Summary
Dieser Artikel veranschaulicht, wie man richtig mit dem BioRad Helios Gene Gun, um Plasmid-DNA in Zwiebel Epidermiszellen einzuführen und wie man für Protein-Protein-Interaktionen in Zwiebel-Zellen auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) basierter Test
Abstract
Untersuchung von Genfunktionen in verschiedenen Organismen beruht auf Wissen, wie die Genprodukte miteinander interagieren in ihren normalen zellulären Umgebung. Die bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay
Protocol
I. Plasmidpräparation
Die Plasmid-DNA für die Bombardierung verwendet werden, müssen von hoher Reinheit und in einer Konzentration von 500ng/μl oder größer sein. Für BIFC mit zwei Plasmid-Konstrukte, 25 ug jedes Plasmid benötigt. In anderen Worten, sollte molaren Verhältnis von 1:1 der beiden Plasmiden gemischt steigen auf 50 ug Gesamt-Plasmid-DNA zu geben für die Herstellung von Patronen werden. Seien Sie aufmerksam, dass das Hinzufügen mehr DNA als 50 ug kann die Agglomeration der Goldpartikel verursachen und sollten vermieden werden. Kommerziell erhältliche Plasmid-DNA-Extraktion Kits für die Isolierung von Plasmid-DNA zu empfehlen.
Plasmid-Vektoren sollte relativ klein wie pUC19. Wir geklont SEU-und LUH-cDNA in pUC19-Spyne und pUC19-SPYCE bzw. 3. Binäre Vektoren für Agrobacterium-vermittelte Transformation sind zu groß und ungeeignet für die Bombardierung.
II. Cartridge Vorbereitung
Cartridge Vorbereitung beinhaltet das Beschichten Goldpartikel mit Plasmid-DNA und Einlegen in Kunststoffrohren, die anschließend in Zentimeter lange Stücke, die in die Gen-Kanone Patrone Inhaber geladen werden können, wird geschnitten. Cartridge Vorbereitung ist sehr detailiert in einem separaten Jove Artikel 4 beschrieben und ist somit hier nicht beschrieben. Für Bombardierung von Zwiebel-Zellen, empfehlen wir Mischen 50 ug von Plasmid-DNA mit 12,5 mg Goldpartikel pro Präparat, das über Erträge von bis zu 50 Kartuschen mit 1 ug DNA/0.25 mg Gold / Patrone. Jede Patrone ist für einen Schuss. Die Goldpartikel können entweder 0,6 um bzw. 1,0 um Durchmesser (; Biorad Cat # 1652262 oder Cat # 1652263) werden. Wir empfehlen außerdem die Verwendung von 0,5 mg / ml PVP-Lösung für die Patrone Vorbereitung. Für BIFC, kombinieren die beiden Plasmid-DNA eines jeden vermeintlichen Interaktionspartner in der gleichen Patrone Vorbereitung.
Nach Patrone Vorbereitung, ist es wichtig, die Patronen durch das Brennen der neu gemacht Patronen in einem Helium-Druck zwischen 150 bis 200 psi in ein Quadrat Parafilm, dass rund eine Petrischale gewickelt ist zu testen. Hiermit wird geprüft, ob die Goldpartikel können effizient aus den Kartuschen angetrieben werden; Sie sollten schwache Goldpartikel auf der Parafilm zu sehen. Dies gibt Ihnen eine Vorstellung von dem Gebiet, dass jeder Schuss deckt. Sie werden feststellen, unterschiedliche Mengen an Gold-Partikel auf den Parafilm an verschiedenen Helium Drücke (bei 150-200 psi Bereich) angetrieben. Wenn es keinen signifikanten Unterschied, wählen Sie den niedrigeren Druck für Bombardement.
III. Vorbereitung Zwiebel Gewebe
Am Tag der Dreharbeiten, schälen Außenhaut aus einem großen gelben Zwiebeln. Mit einem sauberen und scharfen Rasierklinge geschnitten 4-5 Lagen tief eine rechteckige Fläche von ca. 2 x 8 cm. Nehmen Sie die rechteckige Zwiebel Gewebe, entsorgen Sie die beiden äußeren Schichten, schneiden Sie die restlichen Schichten der Zwiebel in ca. 2x1.5 cm lange Stücke schneiden. Legen Sie die Zwiebel Stücke in einer Petrischale mit Filterpapier (Whatman 3MM Papier in Kreisen geschnitten) angefeuchtet mit sterilem Wasser. Deckel der Petrischale und sie sind bereit zu gehen.
IV. Beschuss
- Legen Sie die Patronen in die weißen runden Patrone Inhaber. Patronen mit verschiedenen Plasmid-Konstrukte sollten in verschiedene Patrone Inhaber geladen werden. Jede Patrone Halter kann bis zu 12 Patronen für 12 Aufnahmen.
- Legen Sie den Akku und die frischen Fass-Liner in der Helios Gene Gun. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Lauf-Liner und die Pistole jeweiligen O-Ringe befestigt sind.
- Legen Sie zuerst eine leere Patronenhalterung in die Gen-Kanone, mit der Markierung Nr. 12 auf der Patronenhalterung vor der Spitze der Waffe. Advance-Patronenhalter ein-oder zweimal, um sicherzustellen, dass es richtig eingelegt ist.
- Bringen Pistole an den Heliumtank und passen Druck zwischen 150 bis 200 psi.
- Gehörschutz tragen und Feuer Gewehr ein paar Mal mit den leeren Patronenhalter zu reinigen, die Kammer der Waffe und dafür zu sorgen, dass der Druck stabil ist.
- Entfernen Sie die leere Patrone auf und setzen Sie einen geladenen Patronenhalterung. Schieben Sie die Patronenhalterung, so dass die gewünschte Kassette, Feuer unten positioniert ist (6 Uhr) von den Patronenhalter. Shooting ein Stück Zwiebel hier eine Form von Negativ-Kontrolle für Hintergrundfluoreszenz.
- Legen Sie Zwiebelstücke in der Mitte eines leeren Petrischale mit der inneren Schicht der Zwiebel nach oben zeigt. Rest der Gen-Kanone ist Barrel Liner auf Petrischale und Feuer die Kanone, indem Sie die seitliche Taste, während Sie den Auslöser. Übertragen Sie die bombardiert Zwiebel in eine Petrischale mit feuchtem 3MM Filterpapier.
- Vorschuss an die nächste Patrone und Feuer eine andere Zwiebel Stück. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis vier Minuten vor fünf Stücke von Zwiebeln geschossen werden. Jede Zwiebel Stück ist sofort erschossen.
- Wechseln zu einem anderen Patronenhalter mit Kartuschen mit einem anderen Plasmid oder anderen Plasmid Kombination geladen. Denken Sie daran, den Lauf Liner änderns gut Verunreinigung zu verhindern. Schießen vier vor fünf Zwiebelstücke.
- Nach der Bombardierung wieder alle Zwiebeln Perti Gerichte. Decken Sie die Petrischalen mit Deckel. Wickeln Sie sie mit Parafilm Austrocknen zu verhindern. Inkubieren Sie die Zwiebel Stücke bei Raumtemperatur im Dunkeln für 16-48 Stunden.
- Schalten Sie Gas-und Lösedruck vor dem Abnehmen der Gen-Kanone aus dem Helium-Tank. Lösen Sie den Lauf-Liner, und entfernen Sie den Patronenhalter und der verwendeten (oder neu) Patronen.
- Reinigungskassette Inhaber und Lauf-Liner durch Eintauchen in ein Becherglas mit Seifenwasser. Das Becherglas in einem Ultraschallbad und beschallen für 20 Minuten. Danach gut mit Wasser ausspülen, um alle Seifenreste zu entfernen. Genießen sie in 70% Ethanol für eine Stunde und dann trocknen Sie sie auf Küchenpapier.
V. Observation
- Nach Inkubation bombardiert Zwiebel Stücke für 16-20 Stunden bei Raumtemperatur, können wir beobachten, GFP oder YFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop wie die Zeiss Axio Observer.Z1 in dieser Studie verwendet.
- Verwenden einer Pinzette mit flachen Enden langsam schälen einer einzigen Zellschicht von der inneren Epidermis der Zwiebel (die Schicht, die direkt gegenüber der Pistole während der Bombardierung). Legen Sie die Schale auf einen Tropfen Wasser auf einer Folie. Add Deckglas aber vorsichtig sein, um Blasen zu minimieren.
- Unter Hellfeld des Mikroskops, zunächst für Plasmaströmung überprüfen, um sicherzustellen, dass die Zellen am Leben sind. Dazu setzen die Folie, um das Hellfeld Licht für ein paar Minuten zum Aufwärmen der Zwiebel Gewebe und suchen Sie dann nach bewegten Plastiden. Plasmaströmung ist nicht immer leicht zu sehen, also nicht entmutigen, wenn Sie nicht sehen können erhalten.
- Für Fluoreszenz-Detektion geeignete Anregung und Detektion Filter für GFP oder YFP. Es ist wichtig, negativen Kontrollen, wie Zwiebel Stücke mit einem nicht-fluoreszierenden Plasmid erschossen gehören. Faint gelben Signale können von verwundeten Zellen, Luftblasen oder Verunreinigungen auftreten. Es ist auch wichtig, um positive Kontrollen beinhalten. Ein Plasmid, das konstitutiv exprimierte fluoreszierende Reporter wie 35S:: GFP ist eine ausgezeichnete positive Kontrolle. Visible GFP-Signale von Zwiebel Epidermiszellen (Abbildung 1A, D) zeigte, dass die Patronen, die Zwiebel Gewebe, und die Gen-Kanone feuern richtig vorbereitet und ausgeführt. Anschließend beobachteten wir Wechselwirkungen zwischen SEU-pSPYNE und LUH-pSPYCE in Zwiebelstücke mit Patronen, die eine Mischung von 35S bombardiert: SEU-pSPYNE und 35S:: LUH-pSPYCE DNAs. Faint YFP-Fluoreszenz wurde in Kern nur beobachtet (Abbildung 1 B, E), Angabe der direkten physischen Interaktion zwischen SEU-und LUH, dass die Spaltung YFP-Fragmente zusammengeführt in den Zellkern. Beachten Sie, dass die YFP-Signal von BIFC deutlich schwächer als die GFP-Signal von 35S ist:: GFP.
Repräsentative Ergebnisse
In unserer Studie berichteten hier, der 35S:: GFP positive Kontroll-Plasmid abgibt starke Fluoreszenz, die die gesamte Zelle, einschließlich sowohl der Zellkern und Cytoplasma (Abbildung 1A, D) füllt. GFP-Protein ist klein genug, um in den Kern ohne Kernlokalisierungssignal diffundieren. Im Gegensatz dazu sind SEU-und LUH Zwei Arabidopsis Transkriptionsfaktoren zuvor gezeigt, dass in einem Hefe-Zwei-Hybrid-2 wechselwirken. SEU-pSPYNE (SEU, die N-terminale Fragment von YFP fusioniert) und LUH-pSPYCE (SEU, die N-terminale Fragment von YFP fusioniert), die beide zu groß, um in den Zellkern diffundieren, enthalten Kernlokalisierungssignale 2,5. Die YFP Fluoreszenz-Signal in die Zwiebel Zellkern (Abbildung 1 B, E) erkannt an, dass SEU-pSPYNE und LUH-pSPYCE kann in Zwiebel Kerne zu interagieren. Kein Fluoreszenzsignal ist in Zwiebeln mit Plasmid-Mischung aus Vektorplasmid pSPYNE mit der N-terminale Fragment von YFP und LUH-pSPYCE (Abbildung 1C, F) bombardiert erkannt.
Die BIFC-vermittelte YFP-Fluoreszenz ist deutlich schwächer als die GFP-vermittelte Fluoreszenz von der 35S:: GFP-Plasmid. In unserer Studie zeigten auch unterschiedliche subzelluläre Lokalisation (vgl. Abbildung 1A mit B). Darüber hinaus ist die Anzahl der fluoreszierenden Zellen signifikant niedriger BIFC, wie BIFC funktioniert nur, wenn beide Partner Plasmide erfolgreich und geben Sie in der gleichen Zwiebel-Zellen exprimiert.
Abbildung 1. Fluorescent (A, B, C) und Hellfeld (D, E, F) Bilder von Zwiebel-Zellen bombardiert mit verschiedenen Plasmid-Konstrukte. (A) und (D), bombardiert Onion Zellen mit 35S:: GFP. GFP diffundiert durch die Cytoplasma und Kern. (B) und (E), Zwiebel-Zellen mit gleichen molaren Mischungen von 35S bombardiert: SEU-pSPYNE (SEU, die N-terminale Fragment von YFP fusioniert) und 35S:: LUH-pSPYCE (LUH fusioniert mit dem C-terminalen Fragment ) Plasmid-DNA. Eine Wechselwirkung zwischen SEU-pSPYNE und LUH-pSPYCE wird von einem fluoreszierenden Kern dargestellt. (C) und (F), bombardiert Eine negative Kontrolle zeigt Zwiebel-Zellen mit Mischungen von Vektor pUC19-Spyne und LUH-pSPYCE plasmids. Keine Fluoreszenz-Signal erkannt wird.
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Discussion
- Bei erstmaliger Benutzung, empfehlen wir üben das gesamte Verfahren von Cartridge Vorbereitung auf Beobachtung, mit einem einzigen Plasmid konstitutiv Reporter wie 35S:: GFP oder 35S:: GUS. Wir verwendeten einen 35S:: GFP-Plasmid von Drs. erhalten. Steve Berg und Xiaoning Zhang 6 (Abbildung 1A, D). Das Gen Schuss Patronen, bei RioRad (Cat 165-2244) verkauft werden, sind nicht geeignet für Pflanzen.
- Für BIFC, wird eine zweite positive Kontrolle erforderlich, die sich von zwei bekannten Interaktionspartner, fusioniert mit dem C-terminalen und N-terminalen Fragmente von YFP bzw. bestehen.
- Für BIFC, ist es notwendig, mehrere Negativ-Kontrollen umfassen: (1) Protein X, die N-terminale Fragment von YFP plus ein Vektor-Codierung für die C-terminale Fragment fusioniert, (2) Protein Y die C-terminale Fragment von geschmolzenem YFP plus ein Vektor-Codierung für die N-terminale Fragment, (3) nur Vektor.
- Eine Streuscheibe kann auf der Basis der Helios Gene Gun Barrel verwendet werden, wenn der Schussabgabe, die zu Gewebeschäden reduzieren dient. In unserer Studie haben wir nicht die Streuscheibe.
- Während mikroskopische Betrachtung der YFP-Fluoreszenz durch BIFC, Belichtungszeit, um das Anregungslicht vermittelten sollte minimiert werden, um Ausbleichen zu reduzieren.
- Patronen in den Szintillationsgefäße Trockenmittel gelagert sind gut für mehrere Monate.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Drs. Steve Berg und Xiaoning Zhang für die 35S:: GFP pGlowbug konstruieren und die Hokensen Promotionsstipendium für CH Research in Z. L's Labor ist von der US National Science Foundation (IOB0616096 und MCB0744752) unterstützt. ZL wird teilweise durch die University of Maryland Agricultural Experiment Station unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yellow onion | Any Supplier | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
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