي خلط 50 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد مع 12.5 ملغ من جزيئات الذهب في التحضير ، والتي ينتج عن ما يصل الى 50 ميكروغرام في 1 خراطيش DNA/0.25 ملغم الذهب / خرطوشة. كل خرطوشة لطلقة واحدة. يمكن للجزيئات الذهب إما 0.6 أو 1.0 ميكرومتر ميكرومتر في القطر (القط # # 1652262 1652263 أو القط ؛ Biorad). نحن أيضا ننصح باستخدام 0.5 ملغ / مل حل PVP لإعداد خرطوشة. لBiFC ، والجمع بين السلطات الوطنية المعينة بلازميد two كل شريك التفاعل المفترضة في إعداد خرطوشة واحدة.
بعد إعداد خرطوشة ، فمن المهم لاختبار خراطيش خراطيش رميا أدلى حديثا عند ضغط الهليوم بين 150-200 رطل في المربع الذي Parafilm ملفوفة حول طبق بيتري. وهذا الاختبار ما إذا كان يمكن الدفع للجزيئات الذهب بكفاءة من خراطيش ؛ سترى جزيئات الذهب خافت على Parafilm. هذا يعطيك فكرة عن المنطقة التي سوف تغطي كل طلقة. قد تلاحظ كميات مختلفة من جزيئات الذهب في صاروخية على Parafilm عند ضغوط مختلفة الهليوم (في نطاق 150-200 رطل). إذا لم يكن هناك اختلاف كبير ، واختيار لخفض ضغط القصف.
III. إعداد البصل الأنسجة
في يوم من اطلاق النار ، تقشر الجلد الخارجي من البصل الأصفر واسع. باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وحادة ، وقطع 4-5 الطبقات العميقة مساحة مستطيلة من حوالي 2 سم 8 X. إخراج نسيج البصل مستطيلة ، تجاهل الخارجي طبقتين ، وقطع ما تبقى من طبقات البصل إلى قطع الطول حوالي 2X1.5. مكان مبلل قطع البصل في طبق بتري تحتوي على ورق الترشيح (ورقة Whatman 3MM مقطعة إلى دوائر) مع الماء المعقم. تغطية صحن بيتري وانهم مستعدون للذهاب.
رابعا. قصف
- تحميل خراطيش في الجولة أصحاب خرطوشة أبيض. يجب أن يتم تحميل الخراطيش تحتوي على تركيبات مختلفة في البلازميد أصحاب خرطوشة مختلفة. يمكن لكل حامل خرطوشة تعقد ما يصل إلى 12 لمدة 12 خراطيش الطلقات.
- إدراج البطارية وبطانة برميل جديدة في غون جين هيليوس. تأكد من أن كلا من بطانة برميل والبندقية ومنها طوقية المرفقة.
- أولا ، إدراج حامل خرطوشة فارغة في البندقية الجينات ، مع علامة # 12 على حامل خرطوشة تواجه أعلى من البندقية. تقدم حامل خرطوشة مرة أو مرتين للتأكد من إدخاله بشكل صحيح.
- نعلق مدفع الدبابة إلى الهيليوم وضبط الضغط بين 150-200 رطل.
- ارتداء حماية الأذن وبندقية النار عدة مرات مع حامل خرطوشة فارغة لتنظيف الغرفة من البندقية ، والتأكد من أن ضغط مستقرة.
- إزالة حامل خرطوشة فارغة وادخال وحامل خرطوشة تحميلها. دفع حامل خرطوشة بحيث يتم وضع خرطوشة تريد النار على القاع (6:00) من حامل خرطوشة. اطلاق النار على قطعة من البصل هنا يوفر شكلا من أشكال السيطرة السلبية لمضان الخلفية.
- مكان قطع البصل في وسط طبق بيتري an فارغة مع طبقة داخلية أكثر من البصل مواجهة. بقية بطانة البندقية الجين برميل في طبق بتري ونيران البندقية عن طريق الضغط باستمرار على زر الجانب بينما تضغط على الزناد. نقل قصفت البصل إلى طبق بتري تحتوي على ورقة رطبة تصفية 3MM.
- تقدم إلى خرطوشة المقبل والبصل النار قطعة مختلفة. كرر هذه الخطوة حتى يتم اسقاط أربع إلى خمس قطع من البصل. يتم اطلاق النار على كل قطعة البصل مرة واحدة.
- تغيير على حامل خرطوشة مختلفة محملة الخراطيش تحتوي على مزيج مختلف البلازميد البلازميد أو مختلفة. تذكر لتغيير بطانة برميلق جيدا لمنع التلوث. تبادل لاطلاق النار قطع البصل 4-5.
- بعد القصف ، وعودة جميع البصل إلى أطباق perti. تغطية أطباق بتري مع الأغطية. التفاف لهم Parafilm لمنع جفاف. احتضان قطع البصل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 16-48 ساعة.
- إيقاف إطلاق الغاز والضغط قبل فصل الجينات البندقية من خزان الهيليوم. فك بطانة للبرميل ، وإزالة حامل خرطوشة والخراطيش المستخدمة (أو غير مستخدمة).
- أصحاب تنظيف خرطوشة وبطانات برميل بحلول غمر لهم في كوب من الماء والصابون. ضع الدورق في حمام sonicator ويصوتن لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، وشطف لهم بالماء لإزالة جميع مخلفات الصابون. نقع في الايثانول 70 ٪ لمدة ساعة ثم تجفيفها على مناشف ورقية.
خامسا المراقبة
- تفرخ بعد قطع البصل لقصف 16-20 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ويمكن أن نلاحظ GFP أو مضان YFP باستخدام مجهر مضان مثل Observer.z1 محوري زايس المستخدمة في هذه الدراسة.
- استخدام ملقط مع نهايات مسطح ببطء قشر طبقة خلية واحدة قبالة البشرة الداخلية من البصل (الطبقة التي تواجه مباشرة البندقية أثناء القصف). ضع قشر على قطرة ماء على شريحة. إضافة ساترة ولكن يجب الحرص على الحد من الفقاعات.
- تحت حقل مشرق من المجهر ، أولا التحقق من تدفق هيولي للتأكد من أن الخلايا على قيد الحياة. للقيام بذلك ، تعرض الشريحة لضوء ساطع الميدان لبضع دقائق لتسخين الأنسجة والبصل ثم ابحث عن البلاستيدات تتحرك. تدفق هيولي ليس من السهل دائما أن نرى ، لذلك لا يحصلون على تثبيط إذا كنت لا تستطيع رؤية أي.
- للكشف عن مضان ، واستخدام الإثارة والفلاتر المناسبة الكشف عن GFP أو YFP. من المهم أن تشمل الضوابط سلبية مثل قطع البصل النار مع البلازميد غير الفلورسنت. قد تظهر اشارات صفراء باهتة من خلايا الجرحى ، وفقاعات الهواء ، أو الحطام. من المهم أيضا لتشمل الضوابط الإيجابية. وتحتوي على البلازميد مراسل الفلورسنت أعرب constitutively مثل 35S : GFP هو عنصر تحكم ممتازة إيجابية. وأشار إشارات مرئية GFP من خلايا البشرة البصل (الشكل 1A ، D) والتي يتم إعدادها إعدادا سليما الخراطيش ، والأنسجة والبصل ، واطلاق مدفع الجينات وتنفيذها. بعد ذلك ، لاحظنا التفاعل بين SEU - pSPYNE وLUH pSPYCE في قطع البصل لوابل من خراطيش تحتوي على خليط من 35S : SEU - 35S وpSPYNE : LUH - pSPYCE السلطات الوطنية المعينة. ولوحظ خافت YFP مضان في نواة فقط (الشكل 1 B ، E) ، مما يدل على التفاعل المباشر بين المادية وSEU LUH التي جلبت شظايا YFP تقسيم معا في النواة. علما أن إشارة YFP من BiFC أضعف بكثير من إشارة GFP من 35S : GFP.
ممثل النتائج
وذكرت في دراستنا هنا ، 35S : GFP مراقبة إيجابية بلازميد يعطي قبالة مضان القوي الذي يملأ الخلية بأكملها ، بما في ذلك نواة كل والسيتوبلازم (الشكل 1A ، D). GFP بروتين صغير بما يكفي لنزع فتيل في نواة دون إشارة توطين النووية. في المقابل ، وSEU LUH عاملان الترانسكربتي Arabidopsis أظهرت في وقت سابق للتفاعل في الخميرة اثنين الهجين مقايسة 2. SEU - pSPYNE (SEU تنصهر لجزء من محطة N - YFP) وLUH - pSPYCE (SEU تنصهر لجزء من محطة N - YFP) ، وكلاهما كبير جدا لنشر في النواة ، وتحتوي على إشارات توطين 2،5 النووية. إشارة YFP الفلورسنت المكتشفة في البصل نواة الخلية (الشكل 1 B ، E) ، يشير إلى أن SEU pSPYNE وLUH pSPYCE ، يمكن أن تتفاعل في نوى البصل. يتم الكشف عن أي إشارة الفلورسنت في البصل قصفت مع مزيج من البلازميد pSPYNE ناقلات البلازميد التي تحتوي على جزء من المحطة N - YFP وLUH - pSPYCE (الشكل 1C ، F).
ومضان YFP BiFC بوساطة أضعف بكثير من مضان GFP بوساطة من 35S : GFP البلازميد. في دراستنا ، فإنها أظهرت أيضا توطين التحت خلوية مختلفة (قارن مع الشكل 1A B). بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدد الخلايا فلوري هو أقل من ذلك بكثير لBiFC ، كما BiFC يعمل فقط عند كل دخول شريك البلازميدات بنجاح ويتم التعبير عن البصل في الخلايا نفسها.
الشكل 1. قصفت نيون (A ، B ، C) والميدان مشرق (D ، E ، F) لوحات من الخلايا البصل مع البلازميد بنيات مختلفة. (أ) و (D) ، قصفت خلايا البصل مع 35S : GFP. GFP ينشر من خلال الخروج من السيتوبلازم والنواة. (ب) و (E) ، لوابل من خلايا البصل يمزج المولي على قدم المساواة 35S : SEU - pSPYNE (SEU تنصهر لجزء من محطة N - YFP) و35S : LUH - pSPYCE (LUH تنصهر لتفتيت محطة C - ) DNA البلازميد. ويظهر التفاعل بين SEU - pSPYNE وLUH pSPYCE تلو نواة الفلورسنت. (C) و (F) ، قصفت والسيطرة السلبية تظهر الخلايا مع البصل يمزج من ناقلات SPYNE - pUC19 وplasmi LUH - pSPYCEس. يتم الكشف عن أي إشارة الفلورسنت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
- لأول مرة للمستخدمين ، نوصي ممارسة الإجراء بأكمله ، من إعداد خرطوشة للمراقبة ، مع مراسل واحد التأسيسية البلازميد مثل 35S : GFP أو 35S : : المكتب المركزي للاحصاءات. استخدمنا 35S : GFP البلازميد تم الحصول عليها من الدكاترة. ستيف وجبل تشانغ شياو نينغ 6 (الشكل 1A ، D). خراطيش مراقبة الجينات التي تباع في النار RioRad (القط 165-2244) ليست مناسبة للنباتات.
- لBiFC ، والتحكم الإيجابي الثاني هو ضروري ، والتي ينبغي أن تتكون من الشركاء يعرف two التفاعل تنصهر إلى شظايا ، ومحطة C - N - محطة من YFP ، على التوالي.
- لBiFC ، فمن الضروري أن تتضمن الضوابط سلبية عديدة منها : (1) X البروتين تنصهر لجزء من محطة N - YFP بالاضافة الى ناقلات ترميز لتفتيت محطة C - ، (2) Y البروتين تنصهر لجزء من محطة C - YFP بالاضافة الى ناقلات ترميز لتفتيت N - المحطة ، (3) ناقلات فقط.
- ويمكن استخدام شاشة نشرها على قاعدة للبرميل غون جين هيليوس عند اطلاق النار ، والذي يعمل على الحد من تلف الأنسجة. في دراستنا ، لم نكن استخدام الشاشة نشرها.
- وينبغي خلال عرض المجهري مضان YFP بوساطة BiFC ، وقت التعرض للضوء يمكن التقليل من الإثارة للحد من الصورة التبييض.
- خراطيش تخزينها في قارورة تحتوي على التلألؤ المجففات جيدة لعدة أشهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الدكاترة. ستيف وتشانغ شياو نينغ جبل ل35S : معتمد GFP pGlowbug بناء والزمالة لأبحاث الدكتوراه Hokensen CH في مختبر Z. L' ق من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الأميركية (وIOB0616096 MCB0744752). معتمد جزئيا ZL من جامعة ميريلاند محطة التجربة الزراعية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yellow onion | Any Supplier | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
