Summary
이 문서는 제대로 BioRad는 양파 표피 세포에 플라스미드 DNA을 소개하는 진 건 헬리 우스 및 Bimolecular 형광 Complementation의 원칙 (BiFC)를 기반으로 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 테스트를 사용하는 방법을 보여줍니다
Abstract
다양한 생물의 유전자 기능을 조사 유전자 제품들이 정상 세포 환경에서 서로 상호 작용하는 방법에 대한 지식에 의존하고 있습니다. Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이
Protocol
I. 플라스미드 준비
폭격에 사용되는 플라스미드 DNA는 고순도 및 500ng/μl 이상의 농도에 있어야합니다. BiFC 두 플라스미드 구조를 포함한 각 플라스미드 25 μg이 필요합니다. 즉, 두 plasmids의 1시 1분 어금니 비율은 카트리지의 준비 50 μg 총 플라스미드 DNA을 일으키다로 혼합한다. 50 μg 이상의 DNA를 추가하면 황금 입자의 응집을 일으킬 수 있으며 피해야한다고 염두 수 있습니다. 상용 플라스미드 DNA 추출 키트 플라스미드 DNAs를 분리 권장됩니다.
플라스미드 벡터는 pUC19와 같은 크기가 비교적 작은되어야합니다. 우리는 겁쟁이와 LUH 각각 3 pUC19 - SPYNE와 pUC19 - SPYCE로 cDNA를 복제. Agrobacterium - 중재 변환에 대한 바이너리 벡터가 너무 큽니다과 폭격에 대한 부적 절한 있습니다.
II. 카트리지 준비
카트리지 준비는 플라스미드 DNA와 이후 유전자 총 카트리지 홀더에 로드할 수 있습니다 이분의 일 인치 긴 조각으로 절단 플라스틱 튜브로 그들을 로딩과 코팅 골드 입자를 포함한다. 카트리지 준비는 별도의 조브 기사 4 훌륭한 세부 사항에서 설명하기 때문에 여기서 설명하지 않습니다. 양파 세포의 충격을 위해, 우리는 1 μg DNA/0.25 MG 골드 / 카트리지 50 카트리지에 대해 최대 산출 준비 당 금 입자의 12.5 MG와 플라스미드 DNA 50 μg을 혼합하는 것이 좋습니다. 각 카트리지는 한 번에입니다. 금 입자는 0.6 μm의 또는 직경 1.0 μm의 (; Biorad 고양이 # 1652262 또는 고양이 # 1652263) 중 하나가 될 수 있습니다. 우리는 또한 카트리지 준비 0.5 MG / ML PVP 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. BiFC 들어, 동일한 카트리지 준비의 각 putative 상호 작용하는 파트너의 두 플라스미드 DNAs를 결합.
카트리지 준비 후 페트리 접시 감싸있는 사각형 Parafilm에 150-200 PSI 사이의 헬륨 압력에서 새로 만들어진 카트리지를 발사하여 카트리지를 테스트하는 것이 중요합니다. 황금 입자가 카트리지에서 효율적으로 추진 될 수있다면 이것은 테스트 않으므로 Parafilm에 희미한 금 입자를 볼 수 있습니다. 이것은 각 방 표지 것이라는 지역의 아이디어를 제공합니다. 당신은 다른 헬륨 압력 (PSI 150-200 범위에서)에서 Parafilm에 추진 황금 입자의 서로 다른 양의있을 수 있습니다. 더 큰 차이가 없다면, 폭격에 대한 낮은 압력을 선택합니다.
III. 준비 양파 조직
촬영 당일, 대형 노란 양파의 표피에서 껍질. 깨끗하고 날카로운 면도날을 사용하여 깊이 약 2 X 8cm의 사각형 영역을 4-5 레이어를 잘라. , 직사각형 양파 조직을 꺼내서 바깥 두 레이어를 삭제, 2X1.5 약 cm의 조각으로 양파의 나머지 레이어를 잘라. 여과지 (왓먼 3MM 종이가 빙빙로 상처)이있는 페트리 접시에 양파 조각을 장소 멸균 물 moistened. 페트리 접시를 커버하고 그들은 갈 준비가 된 것입니다.
IV. 충격
- 흰색 라운드 카트리지 홀더에 카트리지를로드합니다. 다른 플라스미드 구조를 포함하는 카트리지는 다른 카트리지 홀더에로드해야합니다. 각 카트리지 홀더 12 장면 12 카트리지까지 저장할 수 있습니다.
- 헬리 우스 진 건에 배터리와 신선한 배럴 라이너를 삽입합니다. 총신 라이너와 총을 모두 붙어 O - 링 각을 가지고 있는지 확인합니다.
- 첫째, 총 상단 직면하고있는 카트리지 홀더에 마르크 # 12, 유전자 총에 빈 카트리지 홀더를 삽입합니다. 사전 카트리지 홀더가 한 두번이 올바르게 삽입되었는지 확인합니다.
- 헬륨 탱크에 총을를 첨부 150-200 PSI 사이의 압력을 조정합니다.
- 총 상공 회의소를 청소하고 압력이 안정되어 있는지 확인하기 위해 빈 카트리지 홀더와 귀 보호 및 화재 총 몇 번 착용하십시오.
- 빈 카트리지 홀더를 제거하고 로드된 카트리지 홀더를 삽입합니다. 해고하고자하는 카트리지는 카트리지 홀더의 (시, 6) 하단에 위치되도록 카트리지 홀더 사전. 여기에 양파 조각을 촬영하면 배경 형광에 대한 부정적인 통제의 형태를 제공합니다.
- 최대 직면하고있는 양파의 내부 대부분의 레이어와 빈 페트리 접시의 중앙에 양파 조각을 놓으십시오. 페트리 접시에서 유전자 총을의 배럴의 라이너를 휴식과 방아쇠 당기는 동안 사이드 버튼을 누른하여 총을 발사. 촉촉한 3MM 여과지를 포함하는 페트리 접시에 포격 양파를 전송합니다.
- 다음 카트리지에 미리와 다른 양파 조각을 해고. 양파의 4-5 조각이 총에 때까지이 단계를 반복합니다. 각 양파 조각이 총을 한 방입니다.
- 다른 플라스미드 또는 다른 플라스미드 조합을 포함하는 카트리지와 함께 로드된 다른 카트리지 홀더로 변경합니다. 배럴 라이너를 변경하는 것을 잊지S는 잘 오염을 방지하기 위해. 4-5 양파 조각을 쏴.
- 충격 후, perti 요리에 대한 모든 양파를 반환합니다. 뚜껑있는 페트리 접시를 커버. 건조 방지하기 Parafilm으로 그들을 바꿈. 16~48시간 동안 짙은 어둠 속에서 실온에서 양파 조각을 품어.
- 헬륨 탱크에서 유전자 총을 분리하기 전에 가스 릴리스 압력을 해제합니다. 돌려서 배럴 라이너, 그리고 카트리지 홀더 및 (또는 미사용) 사용 카트리지를 제거합니다.
- 비눗물로 비커에서 그들을 잠수함이 잠수하여 카트리지 홀더 및 배럴 라이너 청소. 목욕 sonicator에 비커를 놓고 20 분 동안 sonicate. 그 후, 모든 비누 잔류물을 제거하기 위해 물로 그들을 씻어. 시간 동안 70 % 에탄올에서 그들을 만끽하고 종이 타올에 올려 건조.
V. 관측
- 상온에서 16-20시간에 대한 폭격 양파 조각을 잠복기 후에, 우리는이 연구에 사용되는 등 자이스 혈구 Axio Observer.z1로 형광 현미경을 사용하여 GFP 또는 YFP 형광을 관찰할 수 있습니다.
- 천천히하는 양파의 내부 표피 (직접 폭격하는 동안 총을 얼굴 레이어)에서 단세포 층 평면 껍질 끝을와 집게를 사용하십시오. 슬라이드에 물 한 방울로 껍질을 놓으십시오. coverslip을 추가하지만 거품을 최소화하기 위해주의하십시오.
- 현미경의 밝은 분야에서 먼저 세포가 살아 있도록 세포질 스트리밍을위한 확인하십시오. 이렇게하려면, 이동 plastids 찾는 다음 양파 조직을 따뜻하게하는 데 몇 분 동안 명시야 조명에 슬라이드를 노출합니다. 세포질 스트리밍보고 항상 쉽지 않다, 그래서 당신은 아무것도 볼 수 없다면 낙담하지 마세요.
- 형광 검출을위한 적절한 여기와 GFP 또는 YFP에 대한 검색 필터를 사용합니다. 이러한 아닌 형광 플라스미드로 촬영 양파 조각과 같은 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 희미한 노란색 신호 부상 전지, 공기 방울, 또는 파편으로부터 나타날 수 있습니다. 긍정적인 컨트롤을 포함하는 것도 중요합니다. 같은 35S 같은 플라스미드가 포함된 constitutively 표현 형광 기자 : GFP는 훌륭한 긍정적인 컨트롤입니다. 양파 표피 세포 (그림 1A, D)에서 볼 수 GFP 신호는 카트리지, 양파 조직 및 유전자 총기 발사가 제대로 준비하고 실행하는 지적했다. : 겁쟁이 - pSPYNE 및 35S : : : LUH - pSPYCE의 DNAs 이후, 우리는 35S의 혼합물을 포함하는 카트리지 공세 양파 조각에 겁쟁이 - pSPYNE 및 LUH - pSPYCE 사이의 상호 작용을 관찰했다. 희미한 YFP의 형광이 핵에 함께 분할 YFP의 조각을 가져 겁쟁이와 LUH 사이의 직접적인 물리적 상호 작용을 나타냅니다 (그림 1 B, E) 만 핵에서 관찰되었다. : GFP : BiFC에서 YFP 신호가 35S에서 GFP 신호보다 훨씬 약한입니다.
대표 결과
우리의 연구에서, 여기 35S보고 : 플라스미드 GFP 긍정적인 컨트롤에서 핵 및 세포질 (그림 1A, D)을 모두 포함한 전체 세포를 채우고 강한 형광을 제공합니다. GFP 단백질은 핵 지방화 신호없이 핵에 확산 정도로 작습니다. 대조적으로, 겁쟁이와 LUH 이전 두 하이브리드 분석 2 누룩에 상호 작용하는 그림이 Arabidopsis transcriptional 요인입니다. 겁쟁이 - pSPYNE (겁쟁이가 YFP의 N - 터미널 파편 융합)와 LUH - pSPYCE (겁쟁이가 YFP의 N - 터미널 파편 융합), 핵에 확산 핵 지방화 신호에게 2,5를 포함 모두 너무 큽니다. 양파 세포 핵 (그림 1 B, E)에서 검색된 YFP 형광 신호는 겁쟁이 - pSPYNE 및 LUH - pSPYCE은 양파의 핵으로 상호 작용할 수 있음을 나타냅니다. 아무 형광 신호가 YFP 및 LUH - pSPYCE (그림 1C, F)의 N - 터미널 조각을 포함하는 플라스미드 벡터 pSPYNE의 플라스미드 혼합 공세 양파를 감지하지 않습니다.
BiFC - 중재 YFP의 형광은 35S에서 GFP - 중재 형광보다 훨씬 약한입니다 : : GFP 플라스미드. 우리의 연구에서, 그들은 또한 (B와 그림 1A 비교) 다양한 subcellular 지방화을 보여주었다. 두 파트너 plasmids이 성공적으로 입력하고 같은 양파 세포에서 표현하는 경우 BiFC에만 작동하기 때문에 또한, 형광 세포의 숫자는 BiFC에 대해 상당히 낮습니다.
그림 1. 형광등 (A, B, C)과 명시야 (D, E, F) 양파 세포의 이미지는 다른 플라스미드 구조 공세. (A)와 (D), 양파 세포는 35S 공세 : : GFP. GFP는 세포질과 핵 밖으로 diffuses. (B)와 (E), 양파 세포는 35S 동등한 어금니 믹스 공세 : 겁쟁이 - pSPYNE (겁쟁이가 YFP의 N - 터미널 파편 융합)와 35S : LUH - pSPYCE (LUH는 C - 말단 조각을 융합 ) 플라스미드 DNA. 겁쟁이 - pSPYNE 및 LUH - pSPYCE 간의 상호 작용은 형광등 핵으로 표시됩니다. (C)와 (F), 양파 세포를 보여주는 부정적인 제어 벡터 pUC19 - SPYNE 및 LUH - pSPYCE plasmi의 믹스 공세DS. 아무 형광 신호가 감지되지 않습니다.
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Discussion
- : GFP 또는 35S : : : 거스 처음 사용자를 위해, 우리는 35S와 같은 하나의 플라스미드 제정 기자와 카트리지 준비에서 관찰하는 전체 절차를 연습하는 것이 좋습니다. 우리는 35S 사용 : 플라스미드 GFP는 DRS 얻은. 스티브 마운트 및 Xiaoning 장 6 (그림 1A, D). RioRad (CAT 165-2244)에서 판매하고 유전자 촬영 제어 카트리지 공장에 적합하지 않습니다.
- BiFC 들어, 두 번째 긍정적인 제어가 각각 YFP의 C - 터미널과 N - 터미널 조각 융합이 알려진 상호 작용하는 파트너로 구성해야하는, 필요합니다.
- BiFC 들어, 몇 가지 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 필요합니다 : (1) 단백질의 X는 YFP의 N - 터미널 조각 플러스 C - 말단 조각에 대한 코딩 벡터로 융합, (2) 단백질 Y가의 C - 말단 조각을 융합 YFP 플러스 N - 말단 조각에 대한 코딩 벡터는, 전용 (3) 벡터.
- 조직 손상을 줄이기 위해 제공하는 기회를 발사하면 확산 화면이 헬리 우스 진 건 바렐의 기초에 사용할 수 있습니다. 우리의 연구에서는, 우리는 확산 화면을 사용하지 않았다.
- BiFC, 여기 불빛에 노출 시간에 의해 중재 YFP 형광 현미경 보는 동안 표백 사진을 줄이기 위해 최소화되어야합니다.
- desiccants를 포함하는 섬광 유리병에 저장된 카트리지 몇 달 동안 좋다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 DRS 감사합니다. 35S에 대한 스티브 마운트 및 Xiaoning 장 : GFP pGlowbug 구조 Z. L'의 실험실에서 CH 연구에 Hokensen 박사 원정대는 미국 국립 과학 재단 (IOB0616096 및 MCB0744752)에 의해 지원됩니다. ZL는 부분적으로 메릴랜드 농업 실험 역 대학에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yellow onion | Any Supplier | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
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