Analyse de l'expression génique dans l'agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

Summary

Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) est un outil efficace pour diagnostiquer les niveaux d'ARNm dans les tissus des insectes et des stades de développement. Dans ce rapport, nous montrons l'utilisation de qRT-PCR pour déterminer les niveaux d'ARNm dans différents tissus des larves et les stades de développement de l'espèce d'insecte invasif, l'agrile du frêne.

Abstract

L'agrile du frêne (AF,

Protocol

Le protocole complet avec les différentes étapes est représenté dans l'organigramme de la figure 1. Étapes individuelles constituant dissection, extraction d'ARN, synthèse du premier brin d'ADNc et QRT-PCR sont détaillées ci-dessous.

I. Dissection des larves

1. Avant le début de cette procédure, l'agrile du frêne émeraude lieu, ou l'agrile du frêne, de larves sur du papier absorbant humide jusqu'à ce que les dissections sont réalisées. Gardez fraîchement préparés phosphates 1X saline tamponnée, ou PBS, sur la glace pour garder le froid à travers la dissection de tampon.
2. Pour commencer, fixer les larves EAB sur la plaque de dissection avec des épingles de dissection fine. Ensuite, ajoutez à froid du PBS 1X à la plaque de dissection.
3. Tout d'abord, de décapiter les larves avec une belle paire de ciseaux de dissection. Par la suite supprimer le dernier segment abdominal de la larve.
4. En utilisant une paire de forceps horloger, soulèvent la cuticule des larves de la carcasse. Ensuite, faire une incision sur toute la longueur de la carcasse à l'aide d'une paire de ciseaux. Prenez soin de ne pas rompre l'intestin que l'incision est faite.
5. Soigneusement isoler les tissus de l'intestin moyen d'autres tissus tels que les organismes de graisse et de tissu conjonctif. Ensuite, rincer le tissu dans l'eau douce 1X tampon PBS afin d'assurer qu'il n'y ait pas de contamination de fatbody. Transfert de l'intestin moyen isolé à 500 pi de pré-réfrigérée réactif Trizol dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.
6. Ensuite, d'isoler le tissu de graisse du corps en utilisant une pince et le transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 500 ul de réactif Trizol réfrigérée.
7. Enfin, isoler le tissu cuticule des larves de la carcasse par voie de démolition hors tout tissu adhérant, en prenant soin de ne pas endommager l'intégrité des tissus. Rincez le tissu cuticules isolées dans l'eau douce du tampon PBS et le transférer dans un tube de 1,5 ml Eppendorf avec 500 uL de réactif Trizol réfrigérée.
8. Les isolés graisses des tissus du corps, cuticule et l'intestin moyen peut être conservé à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ARN.
9. En préparation pour l'extraction d'ARN, de trier les échantillons EAB différents selon les stades de développement. Ces étapes comprennent 1re, 2e, 3e et 4e stades larvaires, prénymphes et les adultes.

II. Extraction des ARN (comme le protocole du fabricant pour l'utilisation de s réactif Trizol)

Homogénéisation

1. Pour commencer l'extraction d'ARN, la première utilisation de pilons en plastique afin d'homogénéiser les tissus dans le Trizol contenant tubes Eppendorf de 1,5 ml. Après homogénéisation, porter le volume total de chaque échantillon ML à1 avec le réactif Trizol.
2. Pour les stades de développement, d'homogénéiser l'ensemble des animaux dans l'azote liquide avec un mortier et un pilon. Puis ajoutez une aliquote de l'homogénat (50 ug) à 1 ml de Trizol.

Séparation de phases:

3. Incuber les tubes d'échantillon avec 1 ml Trizol pendant 15 minutes à température ambiante.
4. Après incubation, ajouter 200 ul de chloroforme dans chaque tube. Immédiatement après l'ajout de chloroforme, agiter le tube vigoureusement pendant environ 15 secondes. Puis, incuber les tubes à température ambiante pendant une 2-3 minutes supplémentaires.
5. Ensuite, centrifuger les échantillons à 12.000 xg pendant 15 minutes à 2 ° C. Après centrifugation, l'ARN sera dans la phase aqueuse. Le volume de la phase aqueuse devrait être de 600 pi, soit 60% du volume total de Trizol.

ARN précipitations

6. Retirez soigneusement que la phase aqueuse. Présence de substances en dessous de la phase aqueuse provoque la contamination de l'ARN extrait. Ensuite, le transfert de la phase aqueuse dans un tube convenablement étiquetés Eppendorf de 1,5 ml.
7. Pour précipiter les ARN à partir de la phase aqueuse, mélanger 0,5 mL d'alcool isopropylique à chaque tube. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Après l'incubation, centrifuger les tubes à 12 000 xg pendant 10 minutes à 2 ° C.

Laver l'ARN

8. Après la centrifugation, éliminer le surnageant des tubes. L'ARN est présente dans le culot gélatineux formé au fond du tube. Laver le culot avec de l'éthanol à 75%, en ajoutant au moins 1 mL d'éthanol à 75% pour 1 ml de Trizol. Mélanger au vortex. Puis, centrifuger les tubes à 7500Xg pendant 5 minutes à 2 ° C.

ARN élution

9. Jeter le surnageant des tubes. Centrifuger les tubes à nouveau dans la centrifugeuse petite table pendant 1 minute. Retirez tout excès de surnageant du tube par pipetage prudent. Laisser le tube ouvert et laissez l'air granulés secs pendant 5-10 minutes. Soyez prudent de ne pas trop sécher les granulés car cela réduira considérablement sa solubilité.
10. Après séchage à l'air, resuspendre le culot dans diéthylpyrocarbonate ou DEPC, l'eau traitée. La quantité d'eau utilisée pour resuspendre le culot va dépendre de la taille de la pastille. Utiliser 50 uL d'eau traitée au DEPC pour un smtous les granulés ou 100 uL d'une boulette de gros. Laissez le culot dissoudre complètement dans l'eau traitée au DEPC en déplaçant la pointe de la pipette de haut en bas plusieurs fois.
11. Une fois le culot est dissous, placer l'échantillon à 55 ° C pendant 10 minutes.
12. Ensuite, mesurer la concentration de chaque échantillon d'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre Nanodrop (2 pl de l'échantillon d'ARN).
13. Stocker les échantillons d'ARN à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

III. Premier brin d'ADNc de synthèse (comme le protocole du fabricant s en utilisant SuperScript trousse de premiers brins de synthèse par Invitrogen).

1. Pour chaque échantillon d'ARN ajoutez la ligne suivante dans un tube PCR:

   ARN	ul x
   10 mM dNTP mélange M	1 microlitre
   Oligo (dT) (0,5 pg / pl)	1 pl
   L'eau traitée au DEPC	(8-x) ul
   Volume total:	10 ul
   Remarque: x est le volume de l'ARN utilisé pour la synthèse de l'ADNc. Selon la concentration de l'ARN, 2-3 ug d'ARN sera utilisé pour chaque réaction et le volume total de chaque réaction devrait être de 10 pi.

2. Placer le mélange réactionnel ci-dessus dans un thermocycleur à 65 ° C pendant 4 minutes.
3. Retirer les tubes de la theromocyler et les placer sur la glace immédiatement pendant au moins 2 minutes.
4. Préparer le premier brin master mix en ajoutant les éléments suivants:

   10X tampon RT	2μl
   25mM MgCl 2	4 pl
   DTT 0,1 M	2 pl
   RNase hors	1 pl

5. Ajouter 9 ul de mélange maître à chaque tube contenant l'échantillon d'ARN, mélanger en pipetage et centrifuger brièvement le mélange.
6. Placer les tubes de retour dans le thermocycleur et incuber pendant 2 minutes à 42 ° C.
7. Pause le thermocycleur et ajouter 1 l de Superscript II transcriptase inverse (Invitrogen) à chaque tube. Cette étape doit être fait rapidement.
8. Incuber les échantillons à 42 ° C pendant 1,5 heures.
9. Terminer la réaction à 70 ° C pendant 15 minutes.
10. Retirer les tubes du thermocycleur et les placer sur la glace.
11. Ajouter 1 pl de RNase H pour chaque tube et les replacer dans le thermocycleur à 37 ° C pendant 20 minutes.
12. Après le prélèvement des échantillons de la thermocycleur, ajouter 20 ul d'eau sans nucléase dans chaque tube. Le volume de chaque échantillon est doublé à ce stade.
13. Vérifiez la concentration de chaque échantillon en utilisant 2 pl de l'échantillon. Prenez aliquote de chaque échantillon, pour faire de la concentration de 20ng/μl pour une utilisation dans qRT-PCR. La quantité d'eau pour compenser les échantillons à une concentration de 20ng/μl dépendra de la concentration initiale de l'ADNc synthétisé.

IV. qRT-PCR:

Conception d'amorce et détermination du gène de référence

1. Amorces Design avec une température de fusion (Tm) de 60 ° C et une taille de produit de ~ 100 pb.
2. AP-PERI1 est utilisé comme le gène d'intérêt pour cette expérience. Un gène de référence ou de contrôle interne est nécessaire pour une analyse ultérieure et la normalisation des données. Protéine ribosomique (AP-RP1) est utilisé comme gène de référence pour cette expérience.
3. Préparer 5um stocks d'exploitation des amorces qui seront utilisées, y compris votre gène de référence.

Préparation des normes

4. Afin de calculer l'efficacité des amorces utilisées normes doit être faite.
5. Faites un mélange de l'ADNc à partir des différents échantillons qui seront testés.
6. Faire des dilutions en série 5X pour chaque point désiré dans le graphique. Quatre dilutions devrait être suffisant, mais cinq sont fortement recommandés.
7. Le volume varie en fonction du nombre de points et combien reproduit techniques sont utilisées. Il devrait être assez pour faire une norme pour chaque gène testé, y compris le gène de référence.

Modèle plaque

8. Conception d'un modèle indiquant le nom de l'échantillon pour chaque puits de la plaque qRT-PCR. N'oubliez pas d'inclure des normes pour chaque gène et au moins deux techniques répétitions par échantillon.

Définissez les paramètres du vélo

9. Mettez la machine qRT-PCR et entrer les paramètres du vélo. Les paramètres du vélo pour cette expérience est la suivante:
   Etape 1:
   • 1 cycle: 95 ° C 3 min
   Étape 2:
   • 40 cycles: 95 ° C 15 sec suivie par 60 ° C 30 sec
     (Facultatif: pour déterminer la courbe de fusion comprennent les étapes suivantes)
   Étape 3:
   • 1 cycle: 95 ° C 1 min
   Étape 4:
   • 1cycle: 55 ° C 1 min
   Étape 5:
   • 81 cycles: 55 ° C 30 sec

Plaque mis en place pour CFX96 (BioRad) machine

11. Préparer le mélange maître pour chaque gène (y compris le gène de référence) dans un tube séparé. Pour chaque puits, le master mix se compose de

    Eau sans nucléase	2μl
    2,5 X SYBR green	4 pl
    Amorce sens	1 pl
    Inverse Primer	1 pl
    Le volume total	8 pl

12. Pendant la préparation du mélange maître comprennent 1-2 réactions supplémentaires pour tenir compte des erreurs de pipetage.
13. Selon le modèle déjà conçu, ajouter 2 uL (20 ng / uL) de l'ADNc dans chaque puits. Ensuite, ajoutez 8 uL du mélange maître à chaque puits, résultant en un volume total de 10 ul par réaction.
14. Pipeter haut et en bas (2-3X) pour s'assurer que l'échantillon soit bien mélangé. Vérifiez qu'aucun liquide ne reste sur la pointe. Pour éviter la contamination croisée, utiliser un nouvel embout pour chaque échantillon.
15. Une fois la plaque entière est en place, recouvrir la plaque avec du ruban optique. Évitez de toucher la bande comme la présence de graisse peut affecter la lecture. Puis, centrifuger la plaque à 500 rpm pendant 1 minute pour s'assurer que tous les produits dans les puits sont au bas de la plaque.
16. Après la centrifugation, vérifier qu'il n'ya pas de glace ou d'eau sur le fond de la plaque. Enfin, placer la plaque dans la machine qRT-PCR et exécuter le programme de PCR.

V. représentation schématique de l'Expérience

Figure 1: Diagramme illustrant l'ordre séquentiel des étapes pour l'étude de l'expression génique.

Figure 2: A) des larves EAB dissection montrant l'intestin moyen dans le milieu. B) l'intestin moyen des larves de l'agrile du frêne isolées

Figure 3: A) Les valeurs moyennes d'expression relative (REV) pour un gène peritrophin (AP-PERI1) dans différents tissus larvaires dont la cuticule (Cu), l'intestin moyen (MG) ​​et corps gras (FB). Une EAB protéine spécifique du ribosome (ci-après nommées, AP-RP1) a été utilisé comme contrôle interne pour normaliser les données obtenues pour le gène d'intérêt, l'AP-PERI1. B) Variation relative pli de l'AP-PERI1 dans les tissus des larves. Le tissu cuticules montré la moindre expression, et donc a été prise comme calibrateur (1X) échantillon (Pfaffl, 2001).

Figure 4: A) Les valeurs moyennes d'expression relative (REV) pour un gène peritrophin (AP-PERI1) dans les différents stades de développement de l'agrile du frêne, y compris stades larvaires (1er, 2e, 3e et 4e), prénymphes (PP) et adultes (A). Une EAB protéine spécifique du ribosome (AP-RP1) a été utilisé comme contrôle interne pour normaliser les données obtenues pour le gène d'intérêt, l'AP-PERI1. B) Variation relative pli de l'AP-PERI1 dans divers stades de développement. L'échantillon PP a montré le niveau le moins du taux d'ARNm et donc a été prise comme calibrateur (1X échantillon).

VI. Conclusion

Quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) est un outil efficace pour diagnostiquer les niveaux d'ARNm dans les tissus des insectes et des stades de développement. En outre, qRT-PCR a surtout été le principal outil pour valider les données générées à partir des analyses d'expression génique à haut débit comme les puces et la nouvelle génération de l'ARN-Seq.

Discussion

Les cycles de seuil (Ct) valeur est obtenue pour chaque échantillon dans la plaque qRT-PCR. Pour faire la courbe standard, la valeur de Ct obtenues pour chaque dilution a été comploté contre le journal de sa concentration. Les valeurs de Ct pour les échantillons expérimentaux ont ensuite été reportées sur cette courbe standard de dilution en série. Quantités cibles ont été calculés à partir de différentes courbes standard généré pour chaque tissu soit expérimentation et d'expression du développement. Les valeurs d'expression relative (REV) ont ensuite été déterminée en divisant la quantité de la séquence cible d'intérêt (dans ce cas l'AP-PERI1) avec la quantité obtenue pour le contrôle interne (AP-RP1). Pour les calculs de signification, les journaux de l'REV pour chaque gène ont été analysés par ANOVA (analyse de variance) en utilisant la procédure PROC MIXED de SAS (SAS Institute Inc SAS / STAT User Guide, version 9.1). Importance du niveau d'expression a été déterminé à p <0,05. Variations des fois dans le cas de tissus ont été calculés en prenant l'échantillon cuticule comme le calibrateur (1X échantillon, Pfaffl, 2001). Par conséquent, les niveaux d'expression dans les organes de l'intestin moyen et de graisse ont été par rapport à la cuticule. Dans le cas de l'expression du développement, l'échantillon a été pris comme prépupal le calibrateur. Pour les deux études, deux et trois biologiques reproduit techniques réplicats ont été utilisés.

Notre expérience a révélé de manière significative (p <0,05) des niveaux supérieurs de l'AP-PERI1 transcription dans le tissu intestin moyen (Fig. 3) par rapport à d'autres tissus analysés. Au cours du développement des étapes d'alimentation (à savoir les stades larvaire et adulte) étaient significativement (p <0,05) plus élevé que l'échantillon prénymphes (fig. 4). Les niveaux d'ARNm au moins ont été calculés pour cuticule et prénymphes (fig. 3 & 4). Étant donné que peritrophins sont partie intégrante de l'intestin moyen des insectes de nos résultats corroborent les constatations antérieures autres espèces d'insectes (Mittapalli et al. 2007). Les tendances observées au cours des stades de développement confirment le rôle de l'AP-PER1 dans la digestion et les processus liés. La largement utilisé Bacillus thuringiensis (Bt) toxines dans les plantes cultivées en effet cibler et de perturber le PM chez les insectes (Pauchet et al., 2009). Par conséquent, les résultats obtenus dans cette étude pourraient ne révèlent pas seulement des objectifs de contrôle potentiel de l'agrile du frêne, mais aussi fournir des connaissances fondamentales sur la façon dont les espèces d'insectes à s'adapter à leur nouvel environnement.