Summary
Dit artikel illustreert hoe goed gebruik van de BioRad Helios Gene Gun om plasmide DNA te introduceren in ui epidermale cellen en hoe om te testen voor eiwit-eiwit interacties in ui cellen op basis van het principe van de Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC)
Abstract
Onderzoek naar gen-functie in diverse organismen is gebaseerd op kennis van hoe de genproducten met elkaar in hun normale cellulaire omgeving. De Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Assay
Protocol
I. Plasmide voorbereiding
Het plasmide DNA wordt gebruikt voor het bombardement moet zijn van de hoge zuiverheid en bij een concentratie van 500ng/μl of hoger. Voor BiFC waarbij twee plasmide constructen, is 25 ug van elk plasmide nodig. Met andere woorden, 01:01 molaire verhouding van de twee plasmiden worden gemengd om aanleiding te geven tot 50 ug totaal plasmide DNA voor de bereiding van cartridges. Wees ervan bewust dat het toevoegen van meer dan 50 ug DNA kan agglomeratie van de gouddeeltjes oorzaak en moet worden vermeden. In de handel verkrijgbare plasmide DNA-extractie kits worden aanbevolen voor het isoleren van plasmide DNA.
Plasmide vectoren moeten relatief klein in omvang, zoals pUC19. We gekloonde SEU en LUH cDNA in pUC19-SPYNE en pUC19-spyce, respectievelijk 3. Binaire vectoren voor Agrobacterium-gemedieerde transformatie zijn te groot en niet geschikt voor het bombardement.
II. Cartridge voorbereiding
Cartridge voorbereiding impliceert coating gouddeeltjes met plasmide DNA en laden ze in plastic buizen, dat vervolgens wordt verdeeld in halve centimeter lange stukken, die kan worden geladen in het gen pistool patroon houders. Cartridge voorbereiding is beschreven in grote details in een apart Jupiter artikel 4 en is dus hier niet beschreven. Voor bombardement van ui cellen, raden wij aan het mengen van 50 ug van plasmide DNA met 12,5 mg goud deeltjes per voorbereiding, die ongeveer rendementen tot 50 cartridges bij 1 ug DNA/0.25 mg goud / cartridge. Elke cartridge is voor een schot. De gouddeeltjes kan zowel 0,6 micrometer of 1,0 micrometer in diameter (Cat # 1652262 of Cat # 1652263; Biorad). Wij bevelen ook het gebruik van 0,5 mg / ml PVP-oplossing voor de patroon voorbereiding. Voor BiFC, combineren de twee plasmide DNA's van elke vermeende interactie partner in hetzelfde patroon voorbereiding.
Na de cartridge voorbereiding is het belangrijk om de cartridges te testen door het afvuren van de nieuw gemaakte cartridges op een helium-druk tussen 150 en 200 psi in een vierkant Parafilm dat is gewikkeld rond een petrischaal. Dit zal worden nagegaan of de gouddeeltjes efficiënt kunnen worden aangedreven vanaf de cartridges, je moet zien flauwvallen gouddeeltjes op de Parafilm. Dit geeft u een idee van het gebied dat elk shot zal dekken. Mogelijk ziet u verschillende bedragen van gouddeeltjes aangedreven op de Parafilm bij verschillende helium druk (150-200 psi bereik). Als er geen significant verschil, kies dan de lagere druk voor bombardement.
III. Voorbereiden ui weefsels
Op de dag van schieten, loslaten buitenste schil van een grote gele ui. Met behulp van een schoon en scherp scheermes, gesneden 4-5 lagen diep een rechthoekig gebied van ongeveer 2 x 8 cm. Haal de rechthoekige ui weefsel, gooi de buitenste twee lagen, snijd de overige lagen van de ui in ongeveer 2x1.5 cm stukken. Leg de stukken ui in een petrischaal met filtreerpapier (Whatman 3MM papier gesneden in cirkels), bevochtigd met steriel water. Dek de petrischaal en ze zijn klaar om te gaan.
IV. Bombardement
- Laad de cartridges in het witte ronde cartridge houders. Patronen met verschillende plasmide constructen moeten worden geladen in verschillende cartridge houders. Elke cartridge houder kan maximaal tot 12 cartridges voor 12 opnamen.
- Plaats de batterij en de verse vat folie in de Helios Gene Gun. Zorg ervoor dat zowel het vat liner en het geweer respectieve bijgevoegde o-ringen te hebben.
- Plaats eerst een lege cartridge houder in het gen pistool, met Mark # 12 op de patroonhouder naar de bovenkant van het pistool. Advance cartridge houder van een of twee keer om te controleren of deze correct is geplaatst.
- Bevestig pistool aan de helium tank en stel de druk tussen 150 en 200 psi.
- Draag gehoorbescherming en vuur pistool een paar keer met de lege patroonhouder schoon te maken uit de kamer van het pistool en ervoor te zorgen dat de druk stabiel is.
- Verwijder de lege patroonhouder en plaats een geladen patroonhouder. Vooraf de patroonhouder, zodat de cartridge die u wilt brand is gepositioneerd aan de onderkant (zes) van de patroonhouder. Opnemen van een stukje ui hier biedt een vorm van negatieve controle voor achtergrond fluorescentie.
- Leg ui stukken in het midden van een lege petrischaal met de innerlijke meeste laag van de ui naar boven. Rest van het gen kanon vat liner op petrischaaltje en vuur het kanon door het ingedrukt houden van de zijkant te drukken terwijl overhalen van de trekker. Breng de ui gebombardeerd tot een petrischaal met een vochtig 3MM filtreerpapier.
- Naar het volgende patroon en vuur een andere ui stuk. Herhaal deze stap tot vier tot vijf stukken van uien zijn geschoten. Elke ui stuk is een keer neergeschoten.
- Wijzigen om een andere cartridge houder geladen met cartridges met een ander plasmide of ander plasmide combinatie. Vergeet niet om het vat liner veranderens goed om besmetting te voorkomen. Schiet vier tot vijf ui stukken.
- Na het bombardement, geeft alle uien aan perti gerechten. Bedek de petrischalen met deksels. Wikkel ze met Parafilm om uitdroging te voorkomen. Incubeer de ui stukken bij kamertemperatuur in het donker voor 16-48 uur.
- Schakel gas en laat de druk voor het losmaken van het gen geweer van de helium tank. Schroef het vat liner, en verwijder de patroonhouder en de gebruikte (of ongebruikte) cartridges.
- Reinigingscartridge houders en vat liners door onderdompeling ze in een beker met water en zeep. Plaats het bekerglas in een bad ultrasoonapparaat en ultrasone trillingen gedurende 20 minuten. Daarna, spoel ze met water om alle zeepresten te verwijderen. Week ze in 70% ethanol voor een uur en daarna droog ze op keukenpapier.
V. Observatie
- Na het incuberen gebombardeerd ui stukken voor 16-20 uur bij kamertemperatuur, kunnen we zien GFP of YFP fluorescentie met behulp van een fluorescentie microscoop, zoals de Zeiss Axio Observer.z1 gebruikt in deze studie.
- Een tang met platte uiteinden om langzaam te schillen een enkele cel laag uit het binnenste van de ui epidermis (de laag die direct het pistool gezichten tijdens het bombardement). Leg de schil op een druppel water op een dia. Voeg dekglaasje maar wees voorzichtig om bubbels te minimaliseren.
- Onder felle gebied van de microscoop, controleer dan eerst voor de cytoplasmatische streaming om ervoor te zorgen dat de cellen in leven zijn. Om dit te doen, bloot de dia om het heldere licht veld voor een paar minuten op te warmen de ui weefsel en kijk dan voor het verplaatsen van plastiden. Cytoplasmatische streaming is niet altijd gemakkelijk te zien, dus wees niet ontmoedigd als je niet kunt zien geen.
- Voor fluorescentie detectie, maken gebruik van passende excitatie en detectie filters voor GFP of YFP. Het is belangrijk om ook negatieve controles, zoals ui stukken geschoten met een niet-fluorescerende plasmide. Lichtgele signalen kunnen blijken uit gewonde cellen, luchtbellen, of puin. Het is ook van belang om positieve controles. Een plasmide constitutief tot expressie gebracht met fluorescerende reporter, zoals 35S:: GFP is een uitstekende positieve controle. Zichtbaar GFP signalen van ui epidermale cellen (Figuur 1A, D) aangegeven dat de cartridges, de ui weefsels, en het gen pistool afvuren goed worden voorbereid en uitgevoerd. Vervolgens zagen we interacties tussen SEU-pSPYNE en LUH-pSPYCE in ui stukken gebombardeerd met cartridges met een mengsel van 35S:: SEU-pSPYNE en 35S:: LUH-pSPYCE DNA's. Faint YFP fluorescentie werd waargenomen in de kern van alleen (Figuur 1 B, E) met vermelding van de directe fysieke interactie tussen SEU en LUH dat de splitsing YFP fragmenten bij elkaar gebracht in de kern. Merk op dat de YFP signaal van BiFC aanzienlijk zwakker is dan het GFP-signaal van 35S:: GFP.
Representatieve resultaten
In onze studie gerapporteerd hier, de 35S:: GFP positieve controle plasmide geeft ze een sterke fluorescentie dat de hele cel, met inbegrip van zowel de kern en het cytoplasma (Figuur 1A, D) vult. GFP-eiwit is klein genoeg om in de kern diffuse zonder een nucleair lokalisatie signaal. In tegenstelling, SEU en LUH zijn twee Arabidopsis transcriptie factoren eerder aangetoond om samen te werken in een gist twee-hybride analyse 2. SEU-pSPYNE (SEU gefuseerd met het N-terminale fragment van YFP) en LUH-pSPYCE (SEU gefuseerd met het N-terminale fragment van YFP), beide te groot om te diffunderen in de kern, bevatten nucleaire lokalisatie signalen 2,5. De YFP fluorescerende signaal gedetecteerd in de ui celkern (zie figuur 1 B, E) geeft aan dat de SEU-pSPYNE en LUH-pSPYCE kan deelnemen aan ui kernen. Geen fluorescerend signaal wordt gedetecteerd in uien gebombardeerd met plasmide mix van vector plasmide pSPYNE die de N-terminale fragment van YFP en LUH-pSPYCE (figuur 1C, F).
De BiFC-gemedieerde YFP fluorescentie is aanzienlijk zwakker is dan het GFP-gemedieerde fluorescentie van de 35S:: GFP plasmide. In onze studie, ze toonde ook aan verschillende subcellulaire lokalisatie (vergelijk figuur 1A met B). Daarnaast is het aantal fluorescerende cellen is significant lager voor BiFC, zoals BiFC werkt alleen wanneer zowel partner plasmiden met succes in te voeren en worden uitgedrukt in dezelfde ui cellen.
Figuur 1. Fluorescent (A, B, C) en helder veld (D, E, F) beelden van de ui cellen gebombardeerd met verschillende plasmide constructen. (A) en (D), ui cellen gebombardeerd met 35S:: GFP. GFP verspreidt zich door het cytoplasma en kern. (B) en (E), ui cellen gebombardeerd met gelijke molaire mixen van 35S:: SEU-pSPYNE (SEU gefuseerd met het N-terminale fragment van YFP) en 35S:: LUH-pSPYCE (LUH gefuseerd met het C-terminale fragment ) plasmide DNA. Een interactie tussen SEU-pSPYNE en LUH-pSPYCE blijkt uit een fluorescerende kern. (C) en (f), een negatieve controle met ui cellen gebombardeerd met mixen van vector pUC19-SPYNE en LUH-pSPYCE plasmids. Geen fluorescerend signaal wordt gedetecteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
- Voor het eerst gebruikt, raden we aan het oefenen van de gehele procedure, van de cartridge voorbereiding tot observatie, met een enkel plasmide constitutief reporter, zoals 35S:: GFP of 35S:: GUS. Wij gebruikten een 35S:: GFP plasmide verkregen van Drs. Steve Mount en Xiaoning Zhang 6 (figuur 1A, D). Het gen schot controle cartridges verkocht tegen RioRad (Cat 165-2244) zijn niet geschikt voor planten.
- Voor BiFC, een tweede positieve controle noodzakelijk is, die moet bestaan uit twee bekende interagerende partners gefuseerd met het C-terminal en N-terminale fragmenten van YFP, respectievelijk.
- Voor BiFC, is het noodzakelijk om meerdere negatieve controles: (1) eiwit X gefuseerd aan het N-terminale fragment van YFP plus een vector codeert voor het C-terminale fragment, (2) eiwit Y gefuseerd met het C-terminale fragment van YFP plus een vector codeert voor het N-terminale fragment, (3) vector alleen.
- Een diffusie scherm kan worden gebruikt op de voet van de Helios Gene Gun vat tijdens het schieten het schot, die dient om beschadiging van het weefsel te verminderen. In onze studie hebben we geen gebruik van de diffusie-scherm.
- Tijdens de microscopische weergave van YFP fluorescentie gemedieerd door BiFC, blootstelling tijd om het excitatie licht moeten worden geminimaliseerd om foto bleken te verminderen.
- Cartridges opgeslagen in het scintillatieflesjes met droogmiddelen zijn goed voor enkele maanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Drs. Steve Mount en Xiaoning Zhang voor de 35S:: GFP pGlowbug bouwen en de Hokensen Doctoral Fellowship aan CH Onderzoek in het laboratorium Z. L's wordt ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation (IOB0616096 en MCB0744752). ZL wordt gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Maryland Agricultural Experiment Station.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yellow onion | Any Supplier | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
