Summary
מאמר זה מדגים כיצד להשתמש נכון BioRad הליוס Gun ג'ין להציג פלסמיד דנ"א לתוך תאים אפידרמיס בצל ואיך לבדוק אינטראקציות בין חלבונים בתאים בצל מבוססת על העיקרון של השלמה Fluorescence bimolecular (BiFC)
Abstract
חקירת פונקציה הגן באורגניזמים שונים מסתמך על הידע של איך את המוצרים גן לתקשר אחד עם השני בסביבה הסלולר הרגיל שלהם. את הקרינה bimolecular השלמה (BiFC) Assay
Protocol
I. הכנה פלסמיד
ה-DNA פלסמיד המשמש הפגזה חייב להיות של טוהר גבוהה בריכוז של 500ng/μl או יותר. עבור BiFC הכולל שתי בונה פלסמיד, 25 מיקרוגרם של כל פלסמיד הוא זקוק. במילים אחרות, 1:01 יחס טוחנת של שני פלסמידים צריך להיות מעורב כדי להצמיח DNA 50 מיקרוגרם סך פלסמיד להכנת מחסניות. שימו לב כי הוספת ה-DNA יותר מ 50 מיקרוגרם עלול לגרום הצטברות של חלקיקי זהב יש להימנע. זמין מסחרית פלסמיד דנ"א ערכות חילוץ מומלץ לבודד DNAs פלסמיד.
וקטורי פלסמיד צריך להיות קטן יחסית בגודל כגון pUC19. אנו משובטים שאו ו LUH cDNA לתוך pUC19-SPYNE ו-pUC19 SPYCE, בהתאמה 3. וקטורים בינאריים לשינוי Agrobacterium בתיווך הם גדולים מדי ובלתי הולם עבור ההפצצה.
השנייה. דיו הכנה
הכנת דיו כרוך ציפוי זהב חלקיקים עם DNA פלסמיד והעמיסו אותם לתוך צינורות הפלסטיק נחתך לאחר מכן לתוך חצי חתיכות ארוכות אינץ', אשר ניתן להטעין את האקדח בעלי הגן מחסנית. הכנה מחסנית מתואר בפרטים גדול במאמר נפרד יופיטר 4 ועל כן לא המתוארת כאן. עבור הפגזה של תאים בצל, מומלץ לערבב 50 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד עם 12.5 מ"ג של חלקיקי זהב בכל הכנות, אשר מניב כ - עד 50 מחסניות ב 1 מיקרוגרם DNA/0.25 מ"ג זהב / מחסנית. מחסנית עבור כל ירייה אחת. חלקיקי זהב יכול להיות 0.6 מיקרומטר או 1.0 מיקרומטר קוטר (# חתול 1652262 או חתול # 1652263; Biorad). כמו כן, אנו ממליצים להשתמש 0.5 מ"ג / מ"ל PVP פתרון להכנת מחסנית. עבור BiFC, לשלב בין שתי DNAs פלסמיד של כל אחד מבני הזוג אינטראקציה המשוערת בהכנת מחסנית אותו.
לאחר הכנה מחסנית, חשוב לבחון את מחסניות באמצעות ירי מכלי עשה לאחרונה בלחץ הליום בין 150-200 psi Parafilm לתוך ריבוע כי הוא כרוך סביב בצלחת פטרי. זה יהיה המבחן אם חלקיקי זהב יכול להיות מונעת ביעילות מחסניות, אתה אמור לראות את חלקיקי זהב קלוש על Parafilm. זה נותן לך מושג בתחום כי כל ירייה יכסה. ניתן להבחין כמויות שונות של חלקיקי זהב מונעת על Parafilm בלחצים הליום שונים (בטווח 150-200 psi). אם אין הבדל משמעותי, לבחור את הלחץ נמוך יותר הפגזה.
ג. בצל רקמות הכנת
ביום הירי, לקלף את העור החיצונית של בצל צהוב גדול. באמצעות סכין גילוח נקי וחד, לחתוך 4-5 שכבות עמוקות שטח מלבני של כ - 2 X 8 ס"מ. קח את רקמת בצל מלבני, לבטל את שתי השכבות החיצוניות, לחתוך את שכבות הבצל הנותר לתוך כ 2X1.5 ס"מ חתיכות. מניחים את חתיכות הבצל בצלחת פטרי המכילות נייר פילטר (נייר Whatman 3mm וחותכים עיגולים) טבולה במים סטריליים. מכסים את צלחת פטרי והם מוכנים ללכת.
IV. הפצצה
- טען את המחסניות לתוך מחזיקי לבן מיכל עגול. מחסניות בונה פלסמיד המכיל שונים יש לטעון לתוך מחזיקי מחסנית שונים. כל בעל מחסנית יכול להכיל עד 12 מחסניות 12 יריות.
- הכנס את הסוללה ואת אניה חבית טרי לתוך Gun הליוס ג'ין. ודא כי הן את אניה חבית את האקדח יש בהתאמה O-טבעות המצורפת.
- ראשית, להוסיף בעל מחסנית אקדח ריק לתוך הגן, עם סימן # 12 על בעל מחסנית מול החלק העליון של האקדח. מחסנית בעל Advance פעם או פעמיים כדי לוודא שהוא מוכנס כהלכה.
- צרף אקדח למיכל הליום ולהתאים את הלחץ בין 150-200 psi.
- לבשי הגנה האוזן אקדח אש כמה פעמים עם בעל מחסנית ריקה לנקות את החדר של האקדח ואת לוודא כי הלחץ הוא יציב.
- הסר את בעל מחסנית ריקה להוסיף בעל מחסנית טעונה. מתקדם בעל מחסנית כך מחסנית אתה רוצה אש ממוקם בתחתית (06:00) של בעל מחסנית. קליעה חתיכת בצל כאן מספק סוג של שליטה שלילי הקרינה רקע.
- מניחים חתיכות בצל באמצע צלחת פטרי ריקות עם השכבה הפנימית ביותר של בצל פונה כלפי מעלה. מנוחה אניה קנה האקדח של הגן על צלחת פטרי ואש את האקדח על ידי לחיצה רצופה על כפתור בצד בזמן על ההדק. מעבירים את הבצל מופצצים כדי בצלחת פטרי לחות המכיל מסנן נייר 3mm.
- מראש על המחסנית הבא ואש חתיכת בצל שונים. חזור על שלב זה עד 4-5 פיסות של בצל נורים. כל תכשיט בצל הוא ירה פעם אחת.
- שנה לבעל מחסנית שונה עמוסה מחסניות המכילות שילוב שונה פלסמיד פלסמיד או אחרת. זכור לשנות את אניה לחביתזה גם על מנת למנוע זיהום. תירה 4-5 חתיכות בצל.
- לאחר ההפצצה, להחזיר את כל הבצל עד מנות perti. מכסים את צלחות פטרי עם מכסים. לעטוף אותם עם Parafilm כדי למנוע התייבשות. דגירה חתיכות בצל בטמפרטורת החדר בחושך במשך 16-48 שעות.
- כבה את לחץ הגז ולשחרר את האקדח לפני ניתוק גן מהטנק הליום. פרקו את אניה לחבית, ולהסיר את בעל מחסנית של מחסניות בשימוש (או משומש).
- ניקוי מחסנית בעלי ספינות חבית על ידי השריית אותם בכוס עם מים וסבון. מניחים את כוס ב sonicator אמבטיה sonicate במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף אותם במים כדי להסיר את כל שאריות הסבון. משרים אותם אתנול 70% למשך שעה ולאחר מכן לייבש אותם על מגבות נייר.
V. תצפית
- לאחר דוגרים חתיכות בצל מופגז במשך 16-20 שעות בטמפרטורת החדר, אנו יכולים לצפות GFP או YFP הקרינה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כגון Axio Zeiss Observer.z1 השתמשו במחקר זה.
- השתמש מלקחיים עם קצוות שטוחים לאט לקלף שכבה תא בודד את האפידרמיס הפנימית של הבצל (השכבה ישירות הפנים את האקדח במהלך ההפצצות). מניחים את קליפות על טיפת מים בשקופית. הוסף coverslip אבל להיזהר כדי למזער את הבועות.
- תחת שדה בהיר של המיקרוסקופ, בדוק תחילה להזרמת cytoplasmic על מנת להבטיח כי התאים הם בחיים. כדי לעשות זאת, לחשוף את השקופית האור בשדה בהיר במשך כמה דקות כדי לחמם את רקמות בצל ואז לחפש plastids נעים. הזרמת cytoplasmic לא תמיד קל לראות, אז אל תתייאש אם אתה לא רואה שום.
- לגילוי פלואורסצנטי, השתמש עירור מתאים ומסננים גילוי ה-GFP או YFP. חשוב לכלול בקרות שליליות כגון חתיכות בצל עם זריקה שאינה פלורסנט פלסמיד. אותות צהוב קלוש להופיע מתאי פצועים, בועות אוויר, או פסולת. חשוב גם לכלול שולטת חיובית. כתב פלסמיד המכיל הביעו פלורסנט constitutively כגון 35S:: ה-GFP הוא פקד חיובי מעולה. אותות ה-GFP Visible מתאי אפידרמיס הבצל (איור 1 א, ד) ציינו כי מחסניות, הרקמות בצל, ירי אקדח גנים מוכנים כהלכה והוצאו להורג. בהמשך, צפינו אינטראקציות בין שאו-pSPYNE ו-LUH pSPYCE לחתיכות בצל מופגזים מחסניות המכילות תערובת של 35S:: שאו pSPYNE ו-35S:: LUH-pSPYCE DNAs. קלוש הקרינה YFP נצפתה גרעין בלבד (איור 1 B, E), המציין את האינטראקציה פיזי ישיר בין שאו ו LUH שהביא את שברי YFP לפצל יחד בגרעין. שים לב כי האות YFP מ BiFC הוא חלש יותר באופן משמעותי האות ה-GFP מן 35S:: ה-GFP.
נציג תוצאות
במחקר שלנו דיווחו כאן, 35S:: שליטה GFP חיובי פלסמיד פולט הקרינה חזקה הממלא את התא כולו, כולל בגרעין והן בציטופלסמה (איור 1 א, ד). חלבון ה-GFP הוא קטן מספיק כדי לנטרל לתוך הגרעין ללא לאות לוקליזציה גרעיני. לעומת זאת, שאו ו LUH שני גורמים תעתיק ארבידופסיס הראו בעבר לתקשר בשמרים שני היברידית assay 2. שאו-pSPYNE (שאו התמזגו שבר N-הטרמינל של YFP) ו-LUH pSPYCE (שאו התמזגו שבר N-הטרמינל של YFP), הן גדולות מדי מפוזר לתוך הגרעין, מכילים אותות לוקליזציה גרעיני 2,5. אות ניאון YFP זוהה בגרעין התא בצל (איור 1 B, E) עולה כי שאו-pSPYNE ו-LUH pSPYCE יכולים לקיים אינטראקציה בגרעין בצל. אות לא פלורסנט מזוהה בצל מופגזים תערובת של pSPYNE וקטור פלסמיד פלסמיד המכיל את שבר N-מסוף של YFP ו-LUH pSPYCE (תרשים 1C, F).
הקרינה BiFC בתיווך YFP משמעותית חלש יותר הקרינה GFP בתיווך מן 35S:: GFP פלסמיד. במחקר שלנו, הם גם הראו לוקליזציה subcellular שונים (איור 1A להשוות עם B). בנוסף, את מספר התאים פלורסנט נמוך באופן משמעותי עבור BiFC, כמו BiFC פועל רק כאשר שני פלסמידים שותף בהצלחה להיכנס באים לידי ביטוי בתאי הבצל זהה.
באיור 1. מופגז פלורסנט (A, B, C) שדה בהיר (D, E, F) תמונות של תאים בצל עם בונה פלסמיד שונה. (א) ו - (ד), תאים בצל מופגזים 35S:: ה-GFP. GFP מפזרת ברחבי הציטופלסמה לבין הגרעין. (ב) ו - (ה), תאים בצל מופגזים מתערבב טוחנת שווה 35S:: שאו-pSPYNE (שאו התמזגו שבר N-הטרמינל של YFP) ו 35S:: LUH-pSPYCE (LUH התמזגו שבר בטרמינל C- ) פלסמיד דנ"א. האינטראקציה בין שאו-pSPYNE ו-LUH pSPYCE מוצג על ידי גרעין ניאון. (ג) ו - (F), פקד שלילי מראה תאים בצל מופגזים תערובות של וקטור pUC19-SPYNE ו-LUH pSPYCE plasmiDS. אות לא פלורסנט מזוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
- עבור משתמשים בפעם הראשונה, מומלץ לתרגל את ההליך כולו, מתוך הכנה מחסנית אל תצפית, עם כתבת אחת מכוננת פלסמיד כגון 35S:: GFP או 35S:: גאס. השתמשנו 35S:: GFP פלסמיד המתקבל בני הזוג. סטיב הר Xiaoning אנג 6 (איור 1 א, ד). ירו גן לשלוט מחסניות נמכר RioRad (חתול 165-2244) אינם מתאימים לצמחים.
- עבור BiFC, שליטה חיובית השני הוא הכרחי, שאמור לכלול שני השותפים באינטראקציה ידוע התמזגו השברים בטרמינל C-N-מסוף של YFP, בהתאמה.
- עבור BiFC, יש צורך לכלול שולטת שלילי מספר: (1) X חלבון התמזגו שבר N-הטרמינל של YFP בתוספת וקטור המקודד שבר בטרמינל C-, (2) חלבון Y התמזגו שבר בטרמינל C-של YFP בתוספת וקטור המקודד שבר N-המסוף; (3) וקטור בלבד.
- מסך דיפוזיה ניתן להשתמש על בסיס של חבית הליוס Gun ג'ין כאשר יורים את הירייה, אשר משמש כדי להפחית נזק לרקמות. במחקר שלנו, אנו לא להשתמש במסך דיפוזיה.
- במהלך הצפייה מיקרוסקופית של YFP הקרינה בתיווך BiFC, זמן החשיפה לאור עירור צריך להיות ממוזער כדי להפחית צילום הלבנה.
- מחסניות מאוחסנים צלוחיות scintillation המכיל desiccants טובים במשך כמה חודשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים בני הזוג. סטיב הר Xiaoning ז'אנג עבור 35S:: GFP pGlowbug לבנות את האחווה Hokensen דוקטורט כדי CH מחקר במעבדה צ's L'נתמכת על ידי המוסד האמריקני למדע (IOB0616096 ו MCB0744752). ZL נתמך בחלקו על ידי האוניברסיטה של מרילנד תחנת ניסוי חקלאי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yellow onion | Any Supplier | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
